基于流式细胞术和K-mer分析的黄芪基因组大小估测

目的使用流式细胞术与K-mer分析估测黄芪基因组的大小及复杂程度,为黄芪基因组测序奠定基础。方法以番茄为内标,用流式细胞仪测定经碘化丙啶(PI)染色的番茄细胞核和黄芪细胞核混合样品的PI荧光强度,通过比较黄芪与番茄细胞DNA含量峰值的倍数关系,计算黄芪的基因组大小。采用高通量测序技术进行黄芪基因组调查测序,利用生物信息学方法估计黄芪杂合率、重复序列和GC含量等信息。结果采用流式细胞术测得黄芪基因组大小约为1 426 Mb。通过基因组调查测序,获得了95 Gb黄芪基因组DNA测序数据,K-mer分析表明黄芪基因组约为1 456 Mb,测序深度为39×。K-mer分布曲线有明显的杂合峰,基因组杂合率为2.1%。结论黄芪基因组大小为1.45 Gb左右,杂合率较高。这一结果可为黄芪基因组学研究提供参考。     

基于流式细胞术和K-mer分析的苦豆子基因组大小估测

目的 采用流式细胞术与K-mer分析方法对苦豆子基因组大小及杂合率进行估测,为其全基因组测序提供参考。方法 以大豆为内标,通过流式细胞仪检测大豆与苦豆子细胞DNA含量的倍数关系,计算苦豆子的基因组大小。采用二代测序技术进行苦豆子基因组调查测序,使用K-mer分析估测苦豆子基因组大小与杂合率。结果 采用流式细胞术测得苦豆子基因组大小约为1 749 Mb。K-mer分析结果表明,苦豆子基因组大小约为1 648 Mb,基因组杂合率为1.12%,杂合率较高。结论 苦豆子基因组大小约为1.7 Gb,杂合率较高,后续研究可采用三代PacBio进行80~100 X深度的测序开展全基因组测序研究。     

基于流式细胞术和基因组survey分析的地黄基因组研究

目的地黄Rehmannia glutinosa是我国传统中药,具有较高的药用价值和经济价值。利用流式细胞技术和高通量测序技术,分析了地黄基因组大小和特征等信息,为绘制地黄全基因组精细图谱提供依据。方法将已知基因组大小的大豆Glycine max和辣椒Capsicum annuum作为对照,用流式细胞技术估算地黄基因组大小。然后利用高通量测序技术对地黄基因组进行survey分析,通过生物信息学分析获得了地黄全基因组重复序列比例、基因组杂合度以及GC含量等信息。结果根据流式细胞实验结果,地黄基因组大小介于大豆和辣椒之间,估算地黄基因组大小应在2.00~2.12 Gb。通过高通量测序,获得了132.79 Gb高质量的数据,总测序深度约为66.40×,估算地黄基因组大小为2.03 Gb。根据Kmer分布情况,估算地黄基因组重复序列比例为78.48%,杂合度为1.93%,GC含量为37.27%。从基因组基本结构特征上看,地黄基因组属于高重复、高杂合、大基因组的复杂基因组。结论获得了地黄基因组大小和特征等信息,这些信息将为绘制地黄全基因组的精细图谱奠定基础,也为阐明地黄有效成分的生物合成和调控途径提供依据。     

基于流式细胞术的华细辛基因组C值测定

目的建立华细辛Asarum sieboldii Miq.基因组C值的流式细胞术测定方法,估测华细辛基因组大小。方法对8种常用的细胞核解离液进行筛选,根据筛选结果,采用OTTO细胞核解离液,以华细辛幼嫩叶片为材料,以本氏烟草Nicotiana benthamiana Karel Domin为内参植物,运用流式细胞术对华细辛基因组C值进行了测定。结果华细辛基因组C值为(5.197±0.157)pg,估测华细辛基因组大小为5.083 Gb。结论该研究建立了流式细胞术测定华细辛基因组C值的方法,所得数据可为华细辛基因组学和进化生物学研究提供有益的参考。     

药用黄芪基因组大小的研究

黄芪是一种著名的传统中药材,其包括蒙古黄芪和膜荚黄芪,本研究旨在检测蒙古黄芪、膜荚黄芪的基因组大小。实验选取蒙古黄芪和膜荚黄芪的新鲜叶子为实验材料,大豆品种William 82为标准植株,用LB01裂解液处理叶子,应用流式细胞仪测定蒙古黄芪、膜荚黄芪、William 82样品的PI发射的荧光强度,分别比较蒙古黄芪、膜荚黄芪峰与William 82的荧光强度均值的倍数关系,进而分别计算出蒙古黄芪的基因组大小约为1.46 Gb,膜荚黄芪的基因组大小约为1.52 Gb。本研究探索了流式细胞术测定黄芪基因组大小的方法,并发现膜荚黄芪的基因组大小大于蒙古黄芪的基因组大小,从基因组的角度进一步揭示了蒙古黄芪和膜荚黄芪在生物学上的差异,该研究也将有助于黄芪属植物确定合理的全基因组测序策略。     

三岛柴胡基因组Survey分析及SSR位点挖掘

柴胡是我国传统中药材,主要用于治疗感冒及保肝护肝等。三岛柴胡是日本栽培品种,在我国和韩国等国家地区亦有种植。在大规模全基因组深度测序之前,需要进行低覆盖度的基因组Survey测序,以评价基因组的大小及复杂程度,确定适合该植物全基因组测序研究策略。该研究采用二代高通量测序技术(Illumina Hiseq 2000)进行了三岛柴胡的Survey测序分析,并对所获得基因组序列进行了SSR分析,利用Primer 3设计SSR特异引物并随机选择33对引物以三岛柴胡DNA为模板,进行PCR扩增,对PCR体系以及最佳退火温度进行筛选。共获得了288. 64 G基因组数据,估计基因组大小为2 119. 58Mb,测得基因组数据深度为138×,杂合率为1. 84%,重复序列比例为83. 89%,推测三岛柴胡基因组属于复杂基因组。采用K-mer=41初步组装,得到contig N50 224 bp,总长896. 97 Mb,scaffold N50 313 bp,总长922. 67 Mb。三岛柴胡基因组序列数据中,共检测到91 377条SSR序列,分布于70 809条独立基因。主要类型为二核苷酸重复,存在49 680条,占比70. 16%。在合成的33对引物中,有21对引物成功扩增出目标条带。研究结果为后续大规模基因组测序、开发鉴定柴胡种质和性状定位的SSR分子标记奠定了基础。     

连翘基因组大小的流式细胞仪测定

目的采用流式细胞术测定连翘的基因组大小。方法摘取连翘新鲜嫩叶,以大豆品种William 82为内标,用GPB裂解液提取细胞核悬液,依次经过RNase和PI处理后,上流式细胞仪检测。结果变异系数均小于5%,表明数据可信,进而分析出连翘基因组大小约为0.74Gb。结论该研究探索了流式细胞术测定连翘基因组大小的方法,同时明确了连翘的基因组大小。     

基于Illumina高通量测序技术的草豆蔻基因组研究

目的对药食同源植物草豆蔻Alpinia katsumadai进行基因组调研分析,完善草豆蔻基因组遗传信息。方法研究采用Illumina高通量测序技术,基于K-mer分析手段来研究草豆蔻基因组的大小及杂合度,利用MISA方法分析可能的SSR分子标记。结果草豆蔻的基因组大小为1.60 Gb,基因组杂合度为0.44%,重复序列比例为72.72%;在基因组序列中,进行SSR分子标记分析,共鉴定出了364 395个SSR,其中,单、双、三核苷酸重复模体的比例较高,分别占比64.25%、24.05%、10.31%;从测序得到的350 bp文库中,随机取10 000条单端reads,与NT库进行BLAST比对,发现草豆蔻的近缘物种艳山姜Alpinia zerumbet和小豆蔻Elettaria cardamomum上的reads数分别占比对上NT库reads数的12.89%和12.36%。结论通过对草豆蔻植物的基因组大小、杂合度调查及SSR分子标记分析表明,草豆蔻物种基因组属于高重复、大基因组的复杂基因组,这为草豆蔻的资源保护和遗传多样性分析及品种选育提供了遗传信息支撑。     

凉粉草不同种质的染色体倍性与基因组大小研究

目的:建立凉粉草基于流式细胞术的染色体倍性鉴定技术与基因组大小检测方法。方法:以收集的36份凉粉草栽培种质及1份野生种质为材料,采用流式细胞术估测凉粉草基因组大小,并以二倍体为对照,计算凉粉草染色体倍性。结果:内参与待测样品峰值能完全分开,无重叠峰,峰形清晰集中,可对凉粉草基因组大小进行有效估测。鉴定凉粉草供试材料中12份为二倍体,基因组大小为1.14～1.35 Gb;20份为三倍体,基因组大小为1.74～2.01 Gb;5份为四倍体,基因组大小为2.42～2.47 Gb。结论:成功建立了凉粉草基于流式细胞术的染色体倍性鉴定技术与基因组大小检测方法,凉粉草不同种质倍性水平丰富,不同凉粉草种质的倍性水平与其性状具有显著相关性。     

流式细胞法测定茅苍术基因组大小

目的:建立流式细胞术测定茅苍术基因大小的方法,并进一步比较5种类型茅苍术的基因组大小变异情况。方法:以茅苍术幼叶为材料,采用改良Otto两步法提取细胞核,用已知基因组大小的玉米和蚕豆为内标,将处理好的样品上流式细胞仪测定。结果:通过改进实验方法,以蚕豆为内标,建立了流式细胞术测定茅苍术基因组大小的方法。5种类型茅苍术基因组大小的测定结果表明,尖叶类型基因组最大,扁茎类型最小,裂叶类型的基因组大小稍有下降。结论:本研究为茅苍术基因组大小研究提供了方法和数据参考,也将为茅苍术群体变异、种质资源评价和新品种选育等研究提供基础。     

基于流式细胞分析技术的茯苓基因组大小测定

目的：茯苓是担子菌多孔菌科的著名传统中药。本研究的目的在于测定茯苓的基因组大小并考察了其倍性与基因组的关系。方法：真菌材料的前处理参考文献报道[1],并用DNA特异性染料碘化丙啶进行染色,通过调节离心转速、染色时间等条件对样品进行核分离的优化。DNA含量用流式细胞仪进行分析,通过比较茯苓与内参黑曲霉G0/G1期峰比值计算得出。结果：茯苓的基因组大小测定为55.79±3.03Mb,或相对DNA含量为0.12±0.01pg（1pgDNA=0.965×109bp）。在结果中可以检测出黑曲霉和茯苓的G2/M期峰。结论：本研究探索了用流式细胞仪分析茯苓基因组大小的方法,所得数据可为基因组学研究提供了参考。     

利用多重等位基因特异PCR鉴别人参、西洋参

目的：查找并发现参类药材的SNP位点,利用多重等位基因特异PCR同时鉴别人参、西洋参。方法：查找GenBank上已收载的参类药材序列,进行比对分析,根据人参、西洋参的SNP位点设计引物,对PCR反应体系进行优选。在此基础上,对20个不同来源的人参、西洋参样品进行PCR扩增,根据各自的特异条带进行鉴别。结果：当退火温度为66 ℃时,出现249 bp条带的为人参,1 049 bp条带的为西洋参。该鉴别反应特异性高、重复性好,能在同一反应中准确鉴别人参、西洋参。结论：多重等位基因特异PCR能成功地对人参、西洋参进行鉴别,在中药材分子鉴定中具有推广应用价值。     

刺果甘草全基因组Survey及叶绿体基因组特征分析＊

目的 基于基因组Survey分析对刺果甘草Glycyrrhiza pallidiflora Maxim.基因组大小和杂合率进行估计，并通过叶绿体基因组序列特征对其在甘草属Glycyrrhiza L.中的系统发育位置进行研究。方法 使用二代测序技术对刺果甘草进行测序，采用K-mer方法对测序reads进行分析，估算刺果甘草基因组大小和杂合率，使用生物信息学方法进行叶绿体基因组组装、注释和系统发育分析。结果 Survey分析结果显示其基因组大小约为577.82 Mb，杂合度约为0.31%，重复序列比例约为53.72%。叶绿体基因组长度为127，267 bp，不具有典型的四分体结构，总GC含量为34.32%，包含110个基因，其中76个蛋白质编码基因，30个tRNA基因和4个rRNA基因。系统发育分析表明，刺果甘草与圆果甘草G. squamulosa Franch.亲缘较接近。结论 刺果甘草存在低杂合和重复序列较多的特点，为了更好地对全基因组进行序列拼接和组装，可尝试采用三代测序结合二代测序的分析策略进行基因组组装；刺果甘草叶绿体全基因组比对和系统发育分析，为后续开展甘草属遗传多样性研究和分子鉴定标记筛选提供了重要依据。     

人参根外泌体的提取、表征及其对多柔比星诱导的心肌损伤保护作用机制

目的研究人参Panax ginseng根外泌体提取、表征及其体外心肌保护活性。方法采用差速离心法与蔗糖梯度离心法提取人参根外泌体;通过透射电子显微镜(TEM)和纳米颗粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)技术对外泌体进行鉴定;采用液相色谱-质谱联用(LC-MS)法对人参根外泌体进行蛋白质组学分析;通过SmallRNA测序分析人参根外泌体中SmallRNA种类;建立H9C2心肌细胞损伤模型,利用CCK-8法检测细胞活力;以最刘质量浓度的人参根外泌体处理H9C2细胞,应用Hoechst染色和JC-1染色考察细胞凋亡率;蛋白质免疫印迹法检测细胞凋亡相关蛋白。结果 TEM图中清晰可见人参根外泌体呈茶托状的双层膜结构;NTA粒径分析检测到112.7nm的人参根外泌体占总人参根外泌体的92.7%;蛋白组学分析鉴定到5585个蛋白;SmallRNA测序鉴定到miRNA、tRNA、snRNA、rRNA、snoRNA 5种SmallRNA;体外实验结果显示,与对照组相比,模型组细胞活力下降,人参根外泌体给药组呈剂量依赖性地使细胞活力升高,细胞凋亡率降低;Western blotting结果显示凋亡相关蛋白Bcl-2蛋白水平下降;Bax、Cyt C的蛋白水平升高。结论首次报道了人参根外泌体的提取工艺及表征,并发现人参根外泌体对多柔比星诱导的心肌损伤具有一定的保护作用。