利用重组人VEGF165制备单克隆抗体的研究

目的 :制备抗重组人血管内皮生长因子 (VEGF) 16 5单克隆抗体。方法 :构建人 VEGF16 5原核表达载体 p ET- 3a/ VEGF16 5 ,并使其在大肠杆菌中高效表达 ,纯化表达产物。用初步纯化的rh VEGF16 5免疫小鼠制成杂交瘤细胞 ,小鼠腹腔接种 ,收集腹水纯化后制成抗 rh VEGF16 5单克隆抗体。结果 :VEGF16 5诱导的内皮细胞增殖可被本研究制备的单克隆抗体中和 ,并表现出较好的剂量依赖关系。结论 :本研究利用 DNA重组技术制备人 VEGF16 5 ,并利用它进一步制备了抗重组人VEGF16 5单克隆抗体。     

VEGF165单克隆抗体对视网膜新生血管的抑制作用

目的:探讨有效阻断视网膜新生血管发生的方法.方法:对体外培养新生儿脐静脉血管内皮细胞进行血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)单克隆抗体、13-顺式维甲酸、INF-α、INF-γ 4种药物筛选实验.用倒置显微镜观察细胞生长状态;用MTT法测A560nm值,计算细胞增殖抑制率.结果:VEGF165单克隆抗体组浓度在2 000 mg*L-1时,对血管内皮细胞的增殖抑制率达91%.13-顺式维甲酸对细胞最高增殖抑制率是61%;IFN-γ浓度在2 000 mg*L-1时,对细胞增殖抑制率为56%.IFN-α浓度在2 000 mg*L-1时,细胞增殖抑制率均低于40%.结论:VEGF165单克隆抗体具有很强的抑制血管内皮细胞增殖的作用.     

重组人白细胞介素10单克隆抗体的制备

目的 制备重组人白细胞介素１０（ｒｈＩＬ－１０）单克隆抗体。方法 应用鼠－鼠 瘤技术建立分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系,ＥＬＩＳＡ检测朵交瘤细胞培养上清、腹水效价,双向免疫扩散试验进行亚类鉴定,Ｇｉｅｍｓａ染色镜下计数杂交瘤染色体数目。结果获得了２株能分泌抗ｒｈＩＬ－１０单克隆抗体的杂交瘤细胞系（１Ｄ３、２Ａ３）,无血清培养液效价为１：５１２、１：２５６,腹水效价１：１０＾４、１：１０＾４。ＵＪＦ     

VEGF165和VEGF165b与肿瘤关系的研究进展

目前已知肿瘤的生长和转移依赖于血管的形成,而血管形成主要是由促血管生成因子和抑制因子调控失衡,促血管生成因子增多所致.促血管生成因子中作用最强且研究最广泛的就是血管内皮生长因子(VEGF).VEGF根据VEGFmRNA剪接方式不同分为多个变构体,有VEGF121、VEGF145 、VEGF165 、VEGF183、VEGF189 和VEGF206,而VEGF165是体内最多的亚型,其生物活性最强且cDNA扩增丰度最高,故在临床和实验中应用最广.近年来又发现一种内源性剪接变构体,即VEGF165b,它因具有抑制VEGF165介导的血管生成作用[1]和潜在的临床应用价值而受到关注.作者就VEGF165和VEGF165b的结构、作用、作用机制以及与肿瘤的关系作一综述.……     

带信号肽人VEGF165 cDNA克隆

目的：克隆带信号肽人ＶＥＧＦ１６５ ｃＤＮＡ,以便进一步在真核系统表达人ＶＥＧＦ１６５蛋白或基因治疗。方法：设计引物;从人胎脑ｃＤＮＡ文加ＰＣＲ扩增目的基因;ＤＮＡ片段回收与酶切鉴定;与Ｍ１３ｍｐ１８重组;单链序列测定。结果：克隆片段与人ＶＥＧＦ１６５ｃＤＮＡ序列一致。结论：克隆ＤＮＡ片段为带信号肽人ＶＥＧＦ１６５ ｃＤＮＡ。     

抗重组人红细胞生成素单克隆抗体的制备与鉴定

目的 :获得能特异性识别人红细胞生成素 (hEPO)的单克隆抗体 (McAb)。方法 :用重组人红细胞生成素 (rHuEPO)作抗原免疫Balb/c小鼠 ,以细胞融合、酶联免疫吸附实验 (ELISA)筛选和克隆化技术获得抗hEPO的杂交瘤细胞株。用生物学方法鉴定杂交瘤细胞 ,用免疫学方法鉴定McAb的特异性。结果 :获得 3株稳定分泌抗hEPO McAb的杂交瘤细胞株 (1H7、4G11、1B4 )。培养上清的ELISA效价分别为 :1∶10 2 4、1∶5 12、1∶5 12 ;腹水效价为 :1× 10 7、1× 10 6、2× 10 4。阻断法表明 1H7识别的hEPO上的抗原决定簇和 4G11、1B4识别的不同。结论 :成功建立了 3株稳定分泌抗hEPO McAb的杂交瘤细胞株 ,它们分别识别hEPO上 2个不同的抗原位点 ,有望作为EPO定量检测的特异性抗体。     

反义VEGF165真核表达载体的构建和表达

目的 进行抗血管生成治疗人脑胶质瘤实验,构建和鉴定携带人反义VEGF165基因的真核表达载体。方法 将VEGF165cDNA反向克隆入pcDNA3,构建CMV启动子控制的真核表达载体pcDNA-AVEGF165,用酶切鉴定结果;应用该载体转染人脑胶质瘤细胞SHG44,G418筛选阳性克隆;Western blot和免疫组化检测转染前、后瘤细胞的VEGF表达。检测转染前、后瘤细胞的生物学性状。结果 获得反向构建的pcDNA-AVECF165真核表达载体,VEGF165反义RNA阻断了SHG44细胞的VEGF表达,该细胞生物学性状不受外源基因的表达影响。结论 成功构建的反义VEGF165真核表达载体,为人脑胶质瘤的反义基因治疗提供了必要的条件。     

抗人红细胞单克隆抗体的制备和鉴定

用O型人红细胞免疫的Balb/c小鼠脾细胞和NS--1骨髓瘤细胞融合、克隆后,获得两株杂交瘤细胞株。两株细胞分泌的单克隆抗体都是IgG_s亚类。文中对此类抗体的特性进行探讨。吸收试验表明,这两种单克隆抗体并不是和红细胞H抗原反应,但可能是同ABO各型红细胞上一种共同抗原反应。     

VEGF165基因转染真皮多能干细胞的实验研究

目的 为获得高表达生物活性血管内皮细胞生长因子VEGF165的皮肤种子细胞,拟将转基因治疗与真皮多能干细胞相结合,为难愈性创面的促愈治疗奠定基础.方法 构建真核表达载体pIRES2-EGFP-VEGF165,经脂质体法介导转染真皮多能干细胞;半定量RT-PCR检测VEGF165 mRNA的表达,Western blot和酶联免疫ELISA法检测VEGF蛋白的表达;并检测了表达产物的生物活性及转染VEGF(dermal multipotential stem cells,DMSCs)增殖活性的变化.结果 转染后VEGF165 mRNA和VEGF蛋白的表达均显著增强(P＜0.01),约为对照组的1.6倍,且转染VEGF后DMSCs的培养上清显著提高hECV304细胞增殖活性(P＜0.01).MTT结果显示转染VEGF后DMSCs增殖活性显著增高,约为转染空载体组DMSCs的2倍(P＜0.01).结论 成功获得了高水平表达并分泌具有生物活性的VEGF的基因治疗种子细胞DMSCs,为下一步动物在体进行基因治疗打下了基础.     

重组人L型丙酮酸激酶N末端单克隆抗体的制备与鉴定

目的 制备抗人L型丙酮酸激酶N末端(PK-N)的单克隆抗体并对其特异性进行鉴定.方法 以PK-N-GST-tag表达蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/O细胞融合,经多次筛选及克隆化,建立能稳定分泌抗PK-N单克隆抗体的杂交瘤细胞株.用ELISA、Western blot、免疫组化对此单克隆抗体特性进行鉴定.结果 筛选到两株能稳定分泌抗PK-N单克隆抗体的细胞株,亚类鉴定重链为IgGzb,轻链为kappa链.ELISA法测定腹水效价分别为1:409600和1:102400,抗体相对亲和力分别为3.54×108L/mol和2.72×108:L/mol.Western blot显示抗体能特异识别免疫原和人肝细胞株HL-7702中的天然丙酮酸激酶蛋白.免疫组化进一步显示了其在细胞及组织中的定位,均匀的分布于细胞的胞浆中.结论 成功制备了抗PK-N单克隆抗体.     

人VEGF基因昆虫杆状病毒表达载体的构建

为了在昆虫杆状病毒表达系统表达人血管内皮细胞生长因子 (VEGF)基因 ,用HindⅢ对 pcDNA3 .1 /VEGF进行酶切 ,回收 5 75bp的VEGF片段 ,与 pFastBacI载体连接 ,得到含VEGF基因的转座载体 pFast/VEGF ,NcoI酶切鉴定方向 ;将其转化到含有穿梭载体杆粒 (Bacmid)的DH1 0Bac感受态细胞 ,得到重组杆状病毒穿梭载体Bacmid/VEGF ,采用琼脂糖凝胶电泳、PCR扩增对重组转座载体、穿梭载体进行鉴定。将Bacmid/VEGF转染sf 9细胞 ,进行病毒重组及噬斑筛选。结果 :琼脂糖电泳得到杆粒 (Bacmid)DNA条带 ,PCR扩增得到 5 75bp的VEGF片段 ,病毒液在 1 0 - 7稀释度时出现噬斑 ,约 5 0个 /孔。说明已成功构建了重组杆状病毒穿梭载体并重组出杆状病毒。     

基因重组人睫状神经营养因子单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的　制备基因重组人睫状神经营养因子 (rhCNTF)单克隆抗体。方法利用rhCNTF免疫BALB/C小鼠 ,取其脾细胞与小鼠NS -1骨髓瘤细胞融合 ,制备 3株抗rhCNTF的单克隆抗体 ,分别命名为CA2 、CA6 和BB11。结果 3株抗体类型均为IgG2a,免疫印迹试验证明为特异性抗CNTF的单克隆抗体 ;抗体相加试验表明 3株单抗是针对CNTF两个不同的抗原决定簇。     

抗人TPO单克隆抗体的制备

制备抗人血小板生成素单克隆抗体，用于建立ＥＬＩＳＡ方法和检测ＴＰＯ的表达。用基因重组的ｈＴＰＯ免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，常规法做细胞融合，用ＥＬＩＳＡ法筛选出阳性杂交瘤细胞株。结果；获得一杂交瘤细胞株，其免疫球蛋白亚类为ＩｇＧ１和ＥＬＩＳＡ和免疫印迹技术证明，此单抗能特异识别ＴＰＯ。     

抗成长型肝炎病毒重组蛋白单克隆抗体的制备和初步应用

目的：制备抗-戊型肝炎病毒的单克隆抗体，并将其用于分析戊型肝炎病毒不同毒株结构蛋白的抗原表位。方法：采用来自墨西哥株（Mexican strain)的戊型肝炎病毒重组蛋白（p166Mex)免疫Balb/c小鼠，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，经酶联免疫吸附试验（ELISA）法筛选阳性克隆，并将获得的单克隆抗体与戊型肝炎病毒缅甸株（Burma strain)和美国株（USA strain)的重组蛋白（p166Bur,p166US)进行交叉反应测定。结果：最终获得4株能稳定分泌抗-p166Mex的杂交瘤细胞株。即D8G10,E5E12,D4A3,B7E6。其中D8G10，E5E12和B7E6细胞株的培养上清液，还能分别与p166Bur和p166US重组蛋白发生阳性反应。结论：利用已获得的抗-p166Mex单克隆抗体，初步确定3种不同的戊型肝炎病毒重组蛋白（p166Bur,p166US,p166Mex)含有一种共同的抗原表位。     

高效价抗人血红蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备高效价抗人血红蛋白(Hb)单克隆抗体并对其进行鉴定。方法用纯化人血红蛋白免疫Balb/c小鼠,取免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,筛选分泌抗人Hb单克隆抗体的细胞株,将阳性细胞株接种于小鼠腹腔制备单克隆抗体并对腹水抗体进行纯化,测定抗体亚类,分析其敏感性、特异性及纯化抗体的相对亲和力。结果共获得3株单克隆抗体杂交瘤细胞株,均与人Hb有较高的亲和力,其敏感性可达0.5μg/ml,而且与人肌红蛋白(Mb)及各种动物血红蛋白、肌红蛋白均无交叉反应。结论3株单克隆抗体杂交瘤细胞株有较好的特异性,与人Hb有较高的亲和力。     

抗人甲胎蛋白单克隆抗体的制备及其特性研究

本文采用亲和层析法纯化的甲胎蛋白（ＡＦＰ）抗原免疫的ＢＡＬＢ／ｃ鼠脾细胞与ＳＰ２／０小鼠骨髓瘤细胞系融合，获三株分泌抗人ＡＦＰ单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的杂交瘤细胞系。用ＥＬＩＳＡ阻断试验和夹心ＥＬＩＳＡ试验作特异性鉴定，杂交瘤细胞株染色体的众数为１０４条，三株细胞系ＭｃＡｂ均属小鼠ＩｇＧ１型。经体外连续传代３个月及冻存一年复苏后均能持续分泌抗ＡＦＰ抗体。     

基因重组人粒细胞集落细胞刺激因子单克隆抗体的制备及特性

采用高效免疫方法，利用ｒｈＧ－ＣＳＦ免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，经过两次融合制备了３株抗ｒｈＧ－ＣＳＦ的单克隆抗体，分别命名为１Ｈ１１、２Ｂ３，３Ｃ３；抗体类型均为ＩｇＧ２ａ，，免疫印迹试验证明为特异性抗Ｇ－ＣＳＦ的单克隆抗体，单抗加试验和单抗竞争试验表明３株单抗针对Ｇ－ＣＳＦ两具不同的抗原决定簇；中和试验表明２Ｂ、２Ｃ３识别的位点与Ｇ－ＣＳＦ刺激ＮＦＳ－６０细胞增殖活性有关。     

抗蓝载体单克隆抗体的制备及特性鉴定

目的制备抗蓝载体(blue carrier,BC)单克隆抗体(mAb),为相关研究提供支持与工具。方法用人工合成肽与蓝载体交联后免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与NS-1融合制备杂交瘤,经筛选和3次克隆化,从制备的腹水中纯化单克隆抗体。用ELISA以及Dot-ELISA方法鉴定单克隆抗体的特性(效价、Ig亚类、特异性以及亲和力)。结果筛选到1株可稳定分泌抗蓝载体单克隆抗体的杂交瘤细胞5B5,腹水效价2×10-6,单抗亚类为IgG1,抗体亲和力为7.8×108。Dot-ELISA结果显示,在相同条件下5B5mAb只与蓝载体特异性结合,与钥孔戚血蓝素(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵清白蛋白(OVA)等载体蛋白不发生交叉反应。结论获得1株能特异性识别蓝载体蛋白的mAb,为评价短肽及半抗原交联免疫效果、某些疾病诊断及治疗方法疗效提供了工具。