丙型肝炎病毒包膜蛋白E2的原核表达及鉴定

【目的】构建丙型肝炎病毒（HCV）包膜蛋白E2基因的重组原核表达质粒，并获得E2蛋白的高效表达。【方法】通过RT-PCR法从HCV RNA阳性的血清标本中扩增出HCVE2区基因595bp，PCR产物分别经BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切后连接到经同样酶切的原核表达载体PET22b（＋）上，转化大肠杆菌DH5α菌株，获得阳性重组质粒PETB，阳性质粒转化BL21（DE3），IPTG诱导表达，表达产物经SDS-PAGE和Westemblot鉴定。【结果】成功地克隆了HCVE2区基因，构建了其原核表达质粒，并在BL21（DE3）菌中表达HCVE2重组蛋白，Western blot显示表达蛋白具有抗原性。【结论】HCVE2重组蛋白的表达和鉴定为进一步了解HCV糖蛋白E2的功能及其与CD81二者的相互关系打下基础。     

H9N2亚型禽流感病毒ns1基因克隆

目的克隆A／Duck／Shantou／2088／01（H9N2）亚型禽流感病毒ns1基因，构建重组融合表达载体。方法采用常规PCR方法扩增ns1基因cDNA，将扩增产物克隆入GST融合表达载体pGEX-4T-3中，构建重组质粒pGEX-4T-3／ns1，转化BL21（DE3）宿主菌；采用EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切和序列分析鉴定插入的ns1，基因；并用IPTG诱导工程菌，SDS—PAGE及Western blotting分析融合蛋白的表达。结果双酶切鉴定表明，ns1基因已正确克隆到GST融合表达载体中，测序结果证实ns1基因序列与目的基因序列完全一致。SDS—PAGE电泳显示，融合蛋白在BL21（DE3）工程菌中以可溶形式表达，重组融合蛋白GST—NS1的表达量占菌体总蛋白的20％左右。经Western blotting分析证实，重组融合蛋白可以被GST特异性抗体所识别。结论本实验成功克隆了H9N2亚型禽流感病毒ns1基因，构建了融合表达载体，并进行了融合蛋白的诱导表达，为进一步研究NS1蛋白在流感流行中的作用打下基础。     

丙型肝炎病毒包膜蛋白E2的原核表达及鉴定

 【目的】构建丙型肝炎病毒（HCV）包膜蛋白E2基因的重组原核表达质粒，并获得E2蛋白的高效表达。【方法】通过RT-PCR法从HCV RNA阳性的血清标本中扩增出HCVE2区基因595bp，PCR产物分别经BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切后连接到经同样酶切的原核表达载体PET22b（＋）上，转化大肠杆菌DH5α菌株，获得阳性重组质粒PETB，阳性质粒转化BL21（DE3），IPTG诱导表达，表达产物经SDS-PAGE和Westemblot鉴定。【结果】成功地克隆了HCVE2区基因，构建了其原核表达质粒，并在BL21（DE3）菌中表达HCVE2重组蛋白，Western blot显示表达蛋白具有抗原性。【结论】HCVE2重组蛋白的表达和鉴定为进一步了解HCV糖蛋白E2的功能及其与CD81二者的相互关系打下基础。     

丙型肝炎病毒F蛋白原核表达载体的构建、表达和纯化

目的:构建丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)F蛋白的原核表达载体,表达pET32a(+)-HCVF融合蛋白.方法:根据丙型肝炎病毒F基因的全序列设计引物,以HCV1a型cDNA质粒H/FL为模板,通过PCR方法扩增得到F基因的编码区序列,将其定向克隆于含有6×His tag的原核表达载体pET32a(+),转化大肠杆菌JM109,经菌落PCR筛选,双酶切和测序鉴定阳性克隆后,转化大肠杆菌BL21,采用IVTG诱导表达融合蛋白,表达产物经SDS-PAGE电泳分析和Western-blot检测鉴定,并用Ni-NTA亲和层析柱纯化.结果:F基因以正确的方式插入到pET32a(+)载体中,重组质粒转化大肠杆菌BL21后经IPTG诱导表达,出现了与预期分子量相符的蛋白条带,该蛋白通过Western blot检测具有6×His tag蛋白的免疫学活性.结论:成功构建了丙型肝炎病毒F蛋白的原核表达载体pET32a(+)-HCVF并表达和纯化出重组融合蛋白,为进一步研究F蛋白的生物学功能奠定了基础.     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因的克隆及其高效表达

目的在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白基因片段。方法利用PCR技术，扩增出357bp的HCV核心蛋白基因片段，双酶切后将其插入到原核表达载体pET-32a，构建重组表达质粒pET-32a／HCVc。转化到大肠杆菌BL21中，IPTG诱导表达。SDS-PAGE鉴定表达情况，Western blot鉴定表达产物的抗原性。结果 经IPTG诱导后获得了目的蛋白的融合表达；SDS—PAGE电泳显示其在32000处有一条融和表达条带；Western blot结果显示其具有HCV抗原特异性。结论 HCV核心蛋白在大肠杆菌中获得高效表达，而且表达产物有良好的抗原性。     

人CIDE-3基因原核表达载体的构建及蛋白的初步表达

目的：构建人CIDE-3基因的原核表达载体，并在E．coli BL21（DE3）中表达．方法：提取人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞的总RNA，经RT—PCR扩增人CIDE-3基因片段，并将其克隆入原核表达载体pET28a（＋）中，构建重组质粒pET28a（＋）-CIDE-3.经限制性内切酶Bam H I、Xho I双酶切鉴定及序列测定后，转化E．coli BL21（DE3），经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白．     

pGEX-5X-1-hLMO4原核质粒构建及重组蛋白表达

目的:构建hLMO4的原核表达载体并诱导、纯化和鉴定其表达。方法:hLMO4全长编码基因经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后,克隆至GST融合表达载体pGEX-5X-1,异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)在BL21大肠杆菌中诱导GST-hLMO4融合蛋白表达,利用Glutathione Sepharose 4B纯化诱导的融合蛋白,并经Western blot鉴定结果。结果:hLMO4编码序列克隆至pGEX-5X-1载体中,双酶切鉴定片段大小为500 bp,在E.coli BL21中IPTG诱导融合蛋白的表达,分子质量约为49 000 Da,成功纯化出GST及GST-hLMO4蛋白,Western blot检测到蛋白表达。结论:构建了hLMO4基因原核表达载体,鉴定了GST-hLMO4融合蛋白表达。     

稳定表达含HBV多表位短肽的杂合HBc颗粒的重组NS-1细胞株的筛选与鉴定

目的建立稳定表达含HBV多表位短肽的杂合HBc颗粒的重组NS-1细胞株。方法将以HBV多表位复合基因取代脊区基因的杂合HBc真核表达质粒转染NS-1细胞,经G418及亚克隆筛选高表达阳性细胞株,并以RT-PCR、ELISA、间接免疫荧光及Western blotting等方法检测、鉴定重组细胞表达产物。结果筛选所得稳定表达细胞株经RT-PCR、ELISA、间接免疫荧光及Western blotting等方法检测均呈阳性反应,而阴性对照及空白对照未出现相应阳性反应。结论筛选获得稳定表达含HBV多表位短肽的杂合HBc颗粒的重组细胞株,命名为NS/HBc-Mep。为建立HBc-Mep特异的cELISA及CTL活性测定等实验方法提供可靠的靶细胞。     

金黄色葡萄球菌肠毒素A基因的克隆及原核表达

目的从分离培养的金黄色葡萄球菌中提取肠毒素A(SEA)基因,亚克隆入表达载体pET-28a(+),诱导融合蛋白的表达,为肠毒素A应用研究奠定基础。方法根据GenBank中SEA的序列,设计一对特异性引物,以金黄色葡萄球菌DNA为模板PCR扩增SEA,纯化DNA进行BamHⅠ、XholⅠ双酶切鉴定及测序鉴定,并与做相应酶切的pET-28a(+)连接,转化大肠杆菌BL21,并对质粒进行双酶切鉴定及基因序列分析,用IPTG诱导融合蛋白的表达,His标签单克隆抗体进行免疫印迹验证融合蛋白的表达。结果以金黄色葡萄球菌DNA为模板,成功扩增了SEA基因,基因大小为774bp,重组PET-28a(+)-SEA双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示SEA在正确读框中,序列比对分析显示其与相关报道核苷酸序列一致性达99.9%。经IPTG诱导后,SDS-PAGE可见pET-28a(+)-SEA/BL21在相应分子量(约30000Mr)条带大量表达,免疫印迹能检测到目的蛋白条带,说明其与His标签融合表达。结论克隆了金黄色葡萄球菌SEA基因,并成功在大肠杆菌BL21中融合表达,为肠毒素A应用研究奠定了基础。     

稳定表达含HBV多表位短肽的杂合HBc颗粒的重组NS—1细胞株的筛选与鉴定

目的 建立稳定表达含HBV多表位短肽的杂合HBc颗粒的重组NS—1细胞株。方法 将以HBV多表位复合基因取代脊区基因的杂合HBc真核表达质粒转染NS—1细胞，经G418及亚克隆筛选高表达阳性细胞株，并以RT-PCR、ELISA、间接免疫荧光及Western blotting等方法检测、鉴定重组细胞表达产物。结果 筛选所得稳定表达细胞株经RT—PCR、ELISA、间接免疫荧光及Western blotting等方法检测均呈阳性反应。而阴性对照及空白对照未出现相应阳性反应。结论 筛选获得稳定表达含HBV多表位短肽的杂合HBc颗粒的重组细胞株，命名为NS／HBc-Mep。为建立HBc-Mep特异的cELISA及CTL活性测定等实验方法提供可靠的靶细胞。     

重型病毒性肝炎的血清病原学研究

为了解重型病毒性肝炎（重肝）的病原分型及其与预后的关系，应用酶联免疫法对120例重肝患者进行了甲型肝炎病毒抗体（抗-HAV）IgM、HBV标志（HBVM）、丙型肝炎病毒抗体（抗-HCV）的检测。结果显示：抗HAV－IgM阳性19例（15．8％）；HBVM阳性90例（75．0％）；抗-HCV阳性29例（24．2％），其中19例合并HBV感染，单纯抗-HCV阳性6例；三型病毒标志阴性者16例（13．3％）。乙型重肝较甲型重肝、丙型重肝病死率高。慢性重肝、急性重肝较亚急性重肝预后差。HBV复制标志阳性患者预后较差。提示HBV是本地区重肝的主要病原，且预后较差。     

洛阳市城乡幼儿园儿童蛲虫感染情况调查

目的：了解洛阳市城乡儿童蛲虫感染情况并为该病的防治提供依据。方法：采用透明胶纸拭子法，将透明胶纸粘贴于受检者肛门周围后取下贴在玻片上显微镜下检查虫卵。结果：城市和农村儿童蛲虫感染率分别为２１７３％和６５５７％，两者有显著性差异（Ｐ＜００１）。男女儿童感染率分别为４６４５％和４３９８％，两者无显著性差异（Ｐ＞００５）。城市儿童各年龄组感染率为５７１％～２８．００％，其中４岁组儿童感染率最高为２８％。农村儿童各年龄组感染率为６２７％～６７．２％，各年龄组间无显著性差异（Ｐ＞０．０５）。结论：农村儿童感染率显著高于城市儿童，男女儿童之间无明显差别。     

Detection of hepatitis G virus RNA in hepatitis C patients and hepatitis C virus infected hemodialysis patients

AlthoughsensitiveandspecificimmunoassayandmolecularbiologicaltechniquesforthedetectionofthehepatitisA--Evirusesareavailable,theetiologyofasubstantialfractionofpost--transfusionandcommunity--acquiredhepatitiscasesremainsundefined[1],suggestingtheexistenceofadditionalcausativeagents.Anewhumanhepatitisviruswasisolatedbytwoindependentgroups.ThenewvirusisprovisionallydesignatedashepatitisGvirus(HGV)[ZJorGBvirusC(GBV~C)[3'4),whichwasthoughttobetheagentofpartofthenon--A--Ehepatitispatients.Fro…     

血清抗HCV-IgG、HBsAg阳性对孕产妇、胎婴儿的影响

随机对991例临产妇和999份脐带血进行了血清学丙型肝炎病毒抗体(抗HCV-IgG)及乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的检测.发现62例母亲抗HCV-IgG阳性,检出率6.26%,其新生儿脐带血28份抗HCV-IgG阳性,检出率为45.16%;74例母亲HBsAg阳性,检出率7.47%,其新生儿31份脐带血HBsAg的阳性,检出率41.89%;4例母亲抗HCV-IgG及HBsAg均阳性,检出率为0.40%.上述3组产后出血发生率均明显高于对照组(P<0.05);抗HCV阳性组与HBsAg阳性组之间对妊娠.分娩及围产儿影响无差别;汉族HBsAg阳性率高于维吾尔族,但不同民族抗HCV阳性的发生率无差异.     

输血前患者血清感染性指标的检测与分析

目的:了解输血前患者血清各项感染性指标的阳性率,及早发现阳性患者,避免医疗纠纷的发生.方法:采用酶联免疫法对输血前患者7318例进行乙型肝炎表面抗原(HBsAg),抗丙型肝炎病毒(HCV)抗体,及抗人类免疫缺陷病毒(HIV)检测.同时应用甲苯胺红颗粒凝集试验(TRUST)进行梅毒的筛选试验.结果:7318例患者中HBsAg阳性患者751例(10.26%),抗-HCV阳性患者210例(2.87%),梅毒阳性患者50例(0.68%),抗-HIV阳性患者5例(0.072%).结论:输血前患者血清感染性指标有一定比例的阳性率,应严加关注.     

新疆肝病患者HDV、HBV感染的免疫组化研究

作者以直接酶标法及过氧化物酶-抗过氧化物酶法(PAP法)对145例新疆各类肝病患者的肝组织进行HDV、HBV感染的免疫组化研究,各类标本中,HBsAg及HBcAg的合计检出率为39.3％,HDAg在HBV血清学标记阳性患者肝组织中的检出率为3.5％。胞浆型HBcAg表达多见于肝组织病变明显区域,HDAg在肝炎后肝硬化组的检出率明显高于HBV感染非肝硬化组(P<0.025),提示肝炎后肝硬化与HDV感染有关。     

HBV阳性肝病者肾组织内HBSAg和HBCAg的形态研究

从尸检材料中获得３０例ＨＢＶ阳性的肝组织，观察其组织学，并进行ＨＢＳＡｇ、ＨＢＣＡｇ的免疫组化染色。根据ＨＢＡｇ的染色形态，将其分成两类：反映病毒活跃复制的第一类（１８例）；病毒可能呈整合状态的第二类（１２例）。同时检测肾组织内ＨＢＳＡｇ和ＨＢＣＡｇ的表达情况，其ＨＢＡｇ阳性者１２例，阳性率为４０．０％。其中肾小球阳性者１０例，分布主要在系膜区和沿毛细血管袢，也有核内ＨＢＣＡｇ表达；肾小管ＨＢＡｇ阳性１２例，其中ＨＢＳＡｇ阳性１１例，形态有膜型、弥漫型、周边型和包涵体样型，ＨＢＣＡｇ阳性５例，形态有弥漫型、膜型或伴间质分布及核内表达。肾小管ＨＢＡｇ表达与肾小管和肾间质病变有关。     

Allele polymorphisms of interleukin-lO and hepatitis B,C virus infection

Background Interleukin 10 （IL-10） is an important cytokine with anti-inflammatory, anti-immune and anti-fibrotic functions. This study aimed at evaluating the relationship between allele polymorphisms in the IL-10 promoter region and hepatitis B virus （HBV） or hepatitis C virus （HCV） infection. Methods The odds ratios （ORs） of IL-10 allele distributions in patients with HBV or HCV infection were analyzed against healthy controls. All the relevant studies in PubMed were identified, and poor qualified studies were excluded. The meta-analysis software REVMAN 4.2 was applied for investigating heterogeneity among individual studies and summarizing all the studies. The publication bias was also evaluated. Results This study demonstrated a significant association between the IL-10-592 A/C polymorphism and HBV infection in the Asian population under the overall effect size of allele A versus C. In our subgroup meta-analysis, we found a significant association of IL-10-592 A/C polymorphism to HCV infection susceptibility in Asian populations, although sensitivity analysis showed that the combined result was not associated with the worldwide population. Other IL-10 allele polymorphisms were not associated with HBV or HCV infection. Conclusion IL-10-592 A/C allele might be a risk factor for HBV or HCV in Asians but not in Europeans.     

我国不同地区各型肝病肝组织中HDV感染状态的研究

应用直接酶标法对来自全国17个地区的2346份肝组织标本进行了肝内HDAg的检测,1764份HBsAg阳性标本中有167份检出HDAg,检出率为9.47％。各大地区HDAg检出率无显著性差异。肝内HDAg的检出率与病理类型有关,慢性肝病和重症肝炎中HDAg检出率较高。提示:HDV感染与疾病的活动性及慢性化有关。对HDV与HBV复制关系的研究表明:HDV可以抑制HBV的复制,但两者也可同时复制,其机理尚不清楚。