小檗碱对高糖培养足细胞黏附功能的影响及机制研究

目的观察小檗碱对高糖培养足细胞黏附功能的影响,并探讨其改善高糖所致足细胞损伤的作用途径和分子机制。方法采用温度选择法体外进行永生化小鼠足细胞株的分化培养、诱导成熟,分为正常糖对照组(5 mmol/L葡萄糖)、高糖模型组(30 mmol/L葡萄糖)、甘露醇高渗对照组(30 mmol/L甘露醇)、高糖+小檗碱治疗组(30 mmol/L葡萄糖+1.25μmol/L小檗碱)。干预24 h、48 h、72 h后收集细胞,采用MTT法检测足细胞活力,离心法检测细胞黏附力,并采用Q-PCR法检测黏附分子α3、β1的mRNA表达水平。结果与正常糖对照组和甘露醇高渗对照组比较,高糖模型组在3个时间点的足细胞活力、黏附力和α3、β1的mRNA表达水平都明显下降(P0.01),且随着作用时间的延长足细胞活力和黏附力降低越明显,黏附分子α3、β1的mRNA表达水平越低下(P0.05);与高糖模型组比较,高糖+小檗碱治疗组的足细胞活力和黏附力明显增强(P0.01),黏附分子α3、β1的mRNA表达水平明显升高,差异有统计学意义(P0.01)。结论高浓度葡萄糖环境可降低足细胞活力和黏附力,改变足细胞黏附分子的mRNA表达水平;小檗碱可抑制和减轻高浓度葡萄糖对足细胞的损伤作用,可提升高浓度葡萄糖培养的足细胞的细胞活力和黏附力,对高浓度葡萄糖培养的足细胞具有明显的保护作用。     

左归降糖益肾方对2型糖尿病肾病小鼠足细胞nephrin与podocin表达的影响

目的观察左归降糖益肾方对MKR转基因2型糖尿病肾病(DN)小鼠足细胞nephrin、podocin表达的影响,探讨其作用机制。方法 8周龄MKR小鼠40只随机分为4组,空白组(A组)、DN组(B组)、DN+中药组(C组)、DN+糖适平+贝那普利组(D组)。B、C、D组给予高脂饮食联合右侧肾切除造模。手术4周后,各给药组给予相应药物,4周后处死小鼠。电化学法观察小鼠空腹血糖,全自动生化仪检测血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN),ELISA法测定尿微量白蛋白(UmAlb),RT-PCR法检测nephrin、podocin mRNA表达,Western Blotting法测定nephrin、podocin蛋白表达,电镜观测足细胞形态结构。结果与A组比较,B组小鼠空腹血糖、SCr、BUN及UmAlb均明显升高(P0.01),肾小球足细胞nephrin、podocin mRNA及蛋白表达明显下调(P0.01)。给药后,与B组比较,用药组小鼠血糖、SCr、BUN及UmAlb明显下降(P0.01),肾小球足细胞nephrin、podocin mRNA及蛋白表达明显上调(P0.01,P0.05)。电镜结果显示,给药组小鼠肾小球足细胞较B组明显改善。结论左归降糖益肾方通过恢复2型糖尿病肾病小鼠足细胞nephrin和podocin的表达而保护肾脏。     

小檗碱通过下调miR-1290缓解高糖诱导的足细胞损伤研究

目的探究小檗碱对高糖诱导的足细胞损伤的影响及其对miR-1290的调控作用。方法采用高糖诱导小鼠肾足细胞MPC5建立细胞损伤模型,给予不同浓度(1.0、2.5、5.0μmol/L)小檗碱进行干预,采用流式细胞术检测细胞凋亡情况;采用Western blotting法检测细胞B淋巴细胞瘤2(B-cell lymphoma 2,Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)蛋白表达情况;采用ELISA法检测细胞上清液中白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-1β、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平;采用qRT-PCR法检测miR-1290 mRNA表达情况。将阴性对照(mi R-NC)和mi R-1290模拟物(miR-1290mimics)分别转染至MPC5细胞,给予5μmol/L小檗碱进行干预,考察miR-1290对小檗碱抑制高糖诱导的细胞凋亡及炎性因子分泌的影响。结果与对照组比较,模型组细胞凋亡率显著升高(P0.05),Bcl-2蛋白表达水平显著降低(P0.05),Bax蛋白表达水平显著升高(P0.05),上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平显著升高(P0.05),miR-1290mRNA表达水平显著升高(P0.05)。与模型组比较,小檗碱组细胞凋亡率显著降低(P0.05),Bcl-2蛋白表达水平显著升高(P0.05),Bax蛋白表达水平显著降低(P0.05),上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平显著降低(P0.05),miR-1290mRNA表达水平显著降低(P0.05)。与小檗碱+miR-NC组比较,小檗碱+miR-1290 mimics组细胞凋亡率显著升高(P0.05),Bcl-2蛋白表达水平显著降低(P0.05),Bax蛋白表达水平显著升高(P0.05),上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平显著升高(P0.05)。结论小檗碱能够通过下调mi R-1290表达抑制高糖诱导的足细胞凋亡及炎性反应,从而减轻细胞损伤。     

高糖对小鼠足细胞黏附功能的影响及黄芪多糖的干预作用

目的观察高糖对体外培养足细胞的黏附功能及黏附分子的影响,以及中药组分黄芪多糖改善这种损伤的效果。方法采用永生化小鼠足细胞株,通过温度选择的培养方法诱导足细胞分化,分为正常糖对照组（NG）（5mmol/L）、甘露醇高渗对照组（MA）、高糖组（HG）（30μmol/L）、高糖＋黄芪多糖组（APS）（0.2g/L）,干预3、6、12、24h后收集细胞,分别用荧光定量法和物理离心法检测足细胞黏附功能;干预6、12h后,应用实时定量PCR法及Western印迹法分别检测足细胞α3、β1整合素mRNA和蛋白表达水平。结果作用6、12h后,HG组α3、β1整合素mRNA及蛋白表达水平较NG组下降,差异有统计学意义,而给予黄芪多糖后,其下降不明显。结论高糖可明显抑制足细胞的黏附功能,黄芪多糖对高糖诱导的足细胞损伤有改善作用。     

小檗碱对波动性高糖诱导的人冠状动脉内皮细胞凋亡的影响

目的研究小檗碱对波动性高糖所致人冠状动脉内皮细胞(HCAECs)凋亡的影响。方法分离、鉴定并培养HCAECs,将HCAECs分为5组:正常葡萄糖组(5.5 mmol/L葡萄糖)、持续性高糖组(25 mmol/L葡萄糖)、波动性高糖组(5.5、25 mmol/L葡萄糖每24小时波动1次)、波动性高渗环境(不加入葡萄糖,加入与波动性高糖组相同浓度的甘露醇,保持与波动性高糖组相同的波动性高渗环境)、波动性高糖+小檗碱干预组(5.5、25mmol/L葡萄糖+50μmol/L小檗碱每24小时波动1次),各组细胞每24小时换液1次,共培养7 d后进行后期实验。检测各组HCAECs的细胞活力及凋亡情况,利用实时荧光定量(q RT-PCR)及Western blotting技术检测细胞凋亡相关蛋白Caspase-3表达量。结果与持续性高糖组相比,波动性高糖组HCAECs凋亡更显著(P0.05),波动性高糖组Caspase-3蛋白及m RNA表达水平明显增加(P0.05);但波动性高糖+小檗碱干预组较波动性高糖组HCAECs凋亡明显减弱(P0.05),小檗碱可以明显下调波动性高糖诱导的Caspase-3表达(P0.05)。结论波动性高糖较持续性高糖更易降低HCAECs活力,促进HCAECs凋亡,但小檗碱显著减弱波动性高糖环境下HCAECs凋亡,对HCAECs具有明显的保护作用。     

绞股蓝总皂苷对高糖培养条件下小鼠足细胞nephrin、VEGF mRNA表达的影响

目的:观察绞股蓝总皂苷对高糖培养条件下小鼠永生足细胞nephrin、VEGF(vascular endothelial growth factor,血管内皮生长因子)mRNA表达的影响。方法:利用体外培养条件性永生小鼠足细胞,高糖干预24小时,模拟糖尿病肾病足细胞损伤,分为正常组、高糖模型组、高渗对照组、绞股蓝治疗组(绞股蓝总皂苷高、中、低剂量组)及缬沙坦对照组,Real Time PCR法检测足细胞nephrin、VEGF mRNA的表达。结果:绞股蓝总皂苷干预组nephrin mRNA含量显著升高,VEGF mRNA表达有一定程度提高,与模型对照组比较,差异有显著统计学意义(P0.05或P0.01)。结论:绞股蓝总皂苷可有效调节肾脏足细胞nephrin、VEGF mRNA表达。     

白藜芦醇对高糖诱导足细胞损伤的改善作用及机制探讨

[目的]观察白藜芦醇(RSV)对高糖诱导足细胞凋亡的影响及作用机制。[方法]采用体外高糖诱导作为足细胞损伤模型,细胞分为3组:对照组为5 mmol/L低糖培养液(LG);模型组为30 mmol/L高糖培养液(HG);RSV干预组:HG+5μmol/L RSV;HG+10μmol/L RSV,培养48 h后采用流式细胞术检测足细胞的凋亡情况;DHE探针观察细胞内活性氧自由基(ROS)生成;激光共聚焦检测线粒体膜电位及线粒体内ROS合成;Western blot检测线粒体凋亡途径相关蛋白含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)3、caspase 9的表达情况。[结果]与HG组相比,RSV可呈剂量依赖性的抑制高糖诱导的足细胞凋亡;荧光探针结果显示,RSV干预后细胞内及线粒体ROS生成明显低于HG组;JC-1染色显示,与HG组相比,RSV干预可显著提高线粒体膜电位;Western blot结果显示,随RSV干预浓度的提高,caspase 3、caspase 9表达水平明显下调,差异具有统计学意义(P0.05)。[结论]RSV呈浓度依赖性的抑制高糖诱导的足细胞凋亡,其保护作用可能与抑制氧化应激,改善线粒体功能障碍相关。     

基于活性氧簇-自噬通路调控的加味黄芪赤风汤对肾小球足细胞的保护机制研究

目的观察加味黄芪赤风汤基于活性氧簇(ROS)-自噬通路对AngⅡ诱导肾小球足细胞损伤的保护机制。方法制备低、中、高剂量加味黄芪赤风汤(分别应用生药浓度为0.57、1.15、2.29 g/mL的加味黄芪赤风汤灌胃小鼠)含药血清及替米沙坦(0.83 mg/mL灌胃小鼠)含药血清,采用AngⅡ(1×10~(-7)mol/L)诱导足细胞损伤模型,分为空白组,模型组,加味黄芪赤风汤低、中、高剂量组以及替米沙坦组;为验证自噬与模型的关系,设置3MA与氯喹组。采用Western Blot检测足细胞损伤相关蛋白nephrin、podocin及自噬相关蛋白LC3、Beclin-1、P62表达,溶酶体荧光探针检测自噬流活性,透射电镜观察足细胞内自噬体的形成,流式细胞仪检测细胞内ROS平均荧光强度(MFI)。结果与空白组比较,模型组足细胞nephrin、podocin、P62表达下调(P0.01),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1表达上调(P0.01),ROS的MFI增强(P0.01)。透射电镜及溶酶体荧光探针结果显示模型组自噬体数量增多,溶酶体表达增强。与模型组比较,加味黄芪赤风汤中、高剂量组及替米沙坦组nephrin、podocin、P62表达上调(P0.01,P0.05),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1表达下调(P0.01,P0.05);3MA及氯喹组足细胞nephrin、podocin表达下调(P0.01,P0.05);加味黄芪赤风汤低剂量组Beclin-1表达下调(P0.05);各给药组ROS MFI减弱(P0.01,P0.05)。透射电镜及溶酶体荧光探针结果显示加味黄芪赤风汤组及替米沙坦组自噬体数量减少,溶酶体表达减弱。结论 AngⅡ通过下调nephrin、podocin表达损伤足细胞;加味黄芪赤风汤可上调AngⅡ诱导的nephrin、podocin表达,缓解足细胞损伤;加味黄芪赤风汤可能基于ROS-自噬通路,下调AngⅡ诱导的自噬流,拮抗肾小球足细胞损伤。     

固本化瘀通络合剂含药血清对高糖诱导的足细胞损伤影响及机制研究

目的:观察固本化瘀通络合剂含药血清对高糖所致足细胞损伤的影响,并探讨其机制。方法:取对数生长期的足细胞种植于细胞培养板中,随机分为对照组、高糖组、中药组(高糖和固本化瘀通络合剂含药血清共培养)。分别用CFSE/PI染色检测细胞的生存率,流式细胞术(Annexin V-FITC/PI双标染色法)检测细胞的凋亡水平,RT-PCR和Western Blotting法检测足突标志物nephrin的mRNA和蛋白表达水平。结果:24 h时,各组足细胞的凋亡率和存活率无显著差异;48 h和72 h时,与对照组相比,高糖组足细胞凋亡率增高,生存率明显降低;与高糖组相比,中药组足细胞凋亡率降低,生存率明显提高。RT-PCR和Western Blotting检测:在各个时间点,高糖组足细胞nephrin mRNA及蛋白表达量与对照组相比,均明显下降;与高糖组相比,中药组足细胞nephrin mRNA及蛋白表达量明显升高。结论:固本化瘀通络合剂含药血清可能通过升高nephrin的mRNA和蛋白表达水平,在一定程度上抑制高糖诱导的足细胞损伤。     

低剂量雷公藤甲素抑制Wnt3α/β-catenin信号通路活性改善高剂量D-葡萄糖诱导的足细胞转分化

探讨雷公藤甲素（triptolide,TP）改善高剂量D-葡萄糖（高糖）诱导的足细胞上皮-间充质转分化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）的作用和分子机制。将体外培养的小鼠永生化足细胞分为正常组（normal group,N）、高剂量D-葡萄糖组（high dose of D-glucose group,H-TP）、低剂量TP组（low dose of TP group,L-TP）、高剂量TP组（high dose of TP group,H-TP）以及甘露醇组（mannitol group,MNT）,分别进行不同的干预：N组加入D-葡萄糖（D-glucose,DG,5 mmol·L^-1）;HG组加入HG（25mmol·L^-1）;L-TP组加入HG（25 mmol·L^-1）＋TP（3μg·L^-1）;H-TP组加入HG（25 mmol·L^-1）＋TP（10μg·L^-1）;MNT组加入DG（5 mmol·L^-1）＋MNT（24.5 mmol·L^-1）。在干预后的各时间点（24,48,72 h）,首先,观察TP对足细胞增殖活性的影响;其次,检测足细胞上皮细胞标志性分子（nephrin和podocin）、间充质细胞标志性分子（desmin和Ⅰ型胶原）以及EMT相关介质snail的蛋白表达水平;最后,检测足细胞Wnt3α/β-catenin信号通路关键信号分子Wnt3α和β-catenin蛋白表达水平。结果表明,HG不仅能引起足细胞nephrin和podocin蛋白低表达,desmin,Ⅰ型胶原和snail蛋白高表达,诱导足细胞EMT,而且,能促使足细胞Wnt3α和β-catenin蛋白高表达,激活Wnt3α/β-catenin信号通路。此外,L-TP对足细胞增殖能力没有影响,与HG联合干预不仅能明显恢复足细胞nephrin和podocin蛋白表达水平,抑制其desmin,Ⅰ型胶原和snail蛋白表达水平,改善足细胞EMT,而且,能明显降低HG诱导的足细胞Wnt3α和β-catenin蛋白高表达,抑制Wnt3α/β-catenin信号通路活性。总之,HG在体外能激活Wnt3α/β-catenin信号通路而诱导足细胞发生EMT;L-TP在体外能明显抑制Wnt3α/β-catenin信号通路活性而改善足细胞EMT,这可能是其干预足细胞EMT的作用和分子机制之一。