胚胎大鼠神经干细胞分离培养的实验研究

目的探讨胚胎大鼠神经干细胞的分离培养方法,并对其进行鉴定。方法从胚胎大鼠脑组织中分离神经干细胞,采用无血清培养技术,在生长因子的作用下使其在体外不断增殖克隆,同时利用免疫荧光染色的方法对培养的细胞进行鉴定。结果体外培养的细胞增殖成细胞克隆球并能稳定传代,经鉴定,均为nestin染色阳性细胞。结论利用无血清技术和特定生长因子,可以使来源于胚胎大鼠的神经干细胞在体外扩增并稳定传代。     

大鼠胚胎神经干细胞的体外培养及鉴定

目的探讨大鼠胚胎神经干细胞（NSC）的体外培养和诱导分化的条件和特点。方法从孕14～16d的大鼠胚胎脑皮质中分离NSC，在表皮生长因子、碱性成纤维生长因子和B27联合作用下使其稳定增殖，并用10％的胎牛血清诱导其贴壁分化，应用免疫荧光染色方法行巢蛋白（Nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、Gale-C免疫荧光染色，对NSC及其分化的细胞进行鉴定。结果体外培养的NSC增殖成神经干细胞球并传代，鉴定为Nestin染色阳性细胞，并可诱导分化为神经元细胞（NSE染色阳性细胞）、星形胶质细胞（GFAP染色阳性细胞）和少突胶质细胞（Gale-C染色阳性细胞）。结论采用无血清培养基中加入特定生长因子的培养技术，可培养出在体外稳定增殖并有多向分化潜能的大鼠胚胎NSC。     

SD大鼠胚胎神经干细胞分离、培养及鉴定

目的 体外培养并鉴定神经干细胞，为相关实验研究奠定基础。方法 分离SD大鼠胎鼠的间脑，加入神经生长因子EGF和bFGF在神经干细胞条件培养基中克隆培养。用免疫细胞化学方法鉴定分离的神经干细胞。结果 分离培养的细胞具有不断增殖的能力，表达神经巢蛋白（nestin），并能经过诱导分化为神经元和神经胶质细胞。结论 成功建立了神经干细胞的分离培养方法，可用于进一步的实验研究。     

胚鼠室管膜及成鼠骨髓神经干细胞分离培养及分化鉴定实验研究

目的 :探寻胚鼠室管膜和成鼠骨髓分离培养神经干细胞 (NSC)的可行性。方法 :将分离的胚脑室管膜组织或成年骨髓细胞分别特殊培养。以细胞克隆及免疫细胞化学方法判断NSC增殖并鉴定NSC、神经元和神经胶质细胞。结果 :两种组织来源细胞在相应培养条件下NSC均有快速增殖。可得到具有长突起并建立有网状联系的神经元及胶质细胞。结论 :由胚鼠室管膜和成鼠骨髓诱导分化NSC是可行的     

大鼠胚胎神经干细胞定位及干细胞克隆实验研究

目的：探索大鼠神经干细胞在胚胎脑内的分布特点,并用三种不同的方法对干细胞进行克隆化培养。方法：对胚龄16天左右的大鼠胚胎脑组织做连续冠状位冰冻切片,特异的抗nestin免疫组化染色,以显示干细胞在胚胎的分布特点。我们还把胚龄16天左右的胎鼠室管膜下脑进行原代及传代培养,传代的神经干细胞用三种方法有限稀释法,饲细胞克隆培养法,软琼脂克隆培养法进行克隆培养。结果：1．神经干细胞在胚胎的分布主要集中在胚胎发育的中轴部位如：脑室、脑室下区,中脑导水管周围。神经干细胞多表现为复层上皮样排列,细胞突起呈放射状伸向脑的表层并之与保持密切联系。有的干细胞在离室管膜较远处呈簇状分布好似群状迁移的干细胞群也好似干细胞的发生中心。2．干细胞的原代及传代培养显示：神经细胞易呈聚集状生长的特点及神经细胞的迁移性的生长特点,各细胞群之间有密切的纤维联系。3．神经细胞生长的细胞密度依赖效应与细胞之间的接触在生长发育中的重要作用。结论：神经干细胞在胚胎的分布主要集中在胚胎发育的中轴部位,软琼脂克隆法是一种成功的干细胞克隆方法。     

胚胎大鼠神经干细胞的体外培养与鉴定

目的利用无血清培养和细胞克隆培养技术从孕鼠(14 d)胚胎中分离出神经干细胞,并进行传代培养和诱导分化。 方法 采用免疫细胞荧光化学染色方法观察不同代数细胞克隆球中nestin、neuN、GFAP阳性细胞比例,鉴定培养的原代和传代的细 胞类型结果随着传代次数增加,克隆球中nestin阳性细胞的比例无明显变化(P>0．05),不同代数的神经干细胞克隆球诱导分化 后均有一定比例的neuN与GFAP阳性细胞。结论 证实从胚胎大鼠大脑皮层分离培养的细胞是神经干细胞,提示体外培养体系中 培养的神经干细胞可以长期传代并保持于细胞的特性。     

大鼠胎脑神经干细胞的培养分化及鉴定的实验研究

目的建立大鼠胎脑皮质神经干细胞的培养、扩增、诱导分化及鉴定的方法。方法选取孕14d胎鼠的大脑皮质作为细胞来源,在无血清培养基中添加B27、碱性成纤维细胞因子、表皮生长因子,建立胚胎神经干细胞的体外培养体系,用5%的胎牛血清诱导神经干细胞分化,用免疫荧光染色技术进行对神经干细胞及诱导分化细胞的鉴定。结果原代培养的神经干细胞折光性强,培养第2d开始形成细胞集落,第3d形成大的神经球。3～5代传代的细胞生长稳定。经胎牛血清诱导后第3d开始,神经球开始向周边发出突起,悬浮的细胞开始贴壁生长。原代及传代培养的神经球表达Nestin阳性,分化细胞分别表达NSE、GFAP和GALC阳性。结论应用无血清培养技术可在体外培养、扩增出神经干细胞。5%的胎牛血清可以诱导神经干细胞向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等成熟细胞分化。     

大鼠骨髓基质干细胞体外分离、培养及分化的相关实验研究

目的探索大鼠骨髓基质干细胞(BMSC)体外分离、培养及纯化的合适实验条件,并探讨其在体外定向诱导分化为神经元样细胞的可行性。方法通过密度梯度离心法从成年大鼠骨髓中分离出BMSC,而后通过贴壁培养法培养及纯化,观察其生长特性;对纯化后的BMSC使用碱性成纤维生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)进行定向诱导分化,并进行免疫细胞化学鉴定。结果体外培养的BMSC传4代后,纯度最高,可达(95.23±3.06)%;其诱导分化7 d后,(75.43±7.63)%的细胞表现为-βTubulinⅢ阳性的神经元样细胞,(33.01±6.73)%的细胞则为GFAP阳性的胶质细胞。结论BMSC在体外培养条件下生长良好,经bFGF和EGF诱导后可大量分化为神经元样细胞和神经胶质细胞。     

体外诱导人类胚胎干细胞定向分化为神经干细胞

目的 探索一种诱导人类胚胎干细胞（hESCs）向神经干细胞（NSCs）定向分化的简单高效的方法。方法 将hESCs在细菌培养皿中以无血清培养基悬浮培养形成拟胚体，进一步将成熟拟胚体打散、贴壁培养于含有B27和noggin等成分的特定培养基中，诱导其向神经干细胞定向分化。结果 悬浮于细菌培养皿中的hESCs不贴壁，进行性长大，7～10d形成成熟拟胚体；拟胚体在特定培养基中可诱导成高纯度（约96．4％）的nestin阳性细胞（即NSCs），进一步培养，这些细胞可分化成各种成熟的神经细胞。结论 该方法诱导hESCs向NSCs定向分化较文献报道耗时更短、费用低廉且效率更高，为进行细胞移植治疗神经系统相关疾病提供了很好的种子细胞来源。     

血清和雪旺氏细胞诱导大鼠胚胎神经干细胞分化的比较

目的 比较血清和雪旺氏细胞诱导大鼠胚胎神经干细胞分化的差异。方法 分别采用血清和与雪旺氏细胞共培养的方法诱导大鼠胚胎神经干细胞分化，应用相差显微镜和免疫荧光染色的方法对其进行观察和比较。结果 两种方法都能够诱导绝大多数神经干细胞分化成神经元，少量分化成星形胶质细胞和少突胶质细胞。虽然后一种方法诱导干细胞分化的进程比前一种方法要慢，但细胞形态学上更接近发育成熟的神经元。结论 雪旺氏细胞的分泌物不仅能够诱导共培养的神经干细胞分化，而且使其分化更加成熟。     

神经干细胞分化过程中c-myc内含子结合蛋白1与c-myc基因表达研究

目的研究神经干细胞分化为胶质细胞过程中c-myc内含子结合蛋白1(MIBP1)基因与c-myc基因的表达变化。方法从孕16d胚胎鼠脑组织中分离神经干细胞,以专用培养基IMDM(含有B27添加剂,重组人上皮生长因子、重组人碱性成纤维细胞生长因子-2、L-谷氨酸和黄体酮)进行培养。应用胶原及含10%胎牛血清、抗生素的分化培养基,诱导细胞向胶质细胞及神经元方向分化,第1天细胞贴壁启动分化,第7天明显分化,第14天进入终末分化。经过振荡处理,进一步得到纯化星形胶质细胞,采用胶质纤维酸性蛋白免疫组化方法鉴定细胞分化。分别提取分化前及分化后第1、7和14天神经干细胞的RNA,应用逆转录-多聚酶链反应方法检测神经干细胞中MIBP1与c-myc基因的表达,以β-actin作为内参照物,应用图像分析仪对电泳条带进行定量分析,观察两基因在神经干细胞分化中的作用。结果在神经干细胞分化过程中,MIBP1基因表达逐渐增强,其中未分化神经干细胞为(63.53±11.97)%,培养第1、7和14天表达率分别为(70.04±16.10)%、(79.09±15.40)%和(99.65±0.54)%。而c-myc基因表达呈逐渐降低,未分化神经干细胞为(99.76±7.62)%;培养第1、7和14天表达率分别为(75.20±12.33)%、(45.65±10.11)%和(33.31±4.34)%。两基因分别与相应未分化组比较,差异具有极显著性意义(均P<0.001)。星形胶质细胞纯化前后MIBP1基因表达量无明显变化。结论在神经干细胞分化为胶质细胞的过程中MIBP1基因表达逐渐增强,同时c-myc基因表达受到抑制。提示MIBP1基因与胶质细胞的分化过程相关,可能通过抑制c-myc基因的表达而实现调控作用。     

骨髓间充质干细胞神经分化的体内外研究

目的研究骨髓间充质干细胞在体内外向神经细胞分化的潜能。方法(1)分离培养：从水囊引产胎儿的四肢骨中分离培养骨髓基质细胞，再通过贴壁方法将间充质干细胞从骨髓来源的单个核细胞中分离出，利用流式细胞仪进行间充质干细胞免疫表型测定。(2)体外分化观察：将间充质干细胞在二甲基亚砜(DMSO)和丁羟茴醚(BHA)中作用5h后，行神经元特异性烯醇化酶、神经微丝等免疫组化染色。(3)体内分化观察：将用5一溴脱氧尿核苷(BrDU)标记的间充质干细胞通过立体定向的方法移植于顶叶皮质区，然后再行烯醇化酶、神经微丝及胶质纤维酸性蛋白免疫组化染色。结果(1)生物学特性：间充质干细胞贴壁生长，细胞表现为梭形细胞形态，骨髓来源的间充质干细胞CD34、HLA—DR的表达为阴性，而CD44、CD29、CD13的表达为阳性。(2)体外分化：间充质干细胞在体外被DMSO／BHA处理后，胞浆向细胞核方向收缩，形成一个收缩的胞体，外周是细胞膜的突起，呈现出典型的神经元表型，并且免疫组化染色呈现神经元特异性烯醇化酶及神经微丝染色阳性。(3)体内分化：间充质干细胞被立体定向移植后，在移植部位可见BrDU染色阳性的细胞团，同时可见BrDU阳性细胞迁移到周围宿主的皮质中。免疫组化染色显示，在移植物中及邻近宿主皮质中的移植细胞呈神经元标记烯醇化酶染色阳性，星形细胞标记胶质纤维酸性蛋白染色阳性。结论问充质干细胞有能力分化为非间充质细胞，特别是神经元。     

突触蛋白-Ⅰ在胚胎干细胞体外神经分化过程中的表达变化

目的探讨突触蛋白-I（synapsin-I）在胚胎干细胞（ESCs）体外神经分化过程中的表达变化及作用。方法采用“五步法”和维甲酸（RA）法两种途径体外诱导ESCs向神经细胞分化，并以另一种可向神经细胞分化的肿瘤细胞-PC12细胞的诱导过程作参照，从不同的途径、不同的细胞进行比较．通过免疫组织化学、RT-PCR、Western blot方法观察这一过程中synapsin-I的表达变化．找出synapsin-I在ESCs向神经细胞分化过程中表达变化的共同规律。结果结合形态学和其它神经特异性指标的变化，synapsin-I在ESCs和PC12细胞向神经细胞分化的过程中具有早期即有表达，后逐渐升高，至分化成熟阶段达最高，后期又逐渐下降的变化规律。结论在ESCs的分化过程中，synapsin-I的表达存在特定的时空规律，并与ESCs的形态学改变相关，提示synapsin-I可能对ESCs在神经分化过程中的形态分化起着重要的作用。     

突触蛋白-Ⅰ反义寡核苷酸对胚胎干细胞体外神经分化过程的影响

目的 探讨突触蛋白-Ⅰ在体外诱导胚胎干细胞(ESC)向神经细胞分化过程中的作用,寻求这一过程的可调控点或调控切入点.方法 采用"五步法"体外诱导ESC向神经细胞分化,于不同诱导阶段转染突触蛋白-Ⅰ反义寡核苷酸,观察转染后ESC的形态学、分化效率及其他神经特异性蛋白表达的变化.同时以突触蛋白-Ⅰ反义寡核苷酸对PC12细胞诱导过程的影响作参照.结果 胚胎干细胞分化的第3阶段反义链组的突起伸长速度较正常组和正义链组减慢,分化的神经前体细胞[nestin(+)]比例较正常组和正义链组明显减少(68.5%±4.2% vs 76.2%±5.1%和75.8%±4.9%,P＜0.05).第4阶段反义链组所扩增的神经前体细胞[nestin(+)]比例较正常组和正义链组明显减少(75.1%±4.7% vs 90.2%±4.3%和88.7%±4.5%,P＜0.01).第5阶段反义链组细胞之间的联系较正常组和正义链组减少,神经元样细胞[MAP2(+)]的比例较正常组和正义链组减少(30.7%±3.2% vs 41.2%±2.7%和40.5%±2.4%,P＜0.05).PC12细胞反义链组于诱导第1、4、7、10天细胞突起长度均较正常组和正义链组短,细胞分化率(0.33%±0.46%、9.78%±3.47%、45.3%±7.98%和34.2%±5.89%)显著低于正常组(1.81%±0.40%、45.13%±4.17%、90.26%±4.68%和84.66%±4.81%)和正义链组(P＜0.01).结论 抑制突触蛋白-Ⅰ的表达可导致胚胎干细胞向神经细胞分化的进程滞后和神经分化效率降低,提示突触蛋白-Ⅰ在胚胎干细胞的体外神经分化过程中各阶段均起着重要的作用,可能参与了其中的调控机制.     

癫痫细胞悬液对海马干细胞分化的影响

目的 观察癫痫大鼠海马细胞悬液对海马干细胞分化的影响.方法 实验分为对照组、谷氨酸组(包括5 μmol/mL、25 μmol/mL2个亚组)、正常大鼠海马细胞悬液组(包括20μg/mL、40μg/mL 2个亚组)及癫痫细胞悬液组(包括20 μg/mL、40 μg/mL 2个亚组),分别向接种了海马干细胞神经球的96孔培养板内加入培养基、相应浓度谷氨酸、正常大鼠海马细胞悬液及癫痫细胞悬液,应用MTT法比较4组在分化第1、7、10、14天之间海马干细胞分化活力.结果随着分化时间的延长,各组MTT值均呈增加趋势.各浓度谷氨酸组及正常海马细胞悬液组细胞活力较对照组下降,而癫痫细胞悬液组的细胞活力较对照组轻微增加.但差异没有统计学意义(p>05).相同浓度的癫痫细胞悬液组与正常海马细胞悬液组之间 MTT值差异没有统计学意义(p>0.05).结论 癫痫细胞悬液未对海马干细胞的分化产生影响.     

成体神经干细胞诱导方案研究进展

近年来,研究人员致力于构建遗传和表型稳定的神经干细胞系,旨在恢复神经组织不可逆转的功能丧失从而满足临床需求。其中,成人体内维持其多能状态的干细胞也成为研究的焦点之一。随着诱导多能干细胞和体细胞直接转分化为所需细胞类型等技术的发展,基于使用来自胚胎或胎儿神经组织的同种异体神经干细胞的研究方法逐渐成为过去。本文围绕诱导干细胞和重编程体细胞的多能状态维持及诱导神经干细胞的实验方案做一综述。     

嗅鞘细胞对脂肪干细胞诱导分化的影响

目的 比较2种不同方法共培养脂肪干细胞后神经元特异性核蛋白(neuron specific nuclear protein,NeuN)的表达.方法 以transwell小室为共培养载体,实验组中将脂肪干细胞接种于上室,嗅鞘细胞接种于下室,对照组下室无嗅鞘细胞,只加入嗅鞘细胞条件培养液,共培养12 d后观察脂肪干细胞NeuN的表达.结果 共培养12 d后2组都有部分脂肪干细胞表达NeuN,实验组NeuN阳性率为303/345(87.8%),而对照组为120/320(37.5%),差异有统计学意义(χ~2=181.6,P＜0.05).结论 脂肪干细胞在与嗅鞘细胞共培养时更容易向神经元样细胞分化.     

诱导型多能干细胞在神经变性疾病中的作用

诱导型多能干细胞技术是一种通过新的体细胞重编程,将组织细胞转化为可多向分化的细胞即干细胞的技术。目前已将4种转录因子导入人体皮肤纤维母细胞,并首次成功诱导出诱导型多能干细胞。此项技术不但可以建立神经系统疾病动物模型,用于发病机制和致病基因的研究,而且可以开展移植研究,验证疗效及筛选药物。     

体外癫(癎)微环境下神经干细胞发育的初步研究

目的 探讨神经干细胞在癫痫微环境下能否发育为“癫痫神经元”。方法“无镁”外液处理神经元建立“癫痫神经元”模型。将绿色荧光蛋白标记的神经干细胞分别与正常海马神经元、“癫痫神经元”共培养，应用膜片钳记录干细胞的突触后电位，利用免疫荧光检测干细胞突触素抗体染色情况。将神经干细胞分化神经元放入“无镁”外液，应用膜片钳记录其突触后电位。结果 在“无镁”细胞外液处理3h后恢复正常细胞外液培养14d，神经元仍存在自发的“癫痫样放电”。干细胞与“癫痫神经元”共培养时，免疫荧光结果示80％干细胞突触素染色阳性，膜片钳记录到干细胞12次／5min兴奋性突触后电位。在“无镁”外液中，60％干细胞分化神经元出现14次／5min时程约10s的兴奋性突触后电位，未记录到“癫痫样放电”。结论 干细胞能够与周围神经元形成功能性突触；干细胞在癫痫微环境下转变成“癫痫神经元”的可能性极小。