阻断MEK1上调支气管上皮细胞谷氨酰半胱氨酸合成酶的表达

目的探讨MEK1信号通路与支气管上皮细胞(16-HBE)谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)表达的关系。方法应用MEK1抑制剂PD9805950μmol/L分别孵育16-HBE 2、8、16及24h。用Western印迹方法和荧光定量PCR检测细胞γ-GCS重链蛋白和mRNA的表达。用显色方法检测细胞内谷胱甘肽(GSH)的含量。用Western印迹方法检测细胞c-jun的水平。结果经PD98059孵育4、8、16及24h后,γ-GCS重链蛋白和mRNA的表达和细胞内GSH的含量较对照组均增加。各时间段c-jun表达较各对照组减少。结论在支气管上皮细胞中MEK1抑制剂PD98059对16-HBE的γ-GCS和GSH有明显的上调作用。阻断激活蛋白-1(AP-1)途径不能减少γ-GCS和GSH的合成。     

aFGF对人卵巢癌细胞株(CAOV3) TPK、PKC及ERK活性的影响

目的探讨酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)和细胞外信号调节激酶(ERK) 丝裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)抑制剂PD98059对人卵巢上皮性癌细胞株(CAOV3)细胞内酪氨酸蛋白激酶 (TPK)﹑蛋白激酶C(PKC)及ERK活性的影响.方法不同浓度aFGF和 PD98059诱导CAOV3细胞,[γ-32P]ATP掺入外源性底物,液体闪烁测定TPK﹑PKC及ERK活性的变化;Western印迹方法检测ERK表达水平.结果随着aFGF浓度增加,CAOV3细胞内TPK、PKC及ERK活性随之升高,与aFGF浓度呈剂量依赖效应; PD98059抑制细胞内PKC及ERK 活性,与PD98059浓度亦呈剂量依赖效应,并且PD98059 对aFGF诱导的PKC及ERK活性抑制更显著(P<0.05).Western印迹方法检测ERK表达水平与上述结果基本一致.结论 aFGF可能通过TPK途径激活PKC及ERK来调控CAOV3 细胞增殖,PKC及ERK是TPK下游信号分子,二者处于同一信号通路上不同环节.     

MEK1/2在脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞ICAM-1表达中的作用

目的：探讨MEK1/2在脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞（HUVECs）ICAM-1表达中的作用。 方法： 用不同浓度LPS或LPS加MEK1/2特异性抑制剂PD98059和HUVECs孵育不同时间后，分别采用RT-PCR和Western blotting检测ICAM-1 mRNA和蛋白的表达。 结果： LPS呈时间-浓度依赖性地上调HUVECs ICAM-1 mRNA和蛋白的表达。LPS预处理后2 h，HUVECs ICAM-1 mRNA和蛋白的表达即开始升高，LPS(100 μg·L-1)作用后6 h,ICAM-1 mRNA和蛋白的表达基本达到高峰；PD98059(10 μg·L-1)可显著抑制LPS(100 μg·L-1)诱导6 h的ICAM-1 mRNA和蛋白的表达，抑制率分别为54.4%和44.9%（P<0.01 vs LPS）。 结论： 调控MEK1/2通路可能为内毒素休克诱导血管内皮损伤的防治提供新的策略。     

腺病毒E1A蛋白对大鼠肺泡上皮细胞谷胱甘肽活性的影响及其机制探讨

目的 研究腺病毒E1A蛋白潜伏感染对大鼠肺泡上皮细胞谷胱甘肽(GSH)活性的影响及其机制.方法 构建稳定表达腺病毒E1A蛋白的大鼠肺泡上皮细胞,观察氧化剂刺激时细胞内GSH含量变化,检测GSH合成限速酶γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)催化活性的变化,通过观察γ-GCS 催化亚单位(GCLC)基因蛋白表达水平、mRNA表达水平和5′-上游调控序列调控的荧光素酶活性的改变,了解影响酶活性改变的机制.结果 腺病毒E1A蛋白表达抑制氧化应激时GSH的合成,抑制γ-GCS 催化活性和蛋白表达水平,抑制GCLC 基因mRNA表达,与5′-上游调控序列报导系统获得的结果一致.结论 腺病毒潜伏感染可能通过抑制GCLC基因 5′-上游调控序列的促转录活性,抑制了γ-GCS的表达和催化活性,从而抑制了氧化应激时GSH的合成,削弱机体的抗氧化作用,加重氧化损伤,可能是腺病毒潜伏感染参与慢性阻塞性肺病(COPD)发病的机制之一.     

碱性成纤维细胞生长因子经ERK信号通路抑制卵巢癌CAOV3细胞凋亡

目的:研究卵巢癌CAOV3细胞中碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)经MEK/ERK1/2信号转导通路对CREB、Bcl-2表达以及对细胞凋亡的影响作用。方法:无血清饥饿诱导细胞凋亡。分为对照组、bFGF组、bFGF PD98059组。Annexin-EGFP/PI荧光双染法检测细胞凋亡。Western印迹法检测ERK1/2、CREB以及Bcl-2蛋白表达。RT-PCR法检测Bcl-2的mRNA表达。结果:bFGF可抑制无血清饥饿诱导的细胞凋亡;时效依赖性地诱导ERK1/2活性增高、刺激CREB磷酸化、促进Bcl-2的mRNA及蛋白表达增加。bFGF作用CAOV3细胞15 min时ERK1/2活性达高峰;45 min时CREB磷酸化达峰值;Bcl-2的mREN表达高峰为6h,8h时蛋白表达最高。MEK1抑制剂PD98059可抑制bFGF的上述作用。结论:bFGF可能通过激活MEK/ERK1/2/CREB/Bcl-2信号转导途径抑制卵巢癌CAOV3细胞凋亡。     

慢性阻塞性肺疾病大鼠中磷酸化蛋白激酶B与γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的表达研究

目的通过观察慢性阻塞性肺疾病（COPD）大鼠模型中γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）与磷酸化蛋白激酶B（p-PKB）的表达,研究p-PKB和γ-GCS在COPD中可能的参与机制。方法28只健康雄性Wistar大鼠随机分为COPD组和对照组。采用每日熏香烟和两次气管内注入脂多糖（LPS）法制作COPD大鼠模型。检测肺组织中1-GCS活性,原位杂交检测肺组织中γ-GCS mRNA的表达,免疫组化和Western印迹分析肺组织中γ-GCS与p-PKB蛋白水平。结果γ-GCS活性在COPD组大鼠中明显高于对照组,组间差异有统计学意义（P〈0．05）。原位杂交显示COPD组大鼠支气管、肺泡上皮细胞与小动脉平滑肌细胞γ-GCS mRNA广泛表达,与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。COPD组大鼠γ-GCS与p-PKB免疫组化可见肺泡、支气管壁细胞及小血管平滑肌细胞胞浆有较强蛋白阳性信号;图像定量分析显示COPD组γ-GCS与p-PKB蛋白表达高于对照组,两组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。Westernblot显示,γ—GCS与p-PKB在COPD组蛋白表达高于对照组,且差异有统计学意义（P〈0．05）。SPSS10．0直线相关分析得出p-PKB蛋白表达与γ-GCS活性、mRNA及蛋白表达呈正相关。结论COPD大鼠肺组织1．GCS蛋白和mRNA表达增高,p-PKB蛋白也有相应高表达,提示p-PKB和γ-GCS可能在COPD的发病机制中起作用,且PKB可能参与了γ-GCS的信号转导。     

藏红花素对人脐静脉内皮细胞增殖及细胞外调节蛋白激酶信号通路的影响

目的观察藏红花素(crocin)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)体外增殖、细胞外调节蛋白激酶(ERK)1/2表达及活性的影响。方法用藏红花素及MAPK/ERK激酶(MEK)抑制剂PD98059分别处理HUVECs,Ed U细胞增殖法检测细胞体外增殖活力,Western blotting法检测crocin对磷酸化细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)和总ERK1/2表达的影响,激光扫描共焦显微镜检测细胞内Ca~(2+)浓度。结果在1μmol/L和10μmol/L浓度水平,藏红花素可明显促进细胞的增殖能力,提高磷酸化ERK1/2和总ERK1/2蛋白的表达水平,并增加细胞内Ca~(2+)浓度;给予MEK抑制剂PD98059后,细胞的增殖能力下降,磷酸化ERK1/2和总ERK1/2的表达减弱,细胞内Ca~(2+)浓度降低。结论藏红花素通过活化ERK1/2信号途径,提高细胞内Ca~(2+)浓度,促进人脐静脉内皮细胞的体外增殖能力。     

香烟烟雾提取物经aPKC√ζ-NRF2上调大鼠气道上皮细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶表达

目的 观察香烟烟雾提取物（CSE）是否通过不典型蛋白激酶Cι/ζ (aPKCι/ζ) -红系衍生的核因子相关因子2（NRF2）信号通路调控大鼠气道上皮细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）。方法 用Western blot法检测γ-GCS、NRF2和p-aPKCι/ζ蛋白，免疫细胞化学法观察γ-GCS蛋白表达，反转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测γ-GCS mRNA，免疫荧光法检测NRF2蛋白。结果 NRF2蛋白在CSE 3h组主要表达在胞核，其胞核蛋白高表达。p-aPKCι/ζ蛋白在CSE 3h组显著高于对照组（P＜0.05）。γ-GCS蛋白及其mRNA在CSE 3h组较对照组显著增强（P＜0.05）。预先加入aPKCι/ζ抑制剂RO813220，NRF2胞质蛋白表达增强，p-aPKCι/ζ蛋白、γ-GCS蛋白及其mRNA均明显低于CSE 3h组（均P <0.05）。相关性分析显示NRF2与γ-GCS、p-aPKCι/ζ呈正相关，p-aPKCι/ζ与NRF2、γ-GCS呈正相关（P＜0.05）。结论 CSE可能通过aPKCι/ζ-NRF2调节γ-GCS表达。     

aPKC及ERK在慢性阻塞性肺疾病大鼠中对NRF2-γ-GCS的调控作用

目的: 探讨慢性阻塞性肺疾病（COPD）大鼠模型中非典型蛋白激酶C(aPKC)、细胞外信号调节激酶(ERK)对红系衍生的核因子2相关因子2（NRF2）-γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）的调控。方法: 雄性Wistar大鼠16只，随机分COPD模型组和对照组。检测γ-GCS活性，γ-GCS的基因表达和NRF2、磷酸化的aPKC（p-aPKC_ι/ζ）、磷酸化的ERK（p-ERK）的蛋白质表达。结果: （1）γ-GCS 活性在COPD组中明显高于对照组。（2）γ-GCS mRNA广泛高表达于COPD组支气管平滑肌细胞，而对照组在相应部位呈弱表达。对照组肺匀浆中有一定量γ-GCS mRNA表达，但相对于COPD组仍较低。（3） p-aPKC、p-ERK、NRF2、γ-GCS在COPD组支气管上皮细胞胞浆中高表达,而对照组相应部位呈弱表达。COPD组γ-GCS和p-aPKC、p-ERK、NRF2蛋白表达皆有明显上调。（4）NRF2蛋白表达与γ-GCS蛋白、mRNA表达呈正相关,p-aPKC_ι/ζ、p-ERK与NRF2蛋白表达也呈正相关。结论: aPKC、ERK可能通过使NRF2转录活性增加的方式上调NRF2，进而上调γ-GCS的表达，在COPD的氧化应激机制中可能起重要作用。     

TLR4/MAPKs信号通路在ox-LDL诱导的血管平滑肌细胞分泌MCP-1中的作用

目的:探讨Toll样受体4/丝裂原活化蛋白激酶(TLR4/MAPKs)信号通路在氧化性低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的血管平滑肌细胞分泌单核细胞趋化因子-1(MCP-1)中的作用。方法:在ox-LDL刺激下采用逆转录聚合酶链技术(RT-PCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血管平滑肌细胞MCP-1的表达,用Western blotting检测细胞外信号调节激酶(ERK1/2)、p38促分裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)磷酸化水平的变化。同时,分别应用TLR4中和抗体(TLR4单克隆抗体、TLR4阻断剂)、PD98059(ERK1/2特异性抑制剂)、SB23015(p38MAPK特异性抑制剂)、SP600125(JNK特异性抑制剂),观察其对ox-LDL诱导的MCP-1的表达和ERK1/2、p38MAPK磷酸化水平的影响。结果:ox-LDL刺激血管平滑肌细胞上调MCP-1mRNA和其蛋白的表达(P0.05);用TLR4中和抗体、PD98059、SB23015预孵育后MCP-1mRNA和其蛋白的表达较单独ox-LDL刺激情况下降低(P0.05),而用SP600125预孵育后降低不明显(P0.05);TLR4调节了ERK1/2和p38MAPKs的磷酸化水平。结论:ox-LDL是TLR4的内源性配体;ox-LDL通过或部分通过TLR4/ERK1/2和TLR4/p38MAPK信号通路介导血管平滑肌细胞MCP-1的表达。     

支气管哮喘豚鼠肺组织中丝裂原活化蛋白激酶对γ-谷氨酰半胱氨酸合酶的作用

目的： 研究在支气管哮喘豚鼠肺组织中丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路对γ-谷氨酰半胱氨酸合酶（γ-GCS）的影响。方法: 成年雄性豚鼠20只随机分成哮喘组和对照组，每组10只，以腹腔内注射联合雾化吸入卵蛋白复制哮喘模型。测支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞总数并进行分类计数；原位杂交和RT-PCR测肺组织中γ-GCS-h mRNA表达；免疫组化测γ-GCS、磷酸化细胞外激活蛋白激酶（p-ERK）、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)和磷酸化 p38（p-p38）在肺组织中的表达;Western blotting 测 p-ERK、p-JNK和p-p38在肺组织中的表达；双酶法测γ-GCS的活性。结果: （1）哮喘组BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞明显多于对照组 (P<0.01)。（2）免疫组化显示肺组织中p-ERK、p-p38、p-JNK和γ-GCS 蛋白质表达哮喘组明显高于对照组（P<0.01）；Western blotting 亦显示肺组织中p -ERK、p-JNK和p-p38 蛋白质表达哮喘组均明显高于对照组。（3)原位杂交和RT-PCR显示在肺组织中γ-GCS-h mRNA 表达哮喘组明显高于对照组(P<0.01)。（4) γ-GCS活性哮喘组明显高于对照组（P<0.01）。（5）直线相关性分析显示：在肺组织中p-ERK、p-p38与γ-GCS-h mRNA、γ-GCS蛋白质呈显著正相关，p-JNK与γ-GCS-h mRNA、γ-GCS蛋白质无明显相关性。结论: 支气管哮喘豚鼠肺中 p-ERK、p-p38、p-JNK和γ-GCS表达均增加；p-ERK和p-p38可能上调γ-GCS表达。     

腺病毒潜伏感染对大鼠肺泡上皮细胞氧化/抗氧化平衡的影响

目的：研究腺病毒潜伏感染对大鼠肺泡上皮细胞氧化/抗氧化平衡的影响。方法: 构建稳定表达腺病毒E1A蛋白的大鼠肺泡上皮细胞，检测氧化剂刺激时GSH、MDA的含量变化和主要抗氧化酶SOD、CAT、GPx、GST以及γ-GCS酶活性的变化。 结果：腺病毒E1A蛋白通过抑制大鼠肺泡上皮细胞内γ-GCS酶的活性，抑制了氧化应激时GSH的合成和GPx及GST酶的活性；腺病毒E1A蛋白下调了细胞在氧化应激后的恢复能力。结论： 腺病毒潜伏感染扩大了大鼠肺泡上皮细胞氧化应激时的氧化/抗氧化失衡，而腺病毒E1A蛋白抑制γ-GCS酶的活性是其中的关键环节。     

miR-133a-3p靶向调控CD2AP基因减轻RSV感染的人支气管上皮细胞系16-HBE损伤

目的探讨miR-133a-3p对呼吸道合胞病毒(RSV)感染的支气管上皮细胞凋亡、炎性反应的影响及其对CD2相关蛋白(CD2AP)的调控作用。方法收集59例支气管哮喘儿童的支气管黏膜组织标本为AsP组,同时选取59例支气管扩张非哮喘儿童的支气管黏膜组织标本为NC组,用RT-qPCR法检测组织中miR-133a-3p、CD2AP的表达量;RSV感染支气管上皮细胞(16-HBE)建立细胞损伤模型(RSV组),分别将miR-NC、miR-133a-3p mimics、si-NC、si-CD2AP、pcDNA-NC、pcDNA-CD2AP、miR-133a-3p mimics与pcDNA-NC、miR-133a-3p mimics与pcDNA-CD2AP转染至感染RSV的16-HBE细胞;用RT-qPCR法与Western blot法分别检测细胞中miR-133a-3p、CD2AP的表达量;用ELISA法检测TNF-α、IL-6、IL-1α的水平;用流式细胞术检测细胞凋亡率;双荧光素酶报告实验检测miR-133a-3p与CD2AP的靶向关系;Western blot法检测cleaved-caspase-3蛋白表达量。结果与NC组比较,AsP组支气管黏膜组织中miR-133a-3p的表达水平降低(P0.05),CD2AP mRNA的表达水平升高(P0.05);RSV感染的16-HBE细胞中miR-133a-3p的表达水平降低(P0.05),CD2AP的表达水平及TNF-α、IL-6、IL-1α的水平升高(P0.05),凋亡率及cleaved-caspase-3蛋白水平升高(P0.05);RSV感染的16-HBE细胞中转染miR-133a-3p mimics或转染si-CD2AP可明显降低TNF-α、IL-6、IL-1α的水平、凋亡率及cleaved-caspase-3蛋白水平(P0.05);双荧光素酶报告实验证实CD2AP是miR-133a-3p的靶基因;共转染miR-133a-3p mimics与pcDNA-CD2AP可明显逆转miR-133a-3p mimics对16-HBE细胞凋亡及炎性反应。结论 miR-133a-3p过表达可通过负向调控CD2AP的表达而抑制RSV感染的支气管上皮细胞炎性反应及凋亡,从而减轻细胞损伤。     

转化生长因子β1促进骨髓间充质干细胞Snail表达的信号转导通路

目的 探讨细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-Akt信号转导通路在转化生长因子β1(TGF-β1)引起骨髓间充质干细胞(BMSCs)Snail表达改变中的调控作用. 方法 采用密度梯度离心结合贴壁法分离、培养大鼠BMSCs,用免疫荧光法对培养第3代的细胞进行鉴定.应用Western blotting检测TGF-β1对p-ERK1/2及p-Akt表达的影响,以不同浓度ERK特异性抑制剂(PD98059)或PI3K通路特异性抑制剂(Wortmannin)干预后检测BMSCs ERK、Akt磷酸化水平变化,确定PD98059和Wortmannin分别抑制Snail诱导的BMSCs ERK和Akt磷酸化的有效浓度,进而用RT-PCR、Western blotting技术证实TGF-β1诱导骨髓间充质干细胞Snail mRNA及蛋白表达的影响. 结果 密度梯度离心结合贴壁法能有效分离、纯化大鼠BMSCs,免疫荧光检测显示,培养的细胞CD29、CD44表达阳性,而CD34、CD45表达阴性;Western blotting分析显示,TGF-β1作用6h后BMSCs p-Akt和p-ERK水平较对照组明显增高;Wortmannin和PD98059可分别以剂量依赖性抑制BMSCs p-Akt和p-ERK水平;可有效抑制TGF-β1诱导的BMSCs ERK及Akt的磷酸化,PD98059和Wortmannin相应浓度分别为30 μmol/L和40 nmol/L.PD98059(30 μmol/L)、Wortmannin(40 nmol/L)明显抑制了TGF-β1诱导的Snail mRNA及蛋白水平,而两者联合应用对骨髓间充质干细胞Snail mRNA及蛋白表达的抑制作用具有协同作用,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05). 结论 TGF-β1能促进BMSCs的Snail的转录及蛋白的表达,且ERK1/2及PI3K转导通路的激活在此过程中具有调控作用.     

碱性成纤维细胞生长因子对AD细胞模型ERK1/2活性的影响

目的 研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对阿尔茨海默病(AD)细胞模型中磷酸化细胞外调节蛋白激酶(p-ERK1/2)表达影响.方法 经体外培养的大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞(PC12细胞)分正常对照组(常规培养液)、Aβ损伤组(即AD细胞模型,加入Aβ25-35)、bFGF组(加入bFGF及Aβ25-35)和抑制剂组(加入MEK抑制剂PD98059、bFGF和老化Aβ25-35).MTT怯检测不同处理组PC12细胞存活率,Western Blot免疫印迹法分析P-ERK1/2蛋白表达变化.结果 Aβ损伤组PC12细胞存活率低于正常对照组(P＜0.05),bFGF组细胞存活率高于A β损伤组(P＜0.01).Western Blot结果显示,Aβ损伤组p-ERK1/2相对表达值较对照组显著下降,A β损伤组在加入不同浓度的bFGF后p-ERK1/2的相对表达值较A β损伤组显著增强,抑制剂组在加入不同浓度的PD98059后p-ERK1/2的相对表达值较bFGF组p-ERK1/2显著下降.结论 bFGF对Aβ诱导的PC12细胞损伤具有一定保护作用,可能与增强PC12细胞ERK1/2活性有关.     

Akt、ERK1/2活化在脑源性神经营养因子促血管新生中的作用

目的： 探讨脑源性神经营养因子(BDNF) 促进血管新生的作用及其参与的信号通路,为抗肿瘤血管生成的研究提供新的实验依据。 方法: 以人脐静脉内皮细胞为对象,采用Western 印迹方法检测细胞内磷酸化Akt、ERK1/2蛋白质的表达； 采用Transwell小室迁移实验、管腔形成实验评价体外内皮细胞血管新生的能力，MTT法检测内皮细胞增殖 活性，FITC-Annexin-Ⅴ/PI双染流式细胞术分析细胞凋亡。 结果: BDNF以时间依赖性方式激活PI3K/Akt 和MEK1/ERK信号通路。分别应用PI3K激酶抑制剂Ly294002、 MEK1激酶抑制剂PD98059可以明显阻断BDNF对PI3K/Akt、MEK1/ERK信号通路的激活。100 μg/L 的BDNF体 外促内皮细胞血管新生能力与 25 μg/L 血管内皮生长因子（VEGF）相当， 其中BDNF诱导的细胞迁移分 别被Ly294002和PD98059阻断，其抑制率分别约为74%和36%；同样，Ly294002、PD98059可部分阻断BDNF诱 导的小管形成效应，其阻断率分别约57%和37%；而BDNF的促增殖效应仅被PD98059拮抗，抑制凋亡效应仅受Ly294002影响。 结论: BDNF在体外有促血管新生的作用。PI3K/Akt 和MEK1/ERK信号通路以不同机制共同调节这一过程,其中PI3K/Akt信号通路起着更为重要的调节作用。     

磷脂酰肌醇-3激酶、蛋白激酶B及γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶在慢性阻塞性肺疾病患者中的表达

目的观察慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者中磷脂酰肌醇-3激酶（H3K）、蛋白激酶B（PKB）与γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）的表达,研究P13K、PKB通路和γ-GCS的关系。方法将手术切馀的肺癌患者肺组织标本（16例）分为COPD组和对照组,每组8例,检测肺组织中γ—GCS活性,原位杂交检测肺组织中γ-GCSmRNA的表达,免疫组化分析肺组织中H3K、PKB与γ-GCS的蛋白水平。结果COPD组中1．GCS活性明显高于对照组,差异有统计学意义（P〈0．01）。原位杂交显示COPD组支气管、肺泡上皮细胞与小动脉平滑肌细胞γ-GCSmRNA广泛表达,与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．01）。P13K、PKB与γ-GCS免疫组化在COPD组可见肺泡、支气管壁细胞及小血管平滑肌细胞胞浆中皆有蛋白阳性信号表达,图像定量分析显示COPD组H3K、PKB与γ—GCS蛋白表达显著高于对照组,差异有统计学意义（P〈0．01）。直线相关分析得出H3K、P-PKB蛋白表达与γ-GCS活性、mRNA及蛋白表达呈正相关。结论COPD患者肺组织γ-GCS蛋白和mRNA表达增高,P13K、p-PKB蛋白也有相应高表达,提示P13K、PKB和γ-GCS可能在COPD的发病机制中发挥作用,且可能参与了γ-GCS的信号传导通路。     

PI3K/Akt/eNOS信号通路在葛根素抑制ox-LDL诱导的血管内皮细胞组织因子表达中的作用

目的:探讨磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/内皮型一氧化氮合酶(PI3K/Akt/eNOS)信号通路在葛根素(puerarin)抑制氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)诱导的血管内皮细胞组织因子(tissue factor,TF)表达中的作用。方法:实时荧光定量PCR检测TF的mRNA表达,Western blot检测TF和Akt的蛋白表达,硝酸盐还原酶法检测一氧化氮(nitric oxide,NO)含量。结果:与对照组相比,ox-LDL孵育内皮细胞后,内皮细胞TF的mRNA和蛋白表达升高,Akt蛋白磷酸化水平降低,细胞内NO产生减少;而葛根素预孵育内皮细胞1 h后,再用ox-LDL孵育,内皮细胞TF mRNA和蛋白表达下降,Akt蛋白磷酸化升高,细胞内NO产生增多;PI3K抑制剂LY294002和葛根素共同预孵育内皮细胞1 h后,再用ox-LDL孵育,内皮细胞TF的mRNA和蛋白表达升高,Akt蛋白磷酸化降低,细胞内NO产生减少;eNOS抑制剂NG-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)和葛根素共同预孵育内皮细胞,也明显阻断葛根素对ox-LDL诱导的内皮细胞TF mRNA和蛋白表达、细胞Akt蛋白磷酸化和细胞内NO产生的作用。结论:葛根素可通过上调PI3K/Akt/eNOS信号通路抑制ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞TF mRNA和蛋白表达。     

细胞外调节蛋白激酶信号通路参与机械牵张诱导肺泡上皮细胞高迁移率族蛋白B1的表达调控

目的 探讨细胞外调节蛋白激酶（ERK）信号通路在机械牵张诱导肺泡上皮细胞（A549）表达高迁移率族蛋白B1（HMGB1）中的作用。 方法 肺泡上皮细胞A549分为A、B、C 3组,A组为对照组;B组A549细胞施加14%牵张应变,牵张时间为4 h;C组细胞的牵张模式与B组相同,只是于施加牵张前用ERK的特异性抑制剂PD98059预处理A549细胞2h。分别用免疫细胞化学染色和RT-PCR检测细胞HMGB1蛋白和mRNA的表达,用Western blotting检测ERK激酶的活性。 结果 A549细胞施加14 %牵张应变后,HMGB1蛋白和mRNA表达明显增加,ERK激酶活性明显增高（P＜0.05）;该诱导激活作用可被PD98059阻断。 结论 机械牵张通过ERK信号通路,调节A549细胞的HMGB1基因和蛋白表达。     

肺炎克雷伯菌夹膜多糖激活AP-1 诱导人支气管上皮细胞表达 β-防御素-3

目的:观察肺炎克雷伯菌夹膜多糖(CPS)对人支气管上皮细胞表达β-防御素-3(hBD-3)的影响,并探讨其作用机制。方法:用肺炎克雷伯菌CPS刺激人支气管上皮细胞BEAS-2B。使用实时定量PCR和ELISA分别检测hBD-3 mRNA和蛋白表达的影响。测定CPS处理前后丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)以及c-Jun的磷酸化。采用MAPKs和NF-κB抑制剂或RNA干扰TLR4表达,观察其在介导hBD-3表达中的作用。采用染色质共沉淀技术检测核转录因子AP-1与hBD-3启动子的结合情况。结果:CPS处理细胞后,hBD-3 mRNA的表达呈剂量依赖性升高,ELISA获得类似结果。CPS能激活MAPKs,采用p38、ERK及NF-κB抑制剂SB203580、PD98059和PDTC处理细胞后,不影响hBD-3的表达,而JNK抑制剂SP600125处理后,hBD-3分泌明显降低。CPS可诱导AP-1亚基c-Jun磷酸化及能增强AP-1与hBD-3启动子的结合。结论:肺炎克雷伯菌夹膜多糖激活AP-1诱导人支气管上皮细胞表达β-防御素-3。