应用A蛋白分离纯化细胞培养上清中的鼠源性抗肥大细胞FcεRⅠα的单克隆抗体

目的 分离纯化鼠源性抗肥大细胞FcεRⅠα(高亲和力的IgE的Fc段受体)的单克隆抗体。方法 先培养ER-E5．3细胞，获得大量的含抗肥大细胞FcεRⅠα的单克隆抗体的培养上清。然后应用A蛋白-Sphrose CL-4B制备亲和层析柱，分离纯化细胞培养上清中的单克隆抗体。结果 分离纯化的单克隆抗体纯度高，活性强。结论 应用A蛋白可以很好分离纯化细胞培养上清中的鼠源性抗肥大细胞FcεRⅠα的单克隆抗体。     

IgE高亲和力受体蛋白的制备及其生物功能的鉴定

目的 通过基因工程技术制备人IgE抗体结合其高亲和力受体α段(FcεRIα)蛋白并对其生物学功能进行鉴定,为探讨FcεRIα在过敏性疾病中的作用奠定研究基础.方法 应用基于PCR的精确合成法(PAS)方法获得人FcεRIα基因,构建原核表达载体pET-FcεRIα,低温诱导表达FcεRIα并采用 His标签纯化重组蛋白;通过ELISA法鉴定重组人FcεRIα蛋白的生物功能.结果 扩增出大小约为560 bp的人FcεRIα基因;pET-FcεRIα质粒经双酶切及测序鉴定正确;诱导表达并纯化出相对分子质量大小约为22000的人FcεRIα;重组人FcεRIα能有效检测人血清中的抗FcεRIα自身抗体水平,并且能够与人血清中IgE抗体高效结合.结论 成功制备人FcεRIα蛋白,并初步具备检测人血清中抗FcεRIα自身抗体及IgE抗体的能力,为后续研究提供了有利的实践基础.     

FcεR Ⅰ受体α亚基的重组表达、单克隆抗体的制备及特异性鉴定

目的 通过基因重组的方法表达IgE高亲和力受体FeεR Ⅰα亚基,并用重组蛋白制备单克隆抗体.方法 用RT-PCR的方法从过敏性疾病病人外周血嗜碱性粒细胞调取FcεR Ⅰα蛋白基因,经T-A克隆、亚克隆至pET28a( )原核表达载体,将重组质粒转化到大肠杆菌BL-21-STAR(DE3),IPTG诱导表达FeεR Ⅰα亚基蛋白,通过Ni-NTA亲和层析纯化融合蛋白;并用其免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术制备抗FcεR Ⅰα亚基单克隆抗体,用细胞免疫荧光法对单克隆抗体的特异性进行鉴定.结果 成功调取了人IgE高亲和力受体FcεRⅠα亚基的基因,且测序正确;构建原核表达质粒FcεR Ⅰα-pET28a( );成功建立4株稳定分泌抗FcεR Ⅰα亚基的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为G101、C22、G113、G42.通过细胞免疫荧光实验证实,4株单克隆抗体均能特异性结合人嗜碱性粒细胞表面的FcεR Ⅰα亚基.结论 成功利用基因重组技术制备了FcεR Ⅰα亚基蛋白,制备了4株效价高、特异性好的抗FcεR Ⅰα亚基单克隆抗体,为FeεR Ⅰα亚基及其抗体在过敏性疾病中的生物学功能研究奠定了基础.     

膜结合型抗大鼠FcεRIα单克隆抗体制备及活性鉴定

目的:建立抗鼠FcεRI单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb),为靶向诱导肥大细胞凋亡创造条件.方法:大鼠嗜碱性粒细胞细胞系RBL-2H3免疫的BALB/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,ELISA筛选鼠血清和融合细胞产生的抗体,有限稀释克隆化培养.SDS-PAGE胶电泳、免疫扩散鉴定抗体性质,IgE竞争结合、组胺释放检测抗体生物活性,125I-细胞膜抗体复合物免疫沉淀放射自显影鉴定抗体识别抗原成分.结果:获得2株抗FcεRIα McAb生产细胞株ER-E5.3、ER-C7.4,均为IgG1.培养上清和小鼠腹水获得的抗体效价均大于10-5.流式细胞术分析抗体与RBL-2H3结合率均大于95%,与大鼠胸腺细胞和外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte,PBL)无交叉反应,并能竞争性抑制IgE与肥大细胞结合.抗体触发RBL-2H3脱颗粒,组胺释放效应与抗原特异性IgE对肥大细胞的激活效应相同.酶切的Fab片段能与RBL-2H3结合,也能竞争抑制IgE与肥大细胞的结合,但不致RBL-2H3脱颗粒.抗体结合的细胞膜成分为α亚单位.结论:大鼠肥大细胞免疫小鼠与骨髓瘤细胞融合得到2株抗体产生杂交瘤克隆ER-E5.3和ER-C7.4,抗体效价和功能活性达到了实验要求,抗原识别成分为膜FcεRIα.     

B淋巴细胞刺激因子对慢性特发性荨麻疹患者产生抗FcεRI抗体和抗IgE抗体的影响

目的:探讨慢性特发性荨麻疹患者血清B淋巴细胞刺激因子(Bly S)对抗Ig E抗体和抗FcεRI抗体的影响。方法:选取慢性特发性荨麻疹患者100例作为疾病组,选取同期体检健康者100例作为健康组。检测两组受试者血清Bly S、抗Ig E抗体及抗FcεRI抗体水平;分离培养疾病组患者外周血中的B淋巴细胞,分为两份保存,在其中一份培养液中加入有效水平的Bly S,检测抗Ig E抗体及抗FcεRI抗体水平,作为试验组,将另一份作为空白对照组。分析血清Bly S与抗Ig E抗体及抗FcεRI抗体之间的关系。结果:疾病组血清Bly S、抗Ig E抗体及抗FcεRI抗体水平明显高于健康组,差异具有统计学意义(P0.05)。试验组培养液中抗Ig E抗体及抗FcεRI抗体水平明显高于对照组,差异具有统计学意义(P0.05);试验组中抗Ig E抗体及抗FcεRI抗体水平与Bly S呈正相关(r=0.765、0.722,P0.05)。结论:慢性特发性荨麻疹患者血清Bly S可刺激B淋巴细胞产生抗Ig E抗体和抗FcεRI抗体,这可能与慢性特发性荨麻疹的发病机制有关。     

慢性特发性荨麻疹患者血清抗Fcε RI抗体的临床意义

目的了解慢性特发性荨麻疹(CIU)患者血清抗FcεRI抗体水平及其临床意义。方法采用酶联免疫吸附试验法((ELISA)检测50例CIU患者血清抗FcεRI抗体水平,并与20名正常人对照;分析抗FcεRI抗体水平与CIU临床表现的关系。结果CIU患者血清抗FcεRI抗体水平为2.73(0.60～14.45)U/L,正常对照为1.42(0.60～2.30)U/L,两组差异有统计学意义(P0.05);抗FcεRI抗体水平与CIU病程、瘙痒程度、风团数量和风团大小无相关性(P0.05)。结论血清抗FcεRI抗体水平增高可作为CIU的辅助诊断指标,但不能用来评价CIU的病情严重程度。     

介导过敏反应的自身抗体在自身免疫性疾病中的临床意义

自身免疫性荨麻疹的发病与机体产生针对IgE高亲和力受体α链（FcCRIα）或IgE的自身抗体、补体等免疫分子有关,同时抗FcεRIα自身抗体可能与内源性哮喘、伴有过敏症状的其他疾病密切相关。该抗体的检测将有助于相关疾病的深入研究与诊断治疗     

TNF-α对肥大细胞IL-10、IL-12分泌和组胺释放的影响

目的:检测TNF-α对P815肥大细胞IL-10,IL-12分泌和组胺释放的影响。方法:P815肥大细胞培养后,用不同浓度的TNF-α单独或联合用TNF-α单克隆抗体激发肥大细胞,不同时间点收集上清,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测上清中IL-10,IL-12和组胺水平。结果:单独作用时,TNF-α促进P815肥大细胞IL-12分泌,而对IL-10分泌和组胺释放无明显影响,TNF-α单克隆抗体的应用可以阻断TNF-α引起的肥大细胞IL-12分泌。结论:TNF-α可以通过促进肥大细胞分泌IL-12参与肥大细胞相关的炎症过程。     

人FcεRⅠα亚基细胞外区的原核表达及其和IgE结合的机制

应用两种不同的表达系统对FcεRⅠα亚基的细胞外区进行克隆和表达，表达产物经纯化后用免疫斑点杂交法检测其与IgE结合的能力，探索IgE与其高亲和力受体FcεRⅠα亚基的细胞外区结合的机制。结果两种体系均成功表达出FcεRⅠα亚基的细胞外区，pBAD／gⅢA表达的FcεRⅠα亚基的细胞外区能与IgE结合，而PQE30表达的FcεRⅠα亚基的细胞外区不能与IgE结合。提示FcεRⅠα亚基的细胞外区已足够和。IgE结合，无需β、γ亚基的存在，其所具有的一定的空间构型和二硫键的形成在与IgE结合时是必需的，而糖基化位点在与IgE的结合时是非必需的。     

IL-4抑制骨髓细胞分化产生嗜碱性粒细胞的机制研究

目的 探究细胞因子IL-4抑制骨髓细胞分化产生嗜碱性粒细胞的能力及机制.方法 采用IL-3诱导培养小鼠骨髓细胞,流式细胞术检测FcεRIα+ckit-CD49b+嗜碱性粒细胞以及FcεRIα+ckit-CD49b-新发现的单阳细胞群,并用Ki67检测其增殖状态.流式细胞术分选单阳细胞群后继续用IL-3诱导培养,以确定其...     

慢性荨麻疹的自身免疫性质及病因探讨

病因不明慢性荨麻疹被称为＂慢性特发性荨麻疹＂,近年研究表明,部分慢性特发性荨麻疹患者血清中存在抗高亲合力的IgE受体α链（FcεRIα）的自身抗体或抗IgE自身抗体,该类荨麻疹的发生以自身免疫为基础,本文就相关研究进展做一综述。     

大鼠IgECH2-3-FasL融合蛋白真核表达质粒的构建

在人类哮喘及其他过敏反应性疾病中 ,肥大细胞始终处于重要地位。IgE的Fc段与肥大细胞上高亲和力受体FcεRⅠ相连接触发过敏反应。单独的Fc段能封闭其高亲和力受体 ,阻断过敏反应 ,且将关键结合位点定位于Fc段的CH3[1 3 ] 。国外研究发现 ,肥大细胞表面表达Fas,抗Fas抗体能够诱     

ICOS/Fc在CHO细胞中的稳定表达

目的:探讨Picos/Fc融合蛋白基因在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中的稳定表达及其表达产物的纯化和初步鉴定,为其功能研究和临床应用奠定基础.方法:将Picos/Fc表达质粒及含G418抗性基因neor的质粒Pegfp共转染CHO细胞,经G418抗性培养基筛选、克隆化培养、夹心ELISA检测,挑选100%强阳性且表达均一的细胞克隆,扩大培养取上清经Protein A亲和层析纯化,SDS-PAGE和Western印迹等进行分子质量、纯度、抗原特异性的初步鉴定.结果:获得稳定表达ICOS/Fc蛋白的CHO细胞单克隆,制备并经Protein A亲和层析柱获得纯化的ICOS/Fc融合蛋白,SDS-PAGE胶可见一条Mr约70×103的与预期分子质量大小相符的蛋白条带,Western印迹法可在同一位置检测到该蛋白与HRP酶标抗人Fc mAb特异结合.结论:在CHO细胞中成功地建立了稳定表达ICOS/Fc融合蛋白的细胞系,表达并纯化了有抗原特异性的重组ICOS/Fc融合蛋白.     

亲和层析法纯化抗大肠肿瘤相关抗原的单克隆抗体

目的制备和纯化鼠源性抗人大肠肿瘤单克隆抗体(单抗),分析其相应抗原在大肠肿瘤细胞中的表达。方法常规方法免疫BALB/c小鼠制备腹水,应用G蛋白亲和层析柱对小鼠腹水样品进行分离纯化。采用SDS-PAGE、间接免疫荧光(IFA)、间接ELISA检测纯化后抗体的纯度、活性、效价和特异性。用免疫细胞化学、流式细胞术和免疫组织化学技术S-P法检测其相应抗原在大肠肿瘤细胞株和组织中的表达。结果还原性SDS-PAGE显示所获抗体为单一组分。应用间接ELISA检测抗体效价为1∶106,纯化后的抗体对大肠肿瘤细胞株具有特异结合活性,并在高分化大肠腺癌组织中表现出更高选择性(P<0.01)。结论G蛋白亲和层析法操作简便,所得单抗的纯度高,特异性强,生物学活性好。对临床上早期诊断大肠肿瘤将具有较大的意义。     

分泌载脂蛋白AII单克隆抗体杂交瘤的建立

以人血清载脂蛋白AⅡ为抗原,免疫BALB/C小鼠,将脾细胞与NS-1骨髓瘤细胞融合,经HAT选择性培养,特异性筛选及克隆化,获得1-C1、2-C2两株分泌抗人血清载脂蛋白AⅡ单克隆抗体杂交瘤细胞株。免疫双扩散确定它们分泌抗体的亚型均为IgG1;吸收试验及ELISA交叉试验表明单克隆抗体的特异性;ELISA测定其培养上清中抗体效价都为1:100,诱生腹水效价分别为1:10000和1:5000;两株杂交瘤细胞染色体均数分别为96.34±6.06、95.01±5.38;采用Protein A Sepharose 4B层析柱纯化了1-C1杂交瘤细胞培养上清中的单克隆抗体。     

慢性荨麻疹自身抗体的表达情况及意义分析

目的:对慢性荨麻疹自身抗体的表达情况及意义分析。方法:收集近期在本院治疗的慢性自身免疫性荨麻疹患者78例作为观察组,同时随机选择同期健康体检者78例作为对照,检测抗FcεRI抗体、抗甲状腺自身抗体(抗甲状腺过氧化物酶自身抗体与抗甲状腺球蛋白抗体)、抗幽门螺杆菌(HP)自身抗体、抗核抗体(ENA)、抗dsDNA抗体等自身抗体表达情况,并进行比较分析。结果:与对照组相比较,慢性荨麻疹患者FcεRI抗体、抗甲状腺抗体、HP抗体、抗dsDNA等自身抗体表达阳性率均明显升高,与对照组比较差异具有统计学意义,抗核抗体阳性率差异则不具有统计学意义。与对照组相比较,慢性荨麻疹患者FcεRI抗体、抗核抗体、抗dsDNA等自身抗体表达水平明显升高,比较差异具有统计学意义(P0.05)。结论:慢性特发性荨麻疹的发病与其自身免疫背景有关,其血清内存在多种自身抗体异常表达,值得临床进一步研究应用。     

应用高效疏水色谱分离纯化IgM类单克隆抗体

高效疏水色谱(HPHIC)用于分离分子量高达1000 000的IgM类单克隆抗体还未见文献报道。我们用HPHIC对杂交瘤培养上清中的IgM类单克隆抗体进行了分离纯化,现报告如下。     

自身免疫性慢性荨麻疹的现代观点

自身免疫性慢性荨麻疹(AICU)是一种近年来正在逐步被人们所认识的疾病,与遗传因素,尤其是与HLA-Ⅱ类抗原及自身免疫诱发组胺释放的自身抗体关系密切,患者血清中可以存在着IgG-抗FcεRIα自身抗体和(或)抗IgE自身抗体,现就本病的有关问题综述如下.     

扶正治标法对青少年花粉症患者相关基因表达的影响

目的:研究中药治疗花粉症的作用机理。方法:选择50例花粉症患者,口服敏康片,治疗6个月后观察疗效及FcεRIβ,IL-4Rα,IL-5Rα,HLA-A基因表达情况,并以20例变应性皮炎和19例正常人为对照,用Northern blot检测FcεRIβ,IL-4Rα,IL-5Rα的变化。用RT-PCR法检测HLA-A,计算相对光密度值。结果:花粉症组患者症状有明显改善(P<0.05),治疗前后血清总IgE比较差异有统计学意义(P<0.01),花粉症组4个基因的表达治疗前与正常人比较,差异均具有统计学意义(P<0.01),治疗后与治疗前比较差异有统计学意义(P<0.01)。变应性皮炎组治疗前FcεRIβ,IL-4Rα与正常组比较差异有统计学意义(P<0.05),治疗前后FcεRIβ比较,差异有统计学意义(P<0.05)。鼻炎组、皮炎组HLA-A相对光密度值均较正常组高,两组治疗前后也有不同程度的改善(P<0.05)。结论:中药可以调整花粉症患者相关基因表达,改善患者过敏体质,缓解临床症状。     

IgG1类抗IgE Fc单克隆抗体抑制人肥大细胞脱颗粒作用研究

目的 探究IgG1类抗IgE Fc单克隆抗体对人肥大细胞脱颗粒作用的影响。方法 采用骨髓杂交瘤技术制备IgG1类大鼠抗人IgE Fc单克隆抗体,ELISA法鉴定杂交瘤细胞分泌的特异性抗体亚类;进一步体外培养人LAD2肥大细胞,分别以Compound 48/80、Compound 48/80+hum-IgE-Fc、Compound 48/80+anti-IgE-Fc mAb、Compound 48/80+IgE-Fc+anti-IgE-Fc mAb致敏LAD2肥大细胞48 h, Compound 48/80刺激45 min后甲苯胺蓝染色,收各组上清液,用ELISA检测HIS和TPS的释放浓度,Western blot检测各组TPS和CD32b分子表达水平。结果 成功制备2株分泌IgG1类Anti-IgE-Fc mAb的杂交瘤细胞株,与对照组相比,Compound 48/80促进LAD2细胞脱颗粒效应,HIS和TPS的释放浓度明显增加(P<0.05),且肥大细胞TPS蛋白表达上调。Compound 48/80+hum-IgE-Fc及Compound 48/80+anti-IgE-Fc...