新德里金属β-内酰胺酶-1的研究进展

NDM-1是新德里金属β-内酰胺酶-1(New Delhi metallo-β-lactamase-1)的英文缩写,因携带该基因的细菌会产生一种特殊的β-内酰胺酶,且活性部位为金属离子,又首先在印度首都新德里出现而得名[1].NDM-1基因可指导合成NDM-1酶,能水解几乎所有β-内酰胺类抗菌药物,包括目前最有效力的碳青霉烯类[1].现就NDM-1超级细菌的生物学特征、流行现状、耐药特性、检测方法和治疗5个方面的内容作一综述.     

产β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌新型整合酶基因研究

老年患者肺炎克雷伯菌β-内酰胺酶基因和氨基糖苷类药物耐药相关基因已有较多报道[1-2].为进一步了解老年人肺炎克雷伯菌分离株转座子和整合子的存在状况,笔者对20株肺炎克雷伯菌进行了转座子遗传标记（tnp513、tnpU 、tnpA、merA）和整合子遗传标记（int Ⅰ1、int Ⅰ2、intⅠ3）检测.     

多药耐药鲍曼不动杆菌22种β-内酰胺酶基因和酶活性的检测研究

目的了解临床分离的多药耐药鲍曼不动杆菌（multi—drug resistant Acirtetobacter baumannii,MDRAB）3-内酰胺酶基因存在状况以及酶活性。方法从浙江大学医学院附属第一医院住院患者中分离62株MDRAB,采用PCR及序列分析方法分析22种β-内酰胺酶基因,同时采用酶提取物改良三维试验检测超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）、头孢菌素酶（AmpC酶）和金属β-内酰胺酶活性。结果62株MDRAB中,TEM、OXA-23群和ADC基因阳性株数分别为51株（82．3％）、50株（80．6％）和36株（58．1％）,其余19种基因均为阴性;任选5株TEM基因PCR阳性产物测序比对,显示与GenBank基因库中TEM-1型相同;任选6株OXA-23群基因PCR阳性产物测序比对,显示与OXA-23型碳青霉烯酶基因（登录号：CAB69042．1）相同;任选2株ADC基因测序比对,显示与ADC-like型AmpC酶基因（登录号：EU081908）相同。有32株（51．6％）同时产ESBLs和AmpC酶,19株（30．6％）单独产ESBLs,1株（1．6％）单独产AmpC酶;金属β-内酰胺酶活性检测均为阴性。结论产OXA-23群碳青霉烯酶和ADC型AmpC酶是本组MDRAB对β-内酰胺类药物耐药的主要原因。     

关于携带3种β内酰胺酶基因的鲍氏不动杆菌质粒的研究

目的 了解携带3种β内酰胺酶基因的鲍氏不动杆菌质粒的町传递性.方法 选取从烧伤创面分离出的多重耐药鲍氏不动杆菌(供体菌),将之与大肠埃希菌ATCC 25922(受体菌)进行耐药质粒接合、药物敏感试验,并采用PCR分析接合子及其子代的耐药基因型、传代稳定性. 结果鲍氏不动杆菌通过接合将其携带对磺胺甲恶唑、氨苄西林、头孢噻吩、头孢博肟、头孢呋辛、亚胺培南/两司他丁和氨苄西林/舒巴坦的耐药性质粒及3种耐药基因传递给受体菌(例如经接合,使受体菌对磺胺甲恶唑的最低抑菌浓度>2 mg/L),且可稳定传代. 结论鲍氏不动杆菌质粒上携带可接合传递并稳定传代的β内酰胺酶基冈(blaTEM-1、blaPER-1、blaOXAS-23),是烧伤感染后其具有多重耐药性的分子生物学机制之一.     

转化生长因子-β1基因转染骨髓基质细胞的瞬时表达与稳定表达

目的 探讨转化生长因子-β1（TGF-β1）基因转染骨髓基质细胞（BMSCs）的表达能力。方法 取6周龄新西兰白兔BMSCs,传代培养后以3μl阳离子脂质体（Lipofectamine):1μg pcD-NA3J-TGF-β1的比例转染,通过免疫组织化学染色及图像分析对3组15份样本检测TGF-β1表达水平;利用水貂肺上皮细胞生长抑制法检测TGF-β1生物活性,分析转染的量效关系和时效关系。结果 瞬时表达组转染后48h免疫组织化学染色部分细胞呈强阳性,稳定表达组全部细胞呈强阳性表达持续4周以上。图像分析显示转染细胞TGF-β1表达显著增强,与对照组比较差异有非常显著性（P＜0．01）。量效关系显示,在转染体系中pcDNA3-TGF--β1(μg）：阳离子脂质体（μl）为1：3时,TGF-β1表达效率最高;时效关系显示,稳定表达组TGF-β1表达活性较瞬时表达组更强。结论 TGF-β1基因转染可使BMSCs有效地表达活性TGF-β1而产生生物效应。     

增生性瘢痕内转化生长因子-β基因的表达

探讨转化生长因子-β_1(TGF-β_1),转化生长因子-β_3(TGF-β_3)及其Ⅰ-型受体(TBR Ⅰ)和Ⅱ-型受体(TBRⅡ)在不同形成时期的增生性瘢痕组织中的表达变化规律及其可能的生物学意义。用病理学技术检测增生性瘢痕和正常皮肤的结构特征后,提取16例不同发生时期的增生性瘢痕(4个月～11年)和8例正常皮肤组织的总 RNA 后,分离mRNA,用 RT-PCR 方法检测这4种基因在不同组织中的表达变化规律。TGF-β_1,TGF-β_3,TBR Ⅰ和 TBRⅡ基因在正常皮肤和增生性瘢痕组织中都有表达。TGF-β_1在不同类型的组织中表达差异不显著。与正常皮肤相比,TBR Ⅰ和 TBR     

大鼠胸腺素β4基因重组慢病毒载体的构建及体外表达

目的 构建大鼠胸腺素β4 (Tβ4)基因的重组慢病毒载体,转染293T细胞并观察Tβ4的表达.方法 从Genbank获取大鼠Tβ4基因序列,化学合成后连接入线性化慢病毒载体pGC-FU,得到重组慢病毒载体pGC-FU-Tβ4,将其转化细菌感受态细胞后行菌落聚合酶链反应(PCR)鉴定,对PCR鉴定阳性的克隆进行测序鉴定. pGC-FU- Tβ4、pHeIper 1.0、pHelper 2.0共转293T细胞,收集上清液浓缩后使用实时定量PCR(Real-time PCR)进行滴度检测.用所得病毒感染293T细胞后,Western blot检测Tβ4表达.结果 目的基因质粒酶切后琼脂糖凝胶电泳图谱示酶切片段大小为143 bp;菌落PCR结果示阴性转化子得到198 bp片段,阳性转化子得到333 bp片段;测序结果与预期相符合;Real-time PCR示所得病毒滴度约为2×109TU:Western blot示Tβ4转染组在33 KD处有特征条带.结论 成功构建大鼠Tβ4基因慢病毒载体pGC-FU- Tβ4,并建立慢病毒过表达系统.     

碳青霉烯类抗菌药物敏感性降低的肺炎克雷伯菌β-内酰胺酶基因的检测

目的 研究碳青霉烯类抗菌药物敏感性降低的肺炎克雷伯菌β-内酰胺类耐药基因的存在情况,为临床合理使用抗菌药物提供依据.方法 收集本院临床分离的6株对碳青霉烯类抗菌药物敏感性降低的Kp,采用特异性PCR扩增和序列分析检测β-内酰胺类耐药基因在碳青霉烯类抗菌药物敏感性降低的Kp中的存在情况,用E-test方法测定菌株的药敏情况.结果 经PCR扩增和DNA序列分析证实菌株Kp1、Kp2 、Kp3、Kp4、Kp5和Kp6均含DHA-1、CTX-M-14和KPC-2基因.Kp1同时含SHV-12基因,Kp2和Kp3同时含SHV-11基因,Kp4同时含CMY-2和SHV-12基因.Kp5和Kp6同时含SHV-2基因.6株Kp对厄他培南、美罗培南、头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡肟和头孢西丁均耐药,仅1株Kp对亚胺培南中介,其余菌株均耐药;2株Kp对氨曲南敏感,其余菌株均耐药;3株Kp对哌拉西林/他唑巴坦耐药,1株中介,2株敏感;4株Kp对左氧氟沙星敏感,2株耐药;3株Kp对阿米卡星和庆大霉素敏感,3株耐药.结论 碳青霉烯类抗菌药物敏感性降低的Kp均携带多种β-内酰胺类耐药基因,其菌株对临床常用抗菌药物的耐药性有很大差异,临床应根据药敏结果选用抗菌药物,以防治疗失败.     

表达小鼠B7-1基因的重组逆转录病毒载体构建及真核表达

目的：构建表达小鼠B7—1基因的重组逆转录病毒载体并在真核细胞中检测其蛋白表达。方法：PCR法获基因，定向克隆连接到逆转录病毒载体上，得到重组逆转录病毒载体，酶切法鉴定，真核细胞中检测蛋白表达。结果：酶切所得片段与所需相符，在真核细胞中检测到蛋白表达。结论：成功构建重组的逆转录病毒载体，为今后研究奠定了基础。     

表达转化生长因子βⅡ型受体胞外区-活化T细胞表达和分泌的调节因子融合基因重组腺病毒的构建与鉴定

目的 构建表达转化生长因子βⅡ型受体（TβRⅡ）胞外区一活化T细胞表达和分泌的调节因子（R-ANTES）融合基因重组腺病毒并鉴定其在肿瘤细胞的表达。方法 采用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）方法扩增小鼠TβRⅡ胞外区和RANTES基因，重叠PCR法扩增TβRⅡ胞外区-RANTES融合基因，将融合基因克隆至pDC316载体，采用AdMax Adenovirus Vector Creation试剂盒构建融合基因重组腺病毒载体，融合基因重组腺病毒按moi=100：1的比例体外感染小鼠肺腺癌L795细胞系，Western Blot方法检测感染后肿瘤细胞的蛋白表达。结果 RT-PCR正确扩增了440bpTβRⅡ胞外区、244bp RANTES基因，重叠PCR正确扩增了745bpTβRⅡ胞外区-RANTES融合基因，重组质粒融合基因-pDC316经酶切鉴定正确，与pJM17双质粒共转染获得表达融合基因重组腺病毒，病毒滴度为8×10^10pfu／ml，感染后的LA795细胞有相对分子质量为33000的蛋白表达。结论 成功构建表达TβRⅡ胞外区-RANTES融合基因重组腺病毒载体，为进行体内抗肿瘤基因治疗的研究创造条件。     

产超广谱β-内酰胺酶细菌感染防治专家共识

超广谱β-内酰胺酶（extended—spectrum β—lactamases,ESBLs）是肠杆菌科细菌对β-内酰胺类抗菌药物产生耐药的主要机制之一,其预防与治疗已成为临床医生需要面对的重要问题,但国内外缺少相关问题处理的指导性意见。《中华实验和临床感染病杂志（电子版）》编辑部和《医学参考报·感染病学频道》编辑部组织国内部分专家制定本《共识》,以对ESBLs相关问题的处理提供指导。     

人β神经生长因子基因真核表达载体的构建与表达

目的 构建人NGF-β基因真核表达载体并观察其在子鼠脊髓神经干细胞内的表达.方法 应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从人脑肿瘤旁组织总RNA中扩增出750 bp片段,将其克隆至真核表达载体pcDNA3中经酶切鉴定产生750 bp和5.2 kd)的片段,完成序列分析.分离培养E14子鼠脊髓神经干细胞,以非脂质体转染试剂FuGENE HD介导质粒peDNA3-hNGFb转染培养第3代的细胞,应用免疫细胞化学和Western blot鉴定NGF-β在细胞内的表达.结果 RT-PCR产物为750 bp的片段,重组质粒peDNA3-hNGFb经双酶切产生750 bp和5.2kd)的片段,测序结果与文献报道结果完全一致.免疫细胞化学、Western blot结果表明NGF-β能在细胞中正确表达.结论 成功构建了peDNA3-hNGFb真核表达载体,其转染的子鼠脊髓神经干细胞能正确表达NGF-β.     

产多种β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌的基因型研究

目的 研究医院感染肺炎克雷伯菌的β-内酰胺酶基因型.方法 连续收集从临床住院患者中分离的肺炎克雷伯菌,采用接合试验、PCR、PCR产物测序、等电聚焦试验、超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）确认试验等方法明确基因型.结果 共收集75株肺炎克雷伯菌,48株（64.0%,48/75）含β-内酰胺酶基因,其中ESBLs占52.0%（39/75）.在48株产酶菌株中,携带2种基因型的占35.4%（17/48）,携带3种基因型的占14.6%（7/48）,携带4种基因型的占10.4%（5/48）.CTX-M型β-内酰胺酶基因的检出率最高（30/48,62.5%）,其次为TEM型（26/48,54.2%）和SHV型（25/48,52.1%）.产DHA-1型AmpC酶的肺炎克雷伯菌有9株,且有8株与ESBLs并存.同时还检测到3株产KPC-2型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌.ESBLs表型确认试验结果的假阴性率为23.1%（9/39）.结论 医院感染肺炎克雷伯菌的β-内酰胺基因分布复杂,临床上呈多药耐药状态.     

β-连环蛋白及APC基因与肿瘤

目的：探讨β－连环蛋白和结肠腺瘤性息肉病（APC）基因的分子结构和功能特征以及其在肿瘤发生、发展的作用。方法：综述近年来有关β－连环蛋白和APC基因分子生物学以及与肿瘤学方面的研究。结果：β－连环蛋白和APC基因由于自身调节和相互调节异常，在肿瘤发生的早期表达异常增高，但与肿瘤的进展、转移关系似乎正相反。此外，β－连环蛋白和APC基因还可以调节p53、c-myc基因以及细胞周期蛋白D1等因子表达。结论：β－连环蛋白和APC基因在多种肿瘤的发生、发展中可能起着中心作用，并与其它癌／抑癌基因和因子相互产生调节作用。     

Livin基因siRNA重组表达载体的构建

目的构建针对人抑凋亡基因Livin的小干扰RNA（siRNA）重组表达质粒载体。方法通过分子克隆技术,设计并合成具有基因特异性的3组寡核苷酸片段,克隆到pmU6质粒载体,并经菌落PCR鉴定及测序鉴定,Livin的siRNA序列成功克隆到重组表达质粒载体中。结果经菌落PCR鉴定及测序鉴定证实,人Livin的siRNA序列成功克隆到表达载体中,插入序列正确。结论成功构建了Livin siRNA质粒表达载体,为后续研究降低或沉默Livin基因表达后能否有效抑制膀胱癌细胞增殖和促进细胞凋亡奠定了基础。     

重组腺病毒介导的β-神经生长因子基因转染大鼠内皮祖细胞的实验研究

[目的]探究携带β-神经生长因子(β-NGF)基因的重组腺病毒转染大鼠骨髓源内皮祖细胞(EPCs)的最佳感染复数(MOI),并从基因转录和蛋白合成两个水平上观察转染后EPCs对β-NGF基因的表达,探讨其对脊髓损伤后神经元细胞微环境的影响。[方法]密度梯度离心法分离、全骨髓贴壁法培养大鼠骨髓源EPCs,免疫荧光法检测EPCs特异性表面分子CD34、CD133和VEGFR-2的表达。用不同MOI值的携带β-NGF基因和绿色荧光蛋白基因(GFP)的重组腺病毒转染EPCs,确定最佳的MOI值。用携带β-NGF基因的重组腺病毒转染的细胞为β-NGF基因组,用空载的重组腺病毒转染的细胞为空载组,未转染的细胞为空白组。RT-PCR法、Western blot法和ELISA法检测β-NGF的表达。[结果]成功分离、培养出大鼠骨髓源EPCs,特异性表面分子CD34、CD133和VEGFR-2经鉴定呈阳性表达;携带β-NGF基因的重组腺病毒转染EPCs最佳的MOI为70;转染成功的细胞β-NGF基因在m RNA和蛋白两个不同的水平上表达都升高,并持续向细胞外分泌。[结论]携带β-NGF基因的重组腺病毒可成功转染EPCs,成功转染β-NGF基因的细胞能持续向细胞外分泌有活性的β-NGF蛋白。     

泛耐药鲍曼不动杆菌PBP1A、CarO及β-内酰胺酶的编码基因分析

目的了解一株泛耐药鲍曼不动杆菌（js01株）可能存在的β-内酰胺类药物耐药机制。方法对自2011年12月宁波市第一医院住院患者的痰样本js01株分离,用gyrA和parC基因PCR扩增、测序和BLASTn比对确认菌种。用PCR法分析33种β-内酰胺酶基因（13种A类酶基因、10种B类酶基因、2种C类酶基因、8种D类酶基因）和插入序列与β-内酰胺酶编码基因连锁检测以及CarO膜孔蛋白编码基因。再用分段PCR法扩增PBP1A编码基因,双向测序后拼接成全长序列。结果js01株检出β-内酰胺酶TEM-1、ADC-30、OXA-23和OXA-66编码基因。插入序列与β-内酰胺酶编码基因连锁检测显示ISabal-ADC-30和ISabal—OXA-23为阳性。js01株carO基因序列与鲍曼不动杆菌敏感株（SDF）相比存在有义突变,氨基酸序列一致率为76．0％（189／249）,存在3个氨基酸缺失。is01株PBP1A编码基因序列与SDF株相比存在有义突变,氨基酸序列的一致率为99．6％（848／851）,存在3个氨基酸变异,但js01株PBP1A蛋白分子立体结构比SDF株丢失2个螺旋结构。结论本株鲍曼不动杆菌对β-内酰胺类药物耐药主要与该菌株管家基因（PBP1A、CarO编码基因）突变与可移动遗传元件介异的β-内酰胺酶编码基因有关。     

耐热β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达

将来自嗜热脂肪芽孢杆菌IAM 110 0 1的高温乳糖酶基因bgaB亚克隆到具强启动子的大肠杆菌载体 pKK 2 2 3 3中 ,经IPTG诱导后 ,表达出的重组蛋白质仍具有耐高温活性 ,其相对分子质量与天然蛋白质相似 ,表达量为 1.5U/mg ,比出发菌株高 10倍     

β-环连蛋白基因在肾癌中的表达及其突变分析

目的 探讨β－环连蛋白（β－ｃａｔｅｎｉｎ）基因在肾癌中表达，分散其突变情况。方法 应用ＲＴ－ＰＣＲ，ＳＳＣＰ及酶切的方法对２６例肾癌标本进行了研究。结果 ２６例肿瘤标本中β－ｃａｔｅｎｉｎ在ｍＲＮＡ水平并无过表达，而且未见突变发生。结论β－ｃａｔｅｎｉｎ基因在肾癌细胞内的高表达不是由于其生成增多，而是降解减少。     

α-防御素基因和β-防御素基因在外周血白细胞中的不同表达

目的 观察健康人外周血白细胞中α-防御素和β-防御素基因表达的阳性率及外周血白细胞中α-防御素和β-防御素两大家族基因表达的特征，探讨其在感染免疫中的作用。方法51名献血员被随机纳入研究中，在体外用100ng／ml内毒素刺激其外周血白细胞，采用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定O、1、3、6、12、24h时白细胞防御素信使RNA(mRNA)的水平，DNA印迹分析和序列测定法证实核苷酸扩增产物的特异性。结果 在无刺激时，所有研究对象的外周血白细胞均检测到α-防御素1-3mRNA的转录，而无阻防御素mRNA的转录。内毒素刺激3h后，88．2％研究对象的外周血可检测到β-防御素1 mRNA的转录，39．2％β-防御素2mRNA表达阳性，并于刺激6h时β-防御素1和2mRNA水平达到峰值，而α-防御素1-3mRNA的水平并无显著性改变。α-防御素1-3基因在外周血白细胞中呈持续性表达。而β防御素1-2呈可诱导性表达，β防御素1和2基因的可诱导性表达存在个体间差异。结论 α-防御素和阻防御素的不同表达特征与其基因调控顺式作用成分不同有关，提示两大类防御素在感染免疫中具有不同的作用。