转人HT基因在抗异种移植免疫排斥的研究

用脂质体转染方法将人类α1，2岩藻糖苷转移酶(HT基因)转入猪的血管内皮细胞中(PIEC)，经G418筛选两周获得具有抗性的克隆，增殖传代，当细胞达到一定数量时消化收集，流式细胞仪检测转染细胞的表达情况。结果显示HT基因的转染是有效的，明显地提高了H抗原的表达，同时降低了α—Gal的表达，在异种移植研究中抑制超急性排斥反应(HAR)和延迟性排斥反应(DXR)均起到一定的作用。     

人Endostatin cDNA的克隆及其在HT1080细胞中的表达

目的 :构建能表达人Endostatin的真核表达质粒。方法 :设计引物从成人肝cDNA文库中通过PCR扩增到EndostatincDNA ,并在 5′端融合编码人胰岛素信号肽序列 ,经测序证实后连接到真核表达载体pcDNA3.1(- )中。将携带基因的真核表达载体质粒pcDNA3.1(- ) SEND转染HT10 80细胞后用G4 18筛选获得克隆 ,采用RT PCR和West ern blot检测Endostatin的表达。结果 :测序结果表明克隆的人EndostatincDNA完全正确 ,并且在其 5′端融合编码人胰岛素信号肽序列 ;RT PCR显示转染后的HT10 80细胞可以有效地转录EndostatinmRNA ;Western blot检测到转染后的HT10 80细胞上清有相应的蛋白质 ,大小为 2 0kD左右。结论 :含有人胰岛素信号肽序列的人EndostatincDNA重组质粒pcDNA3.1(- ) SEND转染HT10 80细胞后可以有效的表达目的蛋白并能分泌到细胞外 ,本研究为Endostatin的功能研究及应用于基因治疗提供基础     

人类α-1,2-岩藻糖苷转移酶在猪血管内皮细胞的表达及作用

目的：探讨人类α-1，2-岩藻糖苷转移酶（HT）基因在猪血管内皮细胞（PIECs）的表达及意义。方法：将人HT基因重组质粒通过脂质体转染进猪血管内皮细胞，经G418筛选（500mg／L），用流式细胞仪检测HT的表达，表达阳性细胞与人血清共同孵育检测细胞的生存率。结果：流式细胞仪检测结果显示，未经转染HT基因的PIECS的H抗原表达率是13．80％，平均荧光强度很低是32．39，α-Gal表达率是99．98％，平均荧光强度是1347．09；转HT基因的PIECS其H抗原表达率是40．17％，平均荧光强度是143．66，α-Gal表达率是41．15％，平均荧光强度是158．72。转HT基因的细胞在人血清的作用下生存率明显高于未转染的细胞。结论：转染HT基因的PIECs明显提高了H抗原的表达。同时降低了α-Gal的表达．为转基因动物实验探讨克服异种移植超急性排斥反应（HAR）提供理论依据。     

乙酰胆碱受体四聚体前体α亚单位在人胚肾293细胞膜上的表达

[目的]将乙酰胆碱受体四聚体前体!亚单位重组质粒(pcDNA3.1-AchRα-BirA)转染至人胚肾293(HEK293)细胞,并在其细胞膜上获得稳定表达.[方法]提取重组质粒pcDNA3.1-AchRα-BirA,经限制性核酸内切酶Eco RⅤ单酶切后,行低熔点琼脂糖凝胶电泳检测.采用脂质体转染法,将pcDNA3.1-AchRα-BirA转染至HEK293细胞,经抗生素G418筛选后形成集落状抗性克隆细胞.将表达产物扩大培养,应用免疫荧光技术,以异硫氰酸荧光素标记,经荧光显微镜查看表达情况.[结果]电泳检查发现了大小约为6.964 kb的条带.转染后G418筛选获得抗性克隆细胞,经荧光显微镜观察到HEK293细胞膜上的绿色荧光.[结论]成功地将AchRα-BirA基因转染至HEK293细胞膜上且有表达,为下一步构建AchRα四聚体奠定了基础.     

重组肝细胞生长因子质粒的构建及其在成骨细胞中的表达

目的 构建人肝细胞生长因子(hHGF)真核表达质粒,探讨重组质粒对体外培养胎兔成骨细胞增殖分化的影响,为转基因治疗骨科疾病提供实验基础.方法 RT-PCR扩增人肝脏中hHGF全长cDNA片段,克隆入pcDNA3.1( )真核表达载体中,用脂质体法将pcDNA3.1( )-hHGF质粒转染成骨细胞,通过G418筛选获得阳性克隆,用免疫荧光染色检测hHGF基因在成骨细胞内的表达;MTT法和FCM检测pcDNA3.1( )-hHGF转染后对细胞增殖和细胞周期的影响;采用RT-PCR和ELISA方法检测hHGF在成骨细胞中的表达.NPP法检测碱性磷酸酶合成情况.结果 成功构建hHGF真核表达质粒,免疫组化和RT-PCR检测显示转染成骨细胞后细胞内hHGF mRNA呈现高水平表达;MTT法和FCM检测显示重组质粒转染后能促进成骨细胞的增殖,S期细胞比例增多;ELISA法检测到hHGF在细胞中有分泌性表达.转染重组质粒的成骨细胞合成碱性磷酸酶能力显著提高.结论 成骨细胞经基因转染后可以表达hHGF,外源性hHGF基因能够刺激成骨细胞增殖、分化及成骨活性.     

人Endostatin cDNA的克隆及其在HT1080细胞中的表达

目的：构建能表达人Endostatin的真核表达质粒。方法：设计引物从成人肝cDNA文库中通过PCR扩增到Endostatin cDNA，并在5′端融合编码人胰岛素领带肽序列，经测序证实后连接到真核表达载体pcDNA3.1(-)中，将携带基因的真核表达载体质粒pcDNA3.1(-)/SEND转染HT1080细胞后用G418筛选获得克隆，采用RT-PCR和West-em-blot检测Endostatin的表达。结果：测序结果表明克隆的人EndostatincDNA完全正确，并且在其5′端融合编码人胰岛素信号肽序列；RT-PCR显示转染后的HT1080细胞可以有效地转录EndostatinmRNA；Westem-blot检测到转染后的HT1080细胞上清有相应的蛋白质，大小为20kD左右。结论：含有人胰岛素信号肽序列的人EndostatincDNA重组质粒pcDNA3.1(-)/SEND转染HT1080细胞后可以有效的表达目的蛋白并能分泌到细胞外，本研究为Endostatin的功能研究及应用于基因治疗提供基础。     

重组人突变CD59真核表达质粒的构建和转染

目的获取人突变CD59基因（HM3）并构建HM3真核表达体系,转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO）,以获得稳定转染的细胞克隆.方法应用重组PCR定点诱变技术获得突变的CD59 DNA,进一步构建重组质粒pALTER-HM3;与pcDNA3共转染CHO细胞,转染细胞按一定比例稀释后加入G418压力筛选稳定转染细胞克隆,传代扩增培养并及时冻存备用.结果酶切及序列测定均证实成功构建了突变的pALTER-HM3重组质粒;转染细胞培养约2周后套取出G418抗性细胞克隆,获得生长较好的细胞.结论重组PCR定点诱变技术成功获得突变DNA,合适的细胞稀释有利于转染细胞克隆的筛选纯化.     

稳定表达结核分枝杆菌38抗原的EL-4细胞株的建立及鉴定

将结核分枝杆菌的38抗原基因片段经PCR方法扩增并插入到pcDNA3真核表达载体中，通过脂质体转染EL-4细胞，经G418筛选，用RT-PCR方法和ELISA方法检测整合和表达情况。结果成功地构建了pcDNA3—38抗原重组质粒，转染细胞中可检测到38抗原的存在，PCR扩增也证实38抗原基因已稳定整合于EL-4细胞的染色体中。本实验为今后在小鼠体内检测结核DNA疫苗激发的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应奠定了基础。     

甲状旁腺素受体真核表达载体的构建及稳定转染HEK293细胞系的建立

目的构建小鼠甲状旁腺素受体(PTHR)及其突变受体(DSEL)全长结构基因真核表达载体,建立稳定高表达PTHR及DSEL的HEK293细胞系,以应用于甲状旁腺素(PTH)模拟肽活性药物筛选及其信号通路的研究。方法通过双酶切、胶回收方法分别纯化目的片段(PTHR、DSEL基因)和质粒pcDNA3.1(+),二者分别由DNA限制性内切酶EcoRⅠ与NotⅠ双酶切,经T4DNA Ligase连接的方法将PTHR、DSEL基因克隆到质粒表达载体pcDNA3.1(+)中,采用测序方法及DNA限制性内切酶EcoRⅠ与NotⅠ双酶切方法鉴定重组质粒,脂质体转染法将重组体pcDNA3.1(+)-PTHR、pcDNA3.1(+)-DSEL及空质粒pcDNA3.1(+)分别转染至HEK293细胞,经G418筛选抗性细胞克隆,、RT-PCR及ELISA检测转染细胞PTHR、DSEL的表达情况。结果重组质粒经基因测序及DNA限制性内切酶EcoRⅠ与NotⅠ双酶切证实质粒表达载体pcDNA3.1(+)-PTHR、pcDNA3.1(+)-DSEL构建正确。重组体经脂质体法转染HEK293 48 h后,经G418筛选3周得到细胞抗性克隆,ELISA检测到PTHR、DSEL基因在重组质粒表达载体pcDNA3.1(+)-PTHR、pcDNA3.1(+)-DSEL转染的HEK293中成功表达。RT-PCR方法检测到PTHR、DSEL基因在转录水平的表达。ELISA方法检测到重组质粒转染的HEK293中,加入甲状旁腺激素刺激后,PLC、cAMP蛋白表达量远高于空质粒pcDNA3.1(+)转染的HEK293中PLC、cAMP的表达。结论成功构建了稳定高表达PTHR、DSEL的HEK293细胞,该稳定转染细胞系的建立为进一步研究甲状旁腺素受体下游信号通道的分子机制以及筛选其模拟肽作用的活性奠定了实验基础。     

幽门螺杆菌尿素通道蛋白ureI基因真核表达载体的构建及表达

目的构建幽门螺杆菌(H.pylori)尿素通道蛋白编码基因(ureI)的真核表达重组载体,并在HeLa细胞中表达,为核酸疫苗的研制奠定基础。方法以H.pyloriSS1株基因组为模板,PCR扩增ureI目的基因片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+)多克隆酶切位点中,构建重组载体pcDNA3.1(+)/ureI;通过酶切、PCR及测序鉴定,筛选阳性重组载体;脂质体法转染重组质粒入HeLa细胞,Western blot检测其在HeLa细胞中的表达。结果以H.pyloriSS1株基因组DNA为模板扩增出特异的ureI基因片段,大小约585 bp;双酶切及测序鉴定证明成功构建了H.pylori真核表达重组载体pcDNA3.1(+)/ureI;该重组质粒能够在HeLa细胞中表达目的蛋白。结论成功构建了真核重组载体pcDNA3.1(+)/ureI,并能在HeLa细胞中表达。     

重组人半乳糖苷结合凝集素-9质粒的构建及表达

目的构建人半乳糖苷结合凝集素-9(Galectin-9)的真核表达质粒pGalectin-9,并检测其表达。方法通过DNA重组技术和PCR方法从人外周血单个核细胞克隆Galectin-9基因,插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,通过PCR、酶切及测序鉴定重组载体的正确性;采用脂质体转染技术将重组质粒pGalectin-9瞬时转染中国仓鼠卵巢(Chinesehamster ovary,CHO)细胞,通过Western blot、RT-PCR和间接免疫荧光方法检测Galectin-9的表达。结果 DNA测序和酶切鉴定证明Galectin-9基因正确克隆至pcDNA3.1(+)的多克隆位点;以重组质粒pGalectin-9瞬时转染CHO细胞,通过Western blot、RT-PCR和间接免疫荧光方法,在分子和细胞水平证实Galectin-9的表达。结论成功构建pGa-lectin-9的重组质粒,并证实其在CHO细胞中可以成功表达。     

人胰岛素样生长因子-1基因的克隆、表达及生物活性分析

采用RT PCR方法 ,从人扁桃体组织中扩增得到人胰岛素样生长因子 1 (IGF 1 )cDNA ,利用基因重组技术将该基因片段重组于pcDNA3 .1 ( +)真核表达载体上 ,成功构建了 pcDNA/I重组表达载体。应用脂质体介导的基因转移技术将重组质粒体外转染至人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)。MTT法检测结果表明 :重组质粒转染能明显促进内皮细胞的分裂增生。将重组质粒通过脂质体介导 ,体外转染至人肾细胞 2 93细胞系进行表达 ,经G41 8筛选获得稳定表达的重组质粒细胞克隆 ,表达产物经鸡胚绒毛尿囊膜试验表明有促血管生成活性。此结果为研究IGF 1对血管内皮细胞作用的分子机制 ,以及利用IGF 1基因治疗肢体及冠状动脉缺血性疾病等的研究奠定了实验基础。     

结核分枝杆菌免疫优势抗原ESAT-6真核表达载体的构建及蛋白表达的鉴定

目的　克隆并表达结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶ESAT 6的编码基因 ,为研究其免疫功能奠定基础。方法　以结核分枝杆菌H37Rv株基因组为模板 ,用PCR对ESAT 6基因进行扩增 ,扩增产物克隆到真核表达载体pcDNA3 1/Zeo( )中。对重组表达载体pcDNA ESAT 6进行酶切、PCR及测序鉴定。经鉴定无误的重组质粒用DEAE 葡聚糖法转染COS 7细胞 4 8h后 ,用Trizol法提取转染细胞总RNA进行RT PCR鉴定。结果　重组质粒pcDNA ESAT 6构建成功 ,并能在COS 7细胞中有效表达。结论　结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶ESAT 6真核重组表达质粒pcDNA ESAT 6构建成功 ,为进一步研究ESAT 6和CFP 10的免疫原性、免疫保护性及其二者之间的相互作用奠定了基础     

人hepcidin真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立

目的 构建人hepcidin全长结构基因真核表达载体,建立稳定高表达hepcidin的HepG2细胞系,以应用于拮抗hepcidin从而增强铁吸收的活性药物筛选.方法 化学合成结合PCR拼接hepcidin 全长结构基因,插入原核表达载体pMD18-T中,测序正确后再经HindⅢ与EcoRⅠ双酶切,定向插入真核表达载体pcDNA3.0内,酶切鉴定后,采用脂质体转染法将重组质粒转染人HepG2细胞,G418选择抗性细胞克隆,ELISA检测转染细胞hepcidin的蛋白表达.结果 经酶切鉴定,成功构建hepcidin真核表达载体pcDNA3-hepcidin;重组质粒转染HepG2,经G418筛选3周获得抗性细胞克隆,其hepcidin蛋白表达量为普通HepG2细胞表达量的3倍.结论 成功构建了稳定高表达hepcidin的HepG2细胞,该稳定转染细胞系的建立为进一步研究hepcidin降低肠道铁吸收的分子机制以及筛选拮抗hepcidin作用的活性药物奠定了实验基础.     

表达人KIAA1173基因的鼻咽癌6-10B细胞模型的建立

目的建立表达人KIAA1173基因的鼻咽癌6-10B细胞模型,为探究人KIAA1173基因在鼻咽癌发病机制中的作用奠定实验基础。方法从新鲜肌肉组织中提取总RNA,采取逆转录PCR(RT-PCR)得到人KI-AA1173基因cDNA,纯化PCR产物,与真核表达载体pcDNA3.1( )连接,转化,铺板,筛选阳性克隆,酶切鉴定并进行序列测定。将重组质粒pcDNA3.1( )-KIAA1173和空载体利用阳离子脂质体介导转入鼻咽癌6-10B细胞,经G418筛选阳性克隆。用RT-PCR、原位杂交及免疫细胞化学方法检测KIAA1173基因在6-10B细胞中的稳定表达情况。以空白质粒转染组作为对照。结果重组质粒pcDNA3.1( )-KIAA1173经酶切和DNA测序分析显示与GenBank所公布的相应序列相符,插入方向正确,阅读框架完整。转染KIAA1173基因的6-10B细胞阳性克隆在mRNA和蛋白水平证实,转染细胞内有该基因高表达,表明细胞可表达人KIAA1173基因。结论成功获得了人KIAA1173基因全长cDNA的基因克隆,将该基因导入鼻咽癌6-10B细胞后,获得生物学活性稳定的KIAA1173基因高表达的细胞模型。     

沙眼衣原体蛋白激酶CT145的克隆及表达

目的 构建含沙眼衣原体(chlamydia trachomatis,Ct)基因CT145的真核重组表达质粒pcDNA4/CT703,并检测其在HeLa细胞中的表达.方法 利用PCR技术扩增全长CT145基因,并将其亚克隆到真核表达载体pcDNA4,双酶切和测序检测重组质粒正确性.将正确的重组质粒转染HeLa细胞,并用免...     

p62基因过表达慢病毒载体的构建及表达

目的 构建p62基因过表达慢病毒载体及其表达系统,并在人单核细胞白血病细胞(THP-1)中稳定表达,为在细胞水平研究p62基因的作用提供途径与方法。方法 采用聚合酶链式反应(PCR)扩增p62基因片段,将扩增产物连接至线性化pcDNA3.1-Flag-PCDH10真核表达慢病毒载体;PCR鉴定重组质粒,将构建成功的重组质粒和包装质粒共转染至人胚胎肾细胞293(HEK 293T);用重组慢病毒感染人单核细胞白血病(THP-1)细胞,氨苄霉素筛选阳性细胞克隆株;Western blot和实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测高表达p62基因的THP-1细胞株(过表达组)和转染不含p62基因空质粒(对照组)的THP-1细胞株;感染肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae,K.p.)后,RT-qPCR检测THP-1细胞中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β和趋化因子1(Cxcl1)表达水平。结果 通过PCR成功获得p62基因片段并连接到pcDNA3.1-Flag-PCDH10病毒载体上,并且PCR检测显示p62-pcDNA3.1-Flag-PCDH10重...     

重组人釉原蛋白真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的稳定表达

目的构建含人釉原蛋白(hAm)基因的重组真核表达质粒并转染哺乳动物细胞NIH3T3,建立稳定表达重组hAm的细胞株,为临床应用奠定基础。方法利用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ将hAm基因插入真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-)A,构建含hAm基因的重组质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-hAm,双酶切和测序鉴定。通过LipofectamineTM2000介导重组质粒转染NIH3T3细胞,利用G418筛选出阳性克隆,建立稳定表达人釉原蛋白的细胞株,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting验证蛋白表达。结果重组质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-hAm经双酶切和测序鉴定证实插入序列准确无误。重组质粒转染NIH3T3细胞后建立的稳定转染细胞株经SDS-PAGE电泳及Western blotting检测显示有相对分子质量为28 000的hAm表达,与预测一致。结论成功构建含hAm基因的重组真核表达系统,并获得稳定表达重组hAm的细胞株NIH3T3-hAm细胞株。     

pcDNA3.1/Cx43真核表达质粒的构建及其在人神经胶质瘤U251细胞中的稳定过表达

目的建立稳定过表达pcDNA3.1/连接蛋白43(Cx43)重组质粒的人神经胶质瘤U251细胞系。方法设计人Cx43的引物,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从低表达Cx43的U251细胞中扩增出目的片段,双酶切后定向连入pcDNA3.1载体,构建pcDNA3.1/Cx43真核表达质粒,经酶切、PCR、测序检测构建的正确性。采用脂质体转染法将重组质粒转入U251细胞,G418筛选出稳定转染的细胞系,采用RT-PCR、Western blot分别检测稳定转染pcDNA3.1/Cx43重组质粒的U251细胞中Cx43基因、蛋白的表达水平。结果酶切、PCR及测序表明pcDNA3.1/Cx43重组质粒构建成功,筛选获得稳定过表达Cx43的U251细胞。结论构建了pcDNA3.1/Cx43真核表达质粒及稳定过表达Cx43的U251细胞株,为下一步以Cx43为靶标进行人神经胶质瘤的基因治疗研究奠定了实验基础。     

GFP/HBV X融合蛋白重组载体的构建及稳定表达细胞系的建立

目的构建绿色荧光蛋白（GFP）与人乙型肝炎病毒（HBV）X基因的重组表达载体，建立稳定表达HBVX蛋白（HBx）与GFP融合蛋白的HepG2细胞系，以进一步研究HBx的生物学功能及其在肝癌发生中的作用。方法应用PCR法从adr亚型HBV质粒pHBVDNA中扩增HBVX基因片段，PCR产物经HindⅢ和KpnⅠ双酶切后定向插入绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1的相应酶切位点，转化宿主菌DH5α，采用上述双酶切及DNA测序鉴定重组质粒pGFP-HBx；采用脂质体转染法将pEGFP-C1质粒、pGFP-HBx重组质粒DNA转染人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞，G418选择抗性细胞克隆，荧光显微镜下观察GFP表达，挑取表达GFP的抗性克隆扩大培养、传代。采用RT-PCR检测转染细胞HBVX基因的表达。结果经酶切及测序鉴定成功构建了GFP-HBVX重组表达载体pGFP-HBx；将pEGFP-C1、pGFP-HBx重组质粒转染HepG2．，经G418筛选15d获得抗性细胞克隆。将带绿色荧光的抗性克隆细胞扩大培养并经传代70次，细胞仍表达强的荧光蛋白。RT-PCR检测表明转染pGFP-HBx重组体的HepG2／GFP-HBx细胞有HBVX转录、表达。结论成功构建了GFP．HBVX真核重组表达载体pGrP-HBx；获得了稳定表达GFP-HBx融合蛋白的HepG2细胞系，这为进一步研究FIBx的生物学功能以及HBx在肝癌发生中的作用与机制打下了基础。