E-选择素及其配体SLeX介导大肠癌早期黏附的观察

目的:探讨E-选择素及其配体SLeX在大肠癌LoVo细胞与血管内皮细胞ECV304早期黏附中的作用.方法:采用SP法观察E-选择素在内皮细胞ECV304及LoVo中的表达;采用活性染料玫瑰红摄入法检测E-选择素及其配体SLeX在大肠癌LoVo细胞与TNF-α激活内皮细胞ECV304早期黏附中作用.结果:E-选择素和SLeX分别在ECV304和LoVo细胞膜及细胞质内有明确的阳性表达;血管内皮细胞ECV304被TNF-α激活后,其与LoVo细胞间的黏附较激活前明显增加,且具有浓度及时间的依赖性,P＜0.001;用不同浓度的抗E-选择素单抗处理血管内皮细胞ECV304,或用其配体SLeX单抗处理肿瘤LoVo细胞后,随着E-选择素单抗、SLeX单抗浓度增加,细胞相对黏附率逐渐降低(P＜0.001),阻断率逐渐增加(P均＜0.05),提示E-选择素单抗、SLeX单抗可阻断大肠癌细胞与血管内皮细胞间黏附.结论:E-选择素和其配体SLeX是介导血管内皮细胞与大肠癌LoVo细胞系黏附反应的主要早期黏附分子.     

内皮生长抑制素对血管内皮细胞和成纤维细胞的生物学作用

目的 研究重组人内皮生长抑制素对人脐静脉内皮细胞（ECV304细胞）和成纤维细胞（WI－38细胞）的增殖抑制作用和诱导细胞凋亡作用,探讨内皮生长抑制素抑制细胞增殖的有效性、特异性和可能的作用机制。方法 将细胞在含有内皮生长抑制素的培养液中孵育一定时间,观察其形态,并用MTT法测定细胞的增殖抑制率和ELISA法定量检测细胞凋亡程度。结果 重组人内皮生长抑制素可显著抑制ECV304细胞的增殖,其作用呈剂量依赖性,ED50约15－20μg/ml,并能诱导ECV304细胞凋亡（富集因子2．44）;对WI－38细胞无增殖抑制作用和诱导细胞凋亡作用。结论 重组人内皮生长抑制素具有特异性抑制血管内皮细胞增殖作用,诱导细胞凋亡可能是其作用机制之一。     

SNX10对人结直肠癌细胞增殖和EGFR表达的影响

目的:探讨SNX10过表达对人结直肠癌细胞增殖和EGFR表达的影响.方法:应用基因转染方法将SNX10质粒导入结直肠癌细胞LOVO细胞中,蛋白质印迹法方法鉴定转染后SNX10在细胞中的表达.利用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测SNX10对结直肠癌细胞增殖的影响,利用蛋白质印迹法和免疫荧光法观察EGFR表达量和定位情况.结果:蛋白质印迹法结果显示,SNX10质粒成功导入LOVO细胞中,SNX10的过表达使结直肠癌细胞增殖能力明显降低(F=16.76,P＜0.01),EGF刺激后,过表达SNX10的细胞EGFR表达明显低于对照组,荧光定位显示SNX10和EGFR存在共定位关系.结论:SNX10通过调控EGFR表达使结直肠癌细胞增殖能力明显下降,SNX10可能是结直肠癌的增殖抑制基因.     

表观遗传学干预对结直肠癌细胞株p33ING1b基因表达及生物学特性影响

目的通过表观遗传学干预,研究p33ING1b启动子甲基化和组蛋白乙酰化状态、基因和蛋白的表达及其细胞增殖能力的改变,探讨结直肠癌中p33ING1b转录抑制的表观遗传机制。方法通过曲古抑菌素A及5-氮-2′-脱氧胞苷,对结直肠癌细胞株HT29、LOVO、HCT116和COLO205行恢复乙酰化和去甲基化干预,分单独用药组和联合用药组。RT-PCR结合Real-time qPCR方法检测其p33ING1bmRNA表达的变化,nMSP法分析其p33ING1b启动子甲基化状态的改变,ChIP法检测其p33ING1b乙酰化状态的改变,蛋白质印迹法检测p33ING1b蛋白的表达,MTT法检测细胞的增殖能力。结果曲古抑菌素A及5-氮-2′-脱氧胞苷可逆转结直肠癌细胞株的甲基化及乙酰化状况。2种药物干预后,4种结直肠癌细胞株各组间p33ING1bmRNA表达,差异有统计学意义,HCT116:F=1 690.446,P<0.001;HT29:F=284.474,P<0.001;LOVO:F=2 930.284,P<0.001;COLO205:F=33.540,P<0.001;p33ING1bmRNA蛋白表达差异有统计学意义,HCT116:F=32.606,P<0.001;HT29:F=33.422,P<0.001;LOVO:F=13.975,P<0.01;COLO205:F=7.119,P<0.05,细胞增殖能力差异有统计学意义,HCT116:F=7.327,P<0.05;HT29:F=17.642,P<0.001;LOVO:F=7.035,P<0.05;COLO205:F=9.008,P<0.01。联合使用两种药物对p33ING1bmRNA的表达具有协同作用。结论 p33ING1b基因甲基化和去乙酰化可抑制抑癌基因p33ING1b转录,使用甲基化抑制剂及去乙酰化抑制剂可逆转这一效应,且两者具有协同作用,这为表观基因治疗提供了新的思路。     

PTEN抑制人脐静脉内皮细胞ECV304的增殖和VEGF的表达

目的:探讨与张力蛋白同源的10号染色体缺失的磷酸酶基因(phosphatase and tensin hemology deleted on chromo-some ten gene,PTEN)对人脐静脉内皮细胞ECV304细胞增殖、凋亡,及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受体1(VEGF receptor 1,VEGFR1)的影响。方法:将携带有野生型PTEN及绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因的腺病毒Ad-PTEN-GFP及空载体腺病毒Ad-GFP感染ECV304细胞,MTT实验、Hoechst3342染色法及流式细胞术检测ECV304细胞的增殖和凋亡。实时荧光定量PCR法检测Ad-PTEN-GFP感染后ECV304细胞中PTEN、VEGF和VEG-FR1 mRNA表达水平,ELISA检测ECV304细胞培养上清中VEGF的水平。鸡胚尿囊膜(chick chorioallantoic membrane,CAM)血管生长实验检测PTEN对鸡胚血管生长的影响。结果:与Ad-GFP相比,Ad-PTEN-GFP感染能明显抑制ECV304细胞的增殖,诱导细胞凋亡,5 d时增殖抑制率可达(50.38±5.42)%、细胞凋亡率达(73.3±5.3)%。当感染复数为100时,Ad-PTEN-GFP组ECV304细胞的VEGF及VEGFR1 mRNA表达水平分别为未感染组的(13.40±1.32)%及(46.12±5.20)%。同时,Ad-PTEN-GFP感染能够明显抑制CAM体内血管生长[血管指数(57.6±3.37)%vs(92.2±4.37)%,P<0.05]。结论:PTEN能显著抑制人脐静脉内皮细胞ECV304的增殖、促进其凋亡,其机制可能与抑制VEGF和VEGFR1表达,抑制血管新生有关。     

miR-429靶向调控SIAH1基因对结直肠癌细胞LOVO增殖的影响

目的 探讨miR-429靶向SIAH1基因对结直肠癌细胞系LOVO细胞增殖的影响。方法 采用qRT-PCR检测正常结肠黏膜上皮细胞系NCM460和结直肠癌细胞系SW480、LOVO、HT-29中miR-429的表达。将miR-429 mimic和miR-429阴性对照序列（NC）转染至LOVO细胞,同时设置Control组。预测miR-429的靶基因并用双荧光素酶报告基因实验验证靶向关系。采用Western blot检测SIAH1蛋白的表达水平,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞周期分布情况。结果 qRT-PCR检测结果显示,相对于NCM460细胞,miR-429在各结直肠癌细胞系中的表达均降低（均P<0.001）。双荧光素酶报告基因实验证实了SIAH1与miR-429的靶向关系。与NC组相比,过表达miR-429能抑制LOVO细胞中SIAH1蛋白的表达（P<0.001）,细胞被阻滞在G0G1期,细胞增殖能力降低（P<0.001）。结论 miR-429通过靶向SIAH1基因表达抑制LOVO细胞增殖。     

人arresten因子对内皮细胞与LOVO细胞黏附的抑制

目的:观察人arresten因子对人脐静脉内皮细胞HUVEC与LOVO细胞黏附的影响,探讨与之相关的黏附分子表达的变化。方法:半定量RT-PCR检测arresten对人脐静脉内皮细胞表达血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)mrRNA的影响,Western-hlot检测VCAM-1蛋白表达的变化。孟加拉玫瑰红活细胞染色法观察arresten因子对内皮细胞与LOVO细胞黏附的影响。结果:RT-PCR及Western-blot结果表明VCAM-1在HUVEC细胞中高表达,但经过arresten因子处理的HUVEC细胞,其VCAM-1在mRNA水平及蛋白水平的表达均显著下降(P< 0．05)。孟加拉玫瑰红活细胞染色法显示arresten能抑制HUVEC细胞与LOVO细胞的黏附。结论:arresten因子通过降低内皮细胞VCAM-1的表达抑制内皮细胞与肿瘤细胞的黏附,这可能是其抑制肿瘤转移的一种途径。     

姜黄素抑制HeLa细胞诱导的血管内皮细胞增殖作用及其机制研究

目的:研究姜黄素对HeLa细胞诱导的血管内皮细胞增殖的抑制作用及其机制.方法:采用台盼蓝排染法计数人脐静脉内皮细胞系ECV304细胞,MTT法测定不同浓度姜黄素对ECV304细胞和HeLa细胞诱导的ECV304细胞增殖的抑制,采用RT-PCR和Western blot检测40 μmol/L姜黄素作用于HeLa细胞诱导的血管内皮细胞4、8、16和24 h后,血管内皮生长因子(VEGF)及其受体VEGFR2(KDR)基因及蛋白的表达.结果:姜黄素直接作用于ECV304细胞,其细胞计数较对照组显著减少(P<0.05),并呈浓度依赖性.MTT法测得不同浓度姜黄素作用后,可产生显著的细胞增殖抑制作用,48 h体外半数抑制浓度(IC50)值为(38.4±0.031) μmol/L.随着姜黄素浓度的增加,其时ECV304细胞和HeLa细胞诱导的ECV304细胞的增殖有明显的抑制作用,P值分别为0.000 0和0.000 1.姜黄素作用于HeLa细胞诱导的血管内皮细胞4、8、16和24 h后,能明显下调VEGF与KDR的mRNA和蛋白表达.结论:姜黄素能直接抑制血管内皮细胞的增殖,对HeLa细胞诱导的血管内皮细胞的增殖也有抑制作用.此作用可能是通过押制VEGF及其受体KDR的mRNA和蛋白表达来实现的.     

结直肠癌组织淋巴管密度和淋巴管内癌栓及VEGF-C表达的意义

目的:检测并比较结直肠癌及结直肠正常组织内淋巴管密度(LVD)和血管内皮生长因子(VEGF-C)的表达,并计数结直肠癌组织中淋巴管内癌栓(LVI),探讨其意义。方法:免疫组化法检测结直肠癌及相应的正常结直肠组织中LVD及VEGF-C的表达,计数结直肠癌组织LVI。结果:结直肠癌组织中的LVD明显高于正常结直肠组织,P=0.000。结直肠癌的LVD与LVI(P=0.001)及淋巴结转移(P=0.047)密切相关。LVI与TNM分期(P=0.017)及淋巴结转移(P=0.006)密切相关。结直肠癌组织中VEGF-C表达显著高于正常结直肠组织(P=0.000),且与肿瘤的TNM分期(P=0.029)及淋巴结转移(P=0.023)密切相关。结论:淋巴管的形成在结直肠癌的发生发展过程中起重要的作用。LVI及VEGF-C的表达可预测结直肠癌的侵袭性。     

肿瘤基质血管内皮细胞模型的建立及生物学特性研究

 目的 建立肿瘤基质血管内皮细胞模型并探讨其生物学特性。方法 用人卵巢癌细胞SKOV3培养上清液诱导人内皮细胞ECV304，获得能稳定生长的ECV304-SKOV3细胞。观察其形态改变，检测其生长情况，免疫细胞化学测定其增殖细胞核抗原(PCNA)、bcl-2、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、粘合素(TN)表达变化，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定其端粒酶活性，并分析其核型、蛋白合成能力、对常用抗癌药物的反应性。结果 ECV304-SKOV3细胞出现畸形核、有微绒毛的腔隙，染色体众数略有增加。细胞群体倍增时间较亲代细胞BCV304缩短；分裂指数增高；表达PCNA、bcL-2、MMP-9增强(t≥2．4671，P<0．05)，而TN减弱(t=2．2473，P<0．05)；S期细胞数增加，G0／G1期细胞数减少(x²=923．313，P<0．01)，增殖指数(PI)明显增高(x²=570．197，P<0．01)。对作用于S期或S期和M期的抗癌药物较ECV304敏感，且与SKOV3癌细胞一致(F≥24．14，P<0．01)。蛋白质合成能力增强(t=-12．2465，P<0．001)。端粒酶活性强于亲代细胞ECV304(t=-25．2990，P<0．001)。结论 DCV304-SKOV3细胞较亲代细胞DCV304增殖快，核型发生变化，存活能力强，功能活跃，某些血管形成因子表达增强，具有肿瘤基质血管内皮细胞的某些特性，可作为肿瘤基质血管内皮细胞模型用于进一步研究。     

新城疫病毒对血管生长的抑制作用

 目的 研究鸡新城疫病毒对血管的生长抑制作用。方法 采用小鼠肺癌转移模型观测鸡新城疫病毒（NDV）对癌细胞转移的影响及组织内微血管的生长情况；用体外药物敏感实验（MTT）检测NDV在不同剂量和作用时间下对人血管内皮细胞ECV304细胞的增殖抑制效应；用PI和Hoechst33342进行荧光染色检钡4NDV作用后细胞有无凋亡改变及其形态学变化。结果 NDV在体内可以有效抑制小鼠发生癌转移时组织内微血管的生成，在体外可以抑制ECV304细胞的增殖并导致较为轻微的凋亡现象。结论 体内外实验均表明NDV可以抑制肿瘤发生时微血管的生长，这一作用通过抑制血管内皮细胞的增殖而非直接的细胞毒作用实现，该作用机制可能与某种特定病毒蛋白有关，尚待进一步研究。     

舒林酸和吲哚美辛对人血管内皮细胞ECV304的生长抑制作用

目的：体外研究非甾体类消炎药对人血管内皮细胞的生长抑制作用。方法：采用舒林酸和吲哚美辛作用于人脐静脉内皮细胞株ECV304，并设置不同的作用浓度和作用时间，以体外药物敏感实验(MTT)检测舒林酸和吲哚美辛在不同浓度及作用时间下对ECV304细胞的增殖抑制效应；以流式细胞仪技术和Hoechst33258。荧光染色检测药物作用后细胞有无凋亡改变及其形态学变化。结果：舒林酸和吲哚美辛在体外对ECV304细胞均有显著的生长抑制作用，并且具有时间和剂量依赖性，舒林酸能显著诱导ECV304细胞产生凋亡。结论：舒林酸和吲哚美辛在体外具有良好的抑制人脐静脉内皮细胞株ECV304生长的作用，非甾体类消炎药能够诱导血管内皮细胞产生凋亡而抑制其生长，同时也可能存在其他的作用机制。     

An interesting change of E-selectin in cimetidine administration during anticancer drug use

E-selectin is an adhesion molecule developed as an important material for hematogenous metastasis of cancer cells on vascular endothelial cells. It is expected that if we can restrain a manifestation of E-selectin then hematogenous metastasis can be restrained. We divided gastric cancer and the colorectal cancer patients, who performed chemotherapy, into two groups of cimetidine administrated group and a non-administration group, and reviewed whether cimetidine inhibited an expression of E-selectin on vascular endothelial cells by measuring E-selectin in plasma. We experienced one example that showed an interesting change of E-selectin and the quantity of E-selectin in plasma fell during the cimetidine dosage. However, we report that E-selectin has risen after the cimetidine dosage was cancelled in the cimetidine administrated group.     

E-选择素介导肝癌细胞HepG2和内皮细胞的早期黏附

目的　探讨sLeX 和E 选择素在肝癌细胞与内皮细胞早期黏附中的作用 ,并筛选有临床应用前景的抗黏附药物。方法　应用荧光活细胞染料BCECF -AM标记HepG2肝癌细胞。应用体外黏附实验检测肝癌细胞HepG2和人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)的黏附 ,并测试不同药物对二者黏附的影响。结果　sLeX 和E 选择素是肝癌细胞与内皮细胞早期黏附的必要条件之一。HepG2条件培养液处理HUVEC可促进其与HepG2的黏附 ;地塞米松、氧化苯砷、左旋咪唑、放线菌素和sLeX 的类似物在低浓度下即有明显的抗黏附作用。结论　肝癌细胞可能分泌炎症因子样物质 ,促进靶组织内皮细胞的活化 ,地塞米松、氧化苯砷、左旋咪唑、放线菌素和sLeX 的类似物可能成为较有前景的、预防肝癌转移的抗黏附药物     

Expression of E-selectin on endothelial cells of small veins in human colorectal cancer

E-selectin is an adhesion molecule of endothelial cells that binds to cancer cells mediated by sialyl Lewis A (sLe^a) or sialyl Lewis X (sLe^x). It is suspected to be involved in hematogenous metastasis of tumors. Therefore, it is worth examining E-selectin expression in human colorectal cancer and its hepatic metastasis. In the present study, E-selectin was clearly revealed on the endothelial cells of small vessels adjacent to cancer nests both in primary and in metastatic nests in immunohistochemistry. In these tissues, E-selectin was observed on the endothelial cells lining the lumen of small vessels. Its expression adjacent to cancer nests appears to be induced through some stimuli by cancer cells, since its degree of expression is inversely correlated to the distance of the blood vessels from the cancer nests (p < 0.001). Endothelial cells adjacent to the metastatic lesion expressed E-selectin more extensively than those adjacent to the primary foci. This is also in line with the finding on serum E-selectin levels which were significantly elevated in the metastatic group as compared with the non-metastatic group. The serum E-selectin level may provide useful information in the diagnosis for hepatic metastasis of colorectal cancer, although the results are still tentative. © 1995 Wiley-Liss, Inc.     

微囊化Maspin基因修饰细胞对乳腺癌细胞Bcap37运动及黏附功能的影响

目的探讨Maspin在抗肿瘤转移过程中的作用及微囊化基因修饰细胞治疗恶性肿瘤的可能性和可行性。方法将微囊化Maspin基因修饰的中国仓鼠卵巢上皮细胞(CHO细胞)与乳腺癌细胞Bcap37进行共同培养,观察Bcap37细胞运动功能的变化;观察Bcap37细胞对同质细胞(Bcap37)和异质细胞(人血管内皮细胞ECV204)黏附功能的变化;同时观察被干预后的Bcap37细胞黏附分子CIM4v6和E-Cadherin表达的改变。结果经微囊化Maspin基因修饰的CHO细胞处理后的Bcap37细胞,其迁徙功能明显减弱,对Bcap37细胞同质黏附功能明显增强,对ECV204细胞异质黏附功能明显减弱;经微囊化CHO／Maspin细胞处理后,Bcap37细胞的黏附分子E-Cad表达增强,而CIM4v6表达有所降低。结论微囊化Maspin基因修饰的CHO细胞对乳腺癌细胞Bcap37的运动和黏附功能有一定影响;Maspin通过抑制肿瘤细胞的运动功能、异质黏附功能和增强同质黏附功能抑制肿瘤细胞的转移;微囊化基因修饰细胞可以用于治疗恶性肿瘤。     

E-selectin regulates gene expression in metastatic colorectal carcinoma cells and enhances HMGB1 release

Extravasation of cancer cells is a pivotal step in the formation of hematogenous metastasis. Extravasation is initiated by the loose adhesion of cancer cells to endothelial cells via an interaction between endothelial selectins and selectin ligands expressed by the tumor cells. The present study shows that the interaction between recombinant E-selectin (rE-selectin) and colorectal cancer (CRC) cells alters the gene expression profile of the cancer cells. A DNA microarry analysis indicated that E-selectin-mediated alterations were significantly more pronounced in the metastatic CRC variants SW620 and KM12SM than in the corresponding non-metastatic local SW480 and KM12C variants. The number of genes altered by E-selectin in the metastatic variants was about 10-fold higher than the number of genes altered in the corresponding local variants. Aiming to identify genes involved in CRC metastasis, we focused, by using a DNA microarry analysis, on genes that were altered by E-selectin in a similar fashion exclusively in both metastatic variants. This analysis indicated that E-selectin down regulated (at least by 1.6-folds) the expression of 7 genes in a similar fashion, in both metastatic cells. The DNA microarry analysis was validated by real time PCR or by RT-PCR. HMGB1 was among these genes. Confocal microscopy indicated that E-selectin down regulated the cellular expression of the HMGB1 protein and enhanced the release of HMGB1 into the culture medium. The released HMGB1 in turn, activated endothelial cells to express E-selectin.