儿童呼吸道腺病毒基因分型方法的建立及其应用

目的利用PCR技术,建立引起儿童呼吸道感染的腺病毒的基因分型方法,便于推广和应用。方法分析GenBank中不同型别腺病毒的六邻体基因序列特点,设计不同型腺病毒的特异性引物,以PCR方法进行基因分型,建立基因分型方法,并利用此方法对广州市2004年7月某幼儿园流行的腺病毒感染进行了基因分型。结果建立了呼吸道腺病毒的基因分型方法。广州市2004年7月某幼儿园流行的腺病毒为3型腺病毒。结论PCR方法可进行腺病毒的基因分型,且简便、结果可靠,便于推广应用。     

用聚合酶链反应技术诊断儿童呼吸道腺病毒感染

用聚合酶链反应技术诊断儿童呼吸道腺病毒感染郑永晨，傅文永（白求恩医科大学第一临床学院儿科，长春１３００２１）腺病毒（Ａｄｖ）是儿童肺炎的主要病原［１］，特别是我国北方地区，目前尚无一种较理想的常规实验室诊断方法，以往报道的血清方法存在灵敏性低和特异性...     

儿童呼吸道腺病毒3型爆发流行的病原学研究

目的探讨广州市某幼儿园爆发流行的急性咽结膜热的病毒病愿学．方法采集急性咽结膜炎息儿急性期的眼、咽拭子进行PCR及序列分析．结果32份咽拭子中20份PCR阳性，阳性率62．5％，用分型引物检测及序列分析，均证实为单一腺病毒3型感染．结论本次急性咽结膜炎是由腺病毒3型引起．     

广西HIV-1重组毒株env区快速基因分型方法的建立

目的建立一种快速简便的基因分型方法，对广西HIV-1重组毒株env基因区进行亚型鉴定。方法从HIV阳性样品中提取核酸，使用HIV-1M组通用引物对env区进行第一轮扩增，第二轮则使用分别检测B′/C或C亚型和CRF01-AE亚型的二套特异性引物放入同一反应管中进行扩增，根据不同亚型扩增的目的带位置不同来判断亚型。将通用引物扩增出的所有样本均进行基因测序和系统树分析以验证结果。结果50份样本中，经基因测序和系统树分析证实CRF08-BC样本3份（6％），CRF01-AE样本43份（86％），4份（8％）样本无法确定亚型。经亚型特异性引物PCR法检测得出B′/C或C亚型样本3份（100％），CRF01-AE样本39份（90．7％），灵敏度为91．3％，特异度为100％。两种方法检测结果经差异性检验显示X^2=2．25，P〉0.05，差异无统计学意义，结果一致者占92％。与基因分析结果吻合。重复实验显示CRF08-BC平均重复性为100％（10／10），CRF01．AE为93．8％（61／65）。结论该方法是一种简便、快速、低成本，具有高度灵敏性和特异性的HIV-1毒株env基因区分型法，能够直接对广西HIV-1 CRF01-AE重组毒株进行鉴定。     

儿童呼吸道腺病毒3型爆发流行的病原学研究

目的探讨广州市某幼儿园爆发流行的急性咽结膜热的病毒病原学.方法采集急性咽结膜炎患儿急性期的眼、咽拭子进行PCR及序列分析.结果 32份咽拭子中20份PCR阳性,阳性率62.5%,用分型引物检测及序列分析,均证实为单一腺病毒3型感染.结论本次急性咽结膜炎是由腺病毒3型引起.     

慢性乙肝病毒感染者基因分型及其临床意义

目的探讨江苏南通地区慢性乙肝病毒（HBV）感染者基因型分布状况及其临床相关性。方法采用多对型特异性引物巢式PCR法对220例南通地区血清HBV标志物和HBV-DNA阳性者,包括乙肝表面抗原携带者（ASC）30例,慢性乙型肝炎（CHB）97例,重型肝炎（CSH）29例,肝炎后肝硬化（LC）34例,肝细胞癌（HCC）30例,进行HBV基因型检测。结果220例中B型59例（26.8%）,C型150例（68.2%）,BC混合型11例（5.0%）;C基因型在CSH组、LC组、HCC组中的比例显著高于ASC组（P〈0.05）。B型、C型、BC混合型HBeAg阳性率分别为49.2%、54.0%和36.4%,差异无统计学意义（P〉0.05）。C型和BC混合型HBV-DNA载量显著高于B型,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论南通地区HBV基因型以B、C型为主,C型为优势基因型,并与重型肝炎、肝硬化、肝癌的发生及血清HBV-DNA高载量相关。     

乙型肝炎病毒基因分型荧光PCR检测及临床应用

目的:了解乙型肝炎病毒基因分型、分布及其与肝功能损害、病毒复制水平的关系.方法:采集69例乙肝患者血样,采用荧光聚合酶链反应(PCR)检测乙肝病毒基因分型,通过荧光探针识别基因型特异性序列,采集分析荧光信号确定病毒基因型,分别检测谷丙转氨酶(ALT)水平、乙肝病毒e抗原(HBeAg)和HBV DNA含量.结果:69例乙肝患者中B型26例,C型43例.B型和C型患者的ALT水平分别为(453.54±447.93)U/L和(330.23±306.90)U/L(P＞0.05);HBeAg阳性数分别为11例和23例(P＞0.05);HBV DNA含量分别为(38.74±36.49)×104拷贝/ml和(34.53±34.09)×104拷贝/ml(P＞0.05);不同临床类型乙肝患者中两种基因型的分布没有显著差异(P＞0.05).结论:本地区乙肝患者病毒基因型主要为B型和C型;二种基因型ALT水平、HBeAg表达水平、病毒复制水平以及肝炎病情均无显著性差异.     

乙型肝炎病毒基因分型及临床应用

目的:了解常州金坛地区乙型肝炎病毒基因分布特征,探讨基因型与肝功能损害、病毒复制水平的关系。方法:采用巢式聚合酶链反应(nest PCR),扩增乙型肝炎病毒S基因区,用末端标记方法对PCR产物标记并直接测序,测序结果和GenBank中登录的标准基因型序列相比较。结果:对该地区122例不同HBV感染者血清HBV DNA进行了基因分型,B型40例(占32.9%),C型82例(占67.1%),未发现B、C以外其他基因型;谷丙转氨酶(ALT)水平分别为(366.8±322.5)U/L和(354.3±315.2)U/L(t=0.339,P>0.05);HBV DNA含量(对数值)分别为(7.69±1.15)和(7.58±1.16)拷贝/m l(t=0.141,P>0.05);HBeAg阳性数分别为28/40和50/82(2χ=0.162,P>0.05);96例慢性乙型肝炎中B型为34例、C型为62例,18例肝硬化和肝癌患者检出B型3例、C型15例,二组比较2χ=7.72,P<0.01。结论:本地区HBV DNA基因型为B型和C型;二种基因型ALT水平、病毒复制水平和HBeAg表达水平均无显著性差异;C基因型与肝硬化和肝癌关系密切。     

乙型肝炎病毒基因聚合酶链反应分型方法的建立

根据乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的Ｓ区序列设计了３条引物：ＨＢＳ１、ＨＢＳ２和ＨＢＳ３，与ＨＢＳ１和ＨＢＳ２配对，经２次聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增。即可在检测有无ＨＢＶ－ＤＮＡ存在的同时对其基因型分类，可检出１０ａｇ的ＨＢＶ－ＤＮＡ，比免疫学方法更灵敏和特异。２５份不同亚型的标准血清中的绝大多数用Ｓ－ＰＣＲ和ＡＧＩＤ／ＲＰＨＡ的分型结果一致，Ｓ－ＰＣＲ的另一突出优越性的于能够对ＨＢｓＡｇ低滴度和阴性标本     

辽宁地区汉坦病毒分离株的基因分型

目的　分离辽宁地区汉坦病毒并对分离株 (SY 13)进行基因分型 ,以查清辽宁地区汉坦病毒流行株的基因型和基因亚型。方法　采用组织细胞培养法分离汉坦病毒 ;用RT PCR法分别扩增SY 13的M片段G1、G2区和S片段 ;采用邻位相连法 ,通过DNAStar、Clustalx、Phylip等序列分析软件分别对 3个基因片段的序列与从GenBank下载的序列进行同源性分析 ,并构建种系发生树。结果　通过对 3个基因片段进行比较分析 ,SY 13与HTN型同源性较高 ,为 79.3%～ 97.0 % ;通过M片段G2区的比较分析 ,SY 13与BAO 10、BAO 14、JIANG 13、BAO 9、Q 33处于同一分支 ,同源性为 95.0 %～97.0 %。结论　辽宁地区汉坦病毒SY 13株与黑龙江地区分离株属同一亚型 ,为HTN型病毒中的H4亚型     

人类疱疹病毒6型荧光定量PCR检测方法的建立和应用

目的 建立人类疱疹病毒6型(HHV-6)荧光定量PCR检测方法,并检测临床样本.方法 根据文献合成HHV-6 U65-66基因片段的特异性引物和TaqMan探针,构建质粒制备标准品,评估该方法的特异性、灵敏度和重复性;并用该方法检测93份临床诊断为病毒性脑炎的脑脊液标本.结果 本实验检测HHV-6的灵敏度为3×10(0)拷贝/μl;标准曲线间线性关系(R2)为0.999,扩增效率为97.9％;同一样本重复检测3次,组内Ct值的变异系数最大为0.61％,组间为3.13％;特异性检测中只有HHV-6阳性标本出现扩增曲线.93份临床标本中检出HHV-6阳性2例,检出率为2.15％.结论 本实验所建立的荧光定量PCR检测HHV-6的方法特异强、灵敏高、重复性好,具有应用于临床检测的潜在价值.     

Acute respiratory distress syndrome in adenovirus type 4 pneumonia: A case report

Human adenoviruses (HAdVs) cause a wide spectrum of clinical syndromes, depending on species and types, from mild respiratory infections to deadly pneumonia: in particular, severe infections occur in immunocompromised patients. In this report, we describe the case of a 36 years-old woman admitted to our intensive care unit (ICU) with severe respiratory distress syndrome caused by adenovirus pneumonia, that required invasive respiratory support (mechanical ventilation and extracorporeal membrane oxygenation). Molecular assays detected the virus in respiratory and plasma specimen and sequencing procedure identified HAdV type 4. Patient improved after cidofovir administration. Leukopenia and subsequent bacterial infection occurred, but the patient recovered completely and was discharged from the hospital after 54 days.     

长沙地区呼吸道感染儿童Saffold心肌炎病毒的调查

目的了解长沙地区Saffold病毒（以下简称为SAFV）在儿童呼吸道感染中的流行情况,探讨其与儿童呼吸道感染的相关性。方法选取湖南省人民医院儿科医学中心2007年11月至2008年10月间643名因呼吸道感染住院儿童的鼻咽抽吸物。采用实时荧光定量聚合酶链式反应（Realtime．PCR）方法扩增SAFV的5UTR的基因片段,并且统计分析临床资料。结果643份样本中共检测出SAFV阳性67份,阳性检出率为10．42％（67／643）,5岁以上未检测出该病毒。31例患迁延性肺炎和慢性肺炎的患儿标本检出SAFV8例（25．81％）,差异有统计学意义。结论本研究表明长沙地区下呼吸道感染住院儿童存在SAFV感染;SAFV可能与下呼吸道感染及病程迁延相关。     

乙型肝炎病毒基因分型方法的建立及应用

目的　扩增病毒S基因区,建立基因分型方法。方法　利用基因库软件及PCR和限制性片段长度多态性分析技术RFLP,用慢性无症状携带者的血清,扩增病毒S基因,建立新的分型方法。用此方法对我国部分地区慢性无症状携带者(AsC)及慢性乙型肝炎、肝硬化的HBVDNA进行了调查。对广州、重庆、北京、沈阳等地区慢性无症状携带者的HBVDNA进行分型。结果　广州,B型328%、C型427%、BC混合型230%、其他16%;重庆,B型350%、C型400%、BC混合型250%;北京,B型250%、C型500%、BC混合型250%;沈阳,B型111%、C型889%。结论　新的基因分型方法,简化了传统的基因序列分型法,结果可靠,操作相对简便。我国HBVDNA的基因型以C型和B型为主。广州地区慢性乙型肝炎和肝硬化患者的HBV基因型,肝硬化患者以C和B混合型为主,占500%,HBVDNA毒株的混合感染,有可能加重肝组织的损伤。     

实时荧光定量PCR检测儿童下呼吸道感染的WU多瘤病毒

目的 建立并应用检测儿童下呼吸道感染WU多瘤病毒(WU polyomavirus)的实时荧光定量PCR( real-time fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)方法.方法 选择WU多瘤病毒的VP2基因作为检测的目标基因,设计FQ-PCR引物和检测探针,以重组质粒为标准品建立标准曲线,并对该方法的特异性、灵敏度、重复性进行评价;应用该方法对温州医学院附属温岭医院收集的临床下呼吸道感染患儿的痰液、咽拭子846份及血清标本846份进行定量检测.结果 本研究建立FQ-PCR检测方法,质粒标准曲线的方差系数为0.998,灵敏度可达到50拷贝;应用该方法检测700份痰液标本,检测到7例阳性标本,146份咽试子标本中未检测到阳性标本,总阳性率为1.00％ (7/700),846份血清标本未检测到阳性标本.结论 本研究建立的FQ-PCR方法可以特异、快速、灵敏地对儿童下呼吸道感染的WU多瘤病毒进行定量检测;痰液标本较咽拭子或血清标本更适用于WU多瘤病毒感染的核酸检测.     

多重PCR检测方法和液态芯片技术在呼吸道病毒检测中的应用研究

目的 评估澳大利亚维多利亚感染性疾病参比实验室（The Victorian Infectious Diseases Reference Laboratory,VIDRL）的呼吸道病毒多重PCR检测方法和Luminex公司多指标同步分析液态芯片技术-呼吸道病毒检测试剂盒（xTAG RVP）,应用于多种常见呼吸道病毒检测的优势和缺点,为更好地、有针对性地选择合适技术进行临床实验诊断或公共卫生应急检测提供依据.方法 使用VIDRL的呼吸道病毒多重PCR检测方法和Luminex公司xTAG RVP试剂盒对198份临床流感样症状患者的咽拭子标本进行常见呼吸道病毒的核酸检测.结果 198份临床标本经VIDRL多重PCR方法和xTAG RVP方法检测,阳性率分别为38.89％和45.45％,符合率为72.22％.单一病毒的符合率为87.88％～100％.结论 xTAG RVP方法与VIDRL多重PCR方法相比,两者在常见呼吸道病毒检测中的特异性和敏感性相近,xTAG RVP方法具有明显的快速和高通量的优势.     

聚合酶链反应检测致瘤性人类疱疹病毒6型方法的建立及应用

目的　建立致瘤性人类疱疹病毒 6型 (HHV 6 )荧光定量聚合酶链反应 (FQ PCR)检测方法 ,为快速、准确地定量检测HHV 6奠定基础。方法　根据HHV 6型基因序列 ,设计并合成引物、荧光标记探针。先用特异性引物筛选HHV 6 ,其PCR片段克隆入载体 ,再对重组质粒进行筛选、测序及鉴定。确证后的HHV 6DNA片段制成标准品并作为阳性模板 ,开发HHV 6FQ PCR检测系统。用该系统测定研究样品。结果　重组质粒获得的HHV 6DNA产物经 1∶10梯度稀释后 ,制作定量曲线的循环阈值 (Ct)与模板浓度具有良好的线性关系 ,相关系数为 0 99。经本反应系统检测的临床标本共135份 ,检测到 16份HHV 6DNA阳性。结论　建立了检测致瘤性HHV 6的FQ-PCR方法 ;此方法较定性PCR技术更为简便、快速、准确 ,且具有很好的应用前景和推广价值     

毛细管PCR技术在传染病快速诊断上的初步应用

常规ＰＣＲ反应需要２～６小时，而在毛细管ＰＣＲ反应中，由于采用毛细管作为反应容器，因此能在１５分钟完成３０个循环。对国产毛细管ＰＣＲ仪进行优化的结果表明：循环参数为９４℃０秒（即＜１秒），５０℃～５５℃０秒，７２℃２０秒，ＰＣＲ反应达到最佳。敏感性实验表明：常规ＰＣＲ可检测１．０ｆｇＨＢＶＤＮＡ，毛细管ＰＣＲ可检测０．１ｆｇＨＢＶＤＮＡ。用１１种引物从多种标本中成功地扩增了９种病原微生物相应基因片段。建立了ＫＩ－玻璃粉法快速制备ＰＣＲ模板的方法，几乎适合所有类型的临床标本。将毛细管ＰＣＲ用于检测血清中ＨＢＶＤＮＡ，结合快速热处理法制备ＰＣＲ模板，可在１．５小时内对２０例标本报告结果。毛细管ＰＣＲ技术的建立，为传染病的基因诊断向快速化发展开辟了新的途径。     

Human adenovirus infection in children with acute respiratory tract disease in Guangzhou, China

Acute respiratory infections (ARI) are the major worldwide health problem due to associated high morbidity and mortality rates. Adenovirus (Adv) is one of the most common causes of viral ARI, and thus calls for specific diagnosis and better understanding of the epidemiology and clinical characteristics. Our aims were to find out the status of Adv infection in children <14 years with ARI, analyze the epidemiology and clinical characteristics among the Adv-infected children in Guangzhou, China, and to provide some basis for the research of Adv. The throat and pharyngeal swabs were collected among the children with acute respiratory tract infections in outpatient department from September 2006 to August 2008. The samples were analyzed by PCR and the sequences were blasted with the sequences of Adv in GenBank. Clinical data were analyzed along with virological data by using appropriate statistical methods. Adv was detected in 25 out of 512 (4.9%) children. The genome types of 23 samples were determined after analysis of the gene sequence. The most prevalent Adv type was species B type 3. Among the patients, 10 were of Ad3 (43.5%), three were of Ad1 (1.3%), five were of species C Ad2 (21.7%), and five were of species E Ad4 (21.7%). A higher incidence of positive results was found during the summer season, thus showing a pattern of seasonality. There exists Adv infection in children with acute respiratory system diseases in Guangzhou area. No significant differences were found among different age groups and gender groups. Co-infections with other respiratory virus were detected in 64% of the Adv positive samples.