大鼠骨髓细胞CD34+β2m-CD90+亚群肝内移植的研究

目的观察骨髓CD34^＋β2m-CD90^＋细胞在受体大鼠纤维化肝内的定居、生长以及对受体肝的影响。方法将雄性肝纤维化大鼠的骨髓CD34^＋β2m-CD90^＋细胞用PKH26-GL标记后，从门静脉注射到预先经放疗的同种模型雌性大鼠肝内；PCR检测雌鼠血清Y染色体的表达，荧光显微镜检测PKH26-GL标记的骨髓CD34^＋β2m-CD90^＋细胞在受体肝内的分布；病理学检查移植骨髓CD34^＋β2m-CD90^＋细胞后大鼠肝纤维化组织形态学改变；免疫组化检测肝内白蛋白、α-SMA的表达，放免法测定受体血清层粘连蛋白（LN）、透明质酸（HA）的水平，斑点杂交检测肝脏Ⅰ、Ⅲ型前肢原mRNA的表达。结果 在移植后2周内，雌性受体血清一直能检测到Y染色体特异的Sty基因表达，肝内有PKH26-GL红色荧光分布并有聚集成团趋势；受体肝纤维化减轻，间隔和胞周性纤维化较对照组改善；受体血清层粘连蛋白（LN）、透明质酸（HA）的水平下降（P〈0．05），肝组织α-SMA、Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA的表达下降（P〈0．05），白蛋白的表达升高（P〈0.05）。结论 大鼠骨髓CD34^＋β2m-CD90^＋细胞自体移植入纤维化肝后，可能定居并有一定程度的增殖；大鼠移植CD34^＋β2m-CD90^＋细胞后，受体肝纤维化程度有减轻的趋势。     

CD34+细胞体外定向诱导分化的实验研究

目的:探讨造血生长因子不同组合方式对CD34+细胞体外定向诱导分化作用.方法:应用阴性分选策略,以StemsepTM系统从正常人骨髓细胞中分离CD34+造血干/祖细胞(HSC/HPC),在液体培养体系加入不同组合细胞因子对CD34+细胞进行诱导,检测细胞总数、CD71+细胞和CD15+细胞比例及粒单系祖细胞和红系祖细胞扩增数量.结果:液体培养体系中,以FL+Tpo+SCF+IL-3+Epo细胞因子组合对CD34+细胞向红系细胞的诱导分化能力最强,2w后CD71+细胞比例为61.20%±5.31%,BFU-E、CFU-E分别扩增27.12±3.95和30.65±40.26倍.以FL+Tpo+SCF+IL-3+GM-CSF+G-CSF细胞因子组合对CD34+细胞向粒系细胞的诱导分化能力最强,2w后CD15+细胞比例为56.18%±6.57%,CFU-GM扩增29.87±10.52倍.结论:合理组合生长因子,可定向诱导CD34+细胞生成大量血细胞,将有助于满足临床应用的需要.     

脐血CD34＋细胞向内皮细胞诱导分化的体外研究

目的：探讨从脐血中分离CD34＋细胞,并诱导、鉴定其分化为内皮细胞的方法。方法：羟乙基淀粉沉降、密度梯度离心两步法制备脐血单个核细胞,免疫磁珠分选法（MACS）获得CD34＋细胞,在含有细胞因子的M199培养基中诱导。观察细胞形态变化,摄取Dit标记的乙酰化低密度脂蛋白（Dil—AcLDL）的情况,流式鉴定细胞表面标志。结果：分选CD34＋细胞纯度在91％以上,培养3d有明显集落形成及部分细胞贴壁,14d贴壁细胞呈条索状,逐渐增多后呈铺路石样改变。流式检测贴壁细胞表达血管内皮细胞特异性标志物CD144、vWF、CD31、CD34,而白细胞共同抗原CD45为阴性表达,与成熟的脐静脉内皮细胞表达率相近。免疫荧光发现贴壁细胞呈现红色荧光,提示细胞摄取Dil—AcLDL,证明CD34＋细胞分化为有功能的内皮细胞。结论：脐血中存在CD34＋细胞且用两步法和MACS可获得高纯度CD34＋细胞,在特定条件下可分化为内皮细胞。     

人CD34+脐血干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤

目的:探讨人脐血来源的CD34 干细胞治疗脊髓损伤的可行性,为脊髓功能障碍性疾病的临床治疗打下基础.方法:用密度梯度离心及免疫磁珠法分离出人CD34 脐血干细胞,在含有B27、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、人重组干细胞因子(rhSCF)的营养液中培养,用核荧光染色剂Hoechst33258标记细胞;制作大鼠脊髓横断模型,造成大鼠下肢瘫痪,在脊髓损伤3 d移植荧光标记的CD34 脐血干细胞,观察移植后的动物行为变化、脊髓组织形态学变化等.结果:脊髓损伤大鼠移植CD34 脐血干细胞5～6 d可见瘫痪大鼠的后肢肌力开始恢复,10～15 d后可出现爬行,3～4周后后肢活动活跃;对照组瘫痪的肢体未见恢复.脊髓移植区肉眼可见有增生的组织充填,镜下有大量神经胶质原纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶阳性的细胞,移植区Hoechst33258荧光标记阳性细胞增生.结论:移植的CD34 脐血干细胞可在移植部位增殖,并使脊髓横断大鼠运动功能恢复,有望成为治疗脊髓损伤的有效手段.     

脐血CD34+细胞巨核系定向诱导分化的研究

目的研究TPO与SCF、IL-11协同在体外促进入脐血CD34+细胞向巨核系增殖分化的效应.方法利用流式细胞仪分离纯化脐血CD34+细胞,在含血清液体培养体系中、细胞因子诱导下培养14 d.采用流式细胞术测定不同时间点培养体系中CD41+细胞的比例;同时采用甲基纤维素半固体集落培养测定CFU-MK的数量.结果经14 d培养,TPO+SCF+IL-11组可使CD41+细胞和CFU-MK数量分别扩增40.83±12.41倍、7.86±2.63倍,明显高于TPO组的28.69±8.27倍、4.48±1.25倍.结论在体外SCF和IL-11可以协同增强TPO诱导脐血CD34+细胞向巨核系增殖分化的作用.     

CD34+细胞含量在细胞移植治疗心力衰竭中的作用

目的:探讨CD34 细胞含量在骨髓单个核细胞移植治疗心力衰竭中的作用.方法:选择缺血性心力衰竭患者30例,测定移植前骨髓单个核细胞中CD34 细胞含量.观察患者移植前和移植后3个月的心肌梗死缺损区面积、左室射血分数、每搏量的变化.结果:在移植后3个月,CD34 细胞＜4.45×105者心肌梗死缺损区下降幅度、左室射血分数和每搏量上升幅度均明显小于CD34 细胞＞4.45×105者(P<0.05).结论:在骨髓单个核细胞移植治疗心力衰竭的过程中,细胞系中CD34 细胞含量多者,其心功能改善好于CD34 细胞含量少者.     

脐血CD34+细胞体外诱导分化为树突状细胞及其扩增

目的 探索脐血CD34+细胞体外诱导分化为树突状细胞及其扩增、培养大量树突状细胞(DCs)的方法.方法 Ficoll分离脐血单个核细胞,免疫微磁珠法分离纯化CD34+细胞,以rhIL-4、GM-CSF、rhSCF、rhFlt-3 Ligand、TGF-β1及TNF-α体外诱导培养14 d,进行形态学观察、表型检测及上清液IL-12测定.结果 体外培养14 d后,细胞呈现典型的成熟DCs形态学及表型特征:胞体表面粗糙,可见大量突起,高水平表达CD1a、CD11c、CD40、CD80、CD83、CD86和MHCⅡ类分子;同时,IL-12浓度随着培养时间的增加而升高,且在加入TNF-α刺激成熟后,IL-12浓度较未成熟时显著升高(P＜0.05).结论 体外联合运用rhIL-4、GM-CSF、rhSCF、rhFlt-3Ligand、TGF-β1、TNF-α, 能够成功诱导脐血CD34+细胞分化为大量活力好的DCs.     

丙氧鸟苷对亚致死量照射H-2半相合小鼠CD34+细胞植入的影响

①目的探讨丙氧鸟苷(GCV)对亚致死量照射H-2半相合小鼠CD34+细胞移植的影响.②方法从亲代雄性供鼠骨髓分离CD34+细胞,同时取脾脏T细胞转染TK基因.雌性F1受鼠60Co亚致死量照射7.0 Gy后随机分为4组,第1组输入1×105 CD34+细胞,其他3组输入1×105 CD34+细胞和5×105 TK+ T细胞.第3、4组分别于移植后0和7 d给予GCV治疗,然后观察各组移植物抗宿主病(GVHD)发生情况和生存情况.③结果单纯输入CD34+细胞组小鼠未能植活,但自体造血恢复.输入CD34+和TK+ T细胞组小鼠出现急性GVHD,表现为体质量下降;自小鼠外周血扩增出Y染色体片段.输入CD34+和TK+ T细胞后应用GCV组小鼠未发生急性GVHD;0 d应用GCV组80%小鼠未扩增出Y染色体片段;7 d应用GCV组80%小鼠扩增出Y染色体片段.7d应用GCV组植入率与未应用GCV组相比差异无显著性(χ2=0.89,P>0.05);7d应用GCV组植入率高于0d应用组(χ2=2.64,P<0.05).④结论移植后1周应用GCV对CD34+细胞植入影响较小.     

脐血CD34+细胞向内皮细胞定向诱导分化的实验研究

目的探讨人脐血CD34 细胞体外分离、纯化、诱导扩增和分化为内皮细胞的可行性,并检测其表型。方法采集新鲜脐血经抗凝处理及无菌包装,Ficoll密度梯度离心法得单个核细胞,磁珠分选方法(MACS)分离出CD34 单个核细胞,M-199培养基中诱导分化,细胞形态学观察CD34 和CD34-细胞生长情况,流式细胞仪检测内皮细胞CD31表型,免疫组化验证蛋白水平表达。结果细胞形态学观察发现,刚分离的CD34 和CD34-单个核细胞呈圆形,形态小。CD34 细胞培养3d后有明显集落形成,7d后呈梭行细胞,出现典型线样排列结构。经诱导培养后,内皮细胞表型CD31阳性率为(70.03±10.27)%。免疫组化染色证实了内皮特异性成分ecNOS和flk-1/KDR蛋白水平的表达。而CD34-细胞单独培养,少部分细胞贴壁,呈现出不规则形态。结论MACS法分离脐血CD34 细胞,体外诱导扩增和分化后贴壁细胞具有内皮细胞形态,通过流式细胞仪和免疫组化验证了贴壁细胞中大部分细胞具有内皮系标志物表达。     

自体外周血干细胞移植物中单个核细胞计数与CD34+细胞的相关性

目的探讨自体外周血干细胞移植物中的单个核细胞(MNC)计数和CD34+细胞计数之间的关系. 方法行自体外周血干细胞移植(APBSCT)的患者16例,采用化疗联合粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或粒单细胞集落刺激因子(GM-CSF)动员,用血细胞分离机进行外周血MNC分离,对每份采集物计数MNC和流式细胞仪计数CD34+细胞,进行直线相关分析. 结果 16例患者的MNC为0.10×108～2.62×108/kg,CD34+细胞为0.50×106～35.25×106/kg,移植物中的MNC计数和CD34+细胞计数呈正相关(r=0.694,P<0.001). 结论 MNC计数和CD34+细胞计数均能可靠预测自体外周血干细胞移植后的造血重建.     

脐血CD34~+细胞体外短期培养扩增研究

为寻找更有效的体外扩增脐血CD34 + 细胞的造血细胞因子组合 ,采集健康产妇脐带血 ,用免疫磁珠法分选CD34 + 细胞。采用SCF、FLT3 L、TPO和IL 34种具有早期作用的细胞因子的不同组合进行脐血CD34 + 细胞短期无血清液体培养 ,观察培养前后有核细胞、CD34 + 细胞、CD34 + /CD38- 细胞、CFU GEMM、CFU GM和BFU E数量的变化。结果在 3种不同的细胞因子组合中 ,同时应用SCF、FLT3 L、TPO和IL 34种细胞因子培养 7d的扩增效果最好。突出的发现是在这种条件下CD34 + /CD38- 细胞亚群达到平均 1 97.9倍的扩增效果。提示 :SCF、FLT3 L、TPO和IL 34种细胞因子是脐血CD34 + 细胞体外扩增理想的细胞因子组合     

自体外周血CD34+细胞移植治疗2例肿瘤患者临床报告

大剂量化疗合并自体造血干细胞移植越来越多地应用于多种对化疗敏感的恶性肿瘤 ,输注动员后的外周血干细胞可明显减低大剂量化疗导致的并发症和死亡率。然而 ,采集的干细胞中可能含有肿瘤细胞 ,从而导致移植后复发。鉴于人造血干/祖细胞表面表达CD34抗原 ,而很多肿瘤细胞不表达CD34抗原的原理 ,可采用CD34 +细胞分选技术 ,以减少移植物中肿瘤细胞的污染 ,达到净化的目的。我们运用CliniMACS系统纯化CD34+ 细胞进行自体外周血干细胞移植治疗2例肿瘤患者 ,现报告如下。1.1对象例1 :患者男性 ,25岁 ,右髂骨原始神经外胚层肿瘤 ,肿瘤切除…     

脐血CD34+细胞向内皮细胞定向诱导分化的实验研究

目的探讨人脐血CD34+细胞体外分离、纯化、诱导扩增和分化为内皮细胞的可行性,并检测其表型.方法采集新鲜脐血经抗凝处理及无菌包装,Ficoll密度梯度离心法得单个核细胞,磁珠分选方法(MACS)分离出CD34+单个核细胞,M-199培养基中诱导分化,细胞形态学观察CD34+和CD34-细胞生长情况,流式细胞仪检测内皮细胞CD31表型,免疫组化验证蛋白水平表达.结果细胞形态学观察发现,刚分离的CD34+ 和CD34-单个核细胞呈圆形,形态小.CD34+细胞培养3 d后有明显集落形成,7 d后呈梭行细胞,出现典型线样排列结构.经诱导培养后,内皮细胞表型CD31阳性率为(70.03±10.27)%.免疫组化染色证实了内皮特异性成分ecNOS和flk-1/KDR蛋白水平的表达.而CD34-细胞单独培养,少部分细胞贴壁,呈现出不规则形态.结论 MACS法分离脐血CD34+细胞,体外诱导扩增和分化后贴壁细胞具有内皮细胞形态,通过流式细胞仪和免疫组化验证了贴壁细胞中大部分细胞具有内皮系标志物表达.     

肝癌干细胞CD90+和ESA+亚群生物学特性研究

目的　研究肝癌干细胞不同亚群CD90+和ESA+细胞的生物学特性,为肝癌的治疗及预后判定提供新的思路。方法　采用活细胞流式细胞术检测肝癌细胞系MHCC97L中肝癌干细胞标志物CD90、ESA的表达情况,并分选ESA+,CD90+细胞,通过甲基纤维素成球实验、Transwell、CCK8法进行体外生物学特征研究。结果　肝癌细胞系MHCC97L中CD90+和ESA+细胞表达比例分别为2.37%和3.70%。ESA+细胞成球率明显高于ESA-细胞［成球率（35.6±2.1）% vs.（9.6±1.4）%, P<0.01］,CD90+细胞成球率明显高于CD90-细胞［成球率（29.2±1.3）% vs.（7.4±0.6）%］（P<0.01）,ESA+细胞成球率明显高于CD90+细胞且ESA+细胞sphere球体积明显大于CD90+细胞体积;ESA+细胞较ESA-细胞侵袭能力提高2.12倍［（282±15.1 vs. 133±12.4）,P<0.01］,CD90+细胞较CD90-细胞侵袭能力提高2.04倍［（231±18.1 vs. 113±10.2）,P<0.01］。CD90+细胞耐药性明显强于ESA+细胞［IC50（0.98 μg/mL vs. 0.36 μg/mL）］,ESA+细胞增殖能力明显强于CD90+细胞。结论　肝癌组织中存在不同的干细胞亚群ESA+细胞及CD90+细胞,这些亚群具有不同的生物学特性,影响肝癌的耐药、侵袭,了解肝癌中不同干细胞亚群的表达情况可用于指导临床个体化治疗。     

骨髓增生异常综合征中骨髓CD34~+、CD34~-细胞凋亡和增殖的实验研究

目的:分析骨髓增生异常综合征(MDS)患者骨髓CD34+细胞和CD34-细胞凋亡和增殖情况,从该角度探讨MDS的发病机制。方法:流式细胞术分析20例高危MDS、20例低危MDS患者及10例正常对照者骨髓CD34+细胞的比例,CD34+细胞和CD34-细胞凋亡、增殖的百分率,计算各组中的凋亡/增殖(A/P)比。结果:(1)MDS患者CD34+细胞的比例明显高于对照组,其中高危组CD34+细胞的比例明显高于低危组(P<0.05),而低危组与对照组比较无显著差异;(2)CD34+,CD34-细胞的凋亡率在MDS低危组中均为最高,明显高于MDS高危组和对照组,在低危组中,CD34-细胞的凋亡率(80.36±1.82)%明显高于CD34+细胞(54.75±2.18)%(P<0.05),而在高危组中,CD34+,CD34-细胞的凋亡率无显著差异;(3)CD34+细胞的增殖率在MDS高危组中最高,明显高于低危组和对照组,而CD34-细胞的增殖率在MDS高危和低危组间无显著差异,在高危组中,CD34+细胞的增殖率(50.67±3.37)%明显高于CD34-细胞的(30.99±1.96)%(P<0.05);(4)无论CD34+,CD34-细胞的A/P值在MDS低危组中均明显高于高危组和正常对照组,而在MDS各亚组中,CD34-细胞的A/P值明显高于CD34+的A/P值(P<0.05)。结论:CD34+细胞百分率随MDS危险度增加而逐渐增加,在低危组中以CD34-细胞的凋亡占主导,随着病情进展,在高危组中则以CD34+细胞的增殖占主导,提示异常的凋亡和增殖在MDS的发生和发展中起重要作用。     

自体外周血CD34+细胞移植治疗非霍奇金淋巴瘤

目的 采用CD34+细胞体外分选技术对非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者进行自体外周血CD34+细胞移植,观察其临床疗效.方法 5例NHL患者,女3例,男2例;中位年龄29岁;T细胞NHL 3例,弥漫大B细胞NHL 1例,真性组织细胞型NHL 1例;临床分期ⅡA 2例,ⅣB 3例;移植前4例处首次完全缓解,1例为部分缓解.采用Clini MACS临床型磁性细胞分离器收集CD34+和CD34-细胞组分,患者于预处理后输注分选的CD34+细胞.结果 Clini MACS体外分选可去除3.3个对数级CD34-细胞;回输CD34+细胞中位数为2.0×106/kg;CD34+回收率为52%,CD34+细胞纯度为86%;移植后白细胞恢复至＞0.5×109/L和血小板＞20×109/L天数(中位数)分别为12 d和19 d.患者总体生存率和无病生存率均为4/5,1年生存率为4/5,估计5年生存率为75%.结论 NHL患者自体外周血CD34+细胞移植后可获得迅速稳定的造血重建,体外CD34+细胞纯化富集后移植可望提高NHL患者自体移植疗效.     

免疫磁珠法纯化小鼠CD34+造血干细胞

目的探讨免疫磁珠法(MiniMACS)能否用于纯化小鼠骨髓CD34+造血干细胞.方法应用免疫磁珠纯化小鼠骨髓CD34+细胞,流式细胞仪(FACS)评估纯化效率,检测纯化后的细胞活力.结果纯化后CD34+细胞纯度81.5%(范围76.80%～85.38%),回收率47.54%(范围40.50%～54.31%),纯化前后细胞活力不受影响(P=0.169).结论应用MiniMACS纯化小鼠骨髓可获得高纯度CD34+细胞,并不影响细胞活力.     

CD34~+细胞在原发性骨髓纤维化症和原发性血小板增多症骨髓组织中的表达

目的:探讨CD34+细胞在原发性骨髓纤维化症及原发性血小板增多症骨髓组织中的表达及临床意义。方法:应用免疫组织化学染色法,检测原发性骨髓纤维化症和原发性血小板增多症实验组及对照组骨髓组织中CD34+细胞表达情况。结果:CD34+细胞在实验组骨髓组织中表达高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);CD34+细胞在原发性骨髓纤维化症及原发性血小板增多症骨髓组织中表达的差异无统计学意义(P>0.05)。结论:CD34+细胞在原发性骨髓纤维化症和原发性血小板增多症的发生中有一定关系,CD34+细胞与两者之间的转化无必然联系。     

人参总皂苷体外定向诱导CD34+细胞分化为粒系血细胞的研究

目的研究人参总皂苷(TSPG)协同造血生长因子对CD34 细胞体外定向诱导分化为粒系血细胞的影响。方法应用阴性磁性分选策略,以StemsepTM系统从正常人骨髓细胞中分离CD34 造血干/祖细胞(HSC/HPC),通过甲基纤维素半固体培养法检测TSPG诱导CD34 HSC/HPC向粒系祖细胞集落(CFU-GM)增殖与分化的能力;在SCF IL-3 GM-CSF G-CSF(SIGG)液体培养体系中加入不同剂量的TSPG,检测对CD34 HSC/HPC增殖形成CFU-GM的影响以及CD33 细胞比例的变化。结果TSPG(10～50μg/mL)均能提高CD34 细胞形成CFU-GM的集落产率,以TSPG20μg/mL效果最为明显;不同质量浓度的TSPG协同造血生长因子在液体培养体系中诱导CD34 细胞2周,观察粒系血细胞的分化,TSPG10～70μg/mL均可不同程度地提高细胞总数、CFU-GM扩增倍数及CD33 细胞比例,TSPG20μg/mL是液体培养诱导CD34 细胞向粒系分化的最佳质量浓度。结论TSPG协同造血生长因子能促进CD34 细胞定向诱导分化为粒系血细胞。     

大鼠骨髓细胞体外诱导分化神经细胞的演变规律

[目的] 摸索从全骨髓诱导培养分化神经细胞的方法,并从神经巢蛋白(nestin)和神经核蛋白(NeuN)两种标记物上观察其分化的演变规律.[方法] 抽取 SD大鼠骨髓做全骨髓细胞培养,采用免疫细胞化学和荧光激活细胞计数仪 (FACS)追踪由骨髓到神经元样细胞不同阶段 nestin和 NeuN的表达趋势,给予定性、定量分析.[结果] 免疫细胞化学检测,细胞培养 5 d时对上述抗体呈弱阳性,逐渐增强,培养第 15天细胞呈典型 nestin强阳性反应,而 NeuN强阳性反应在 25～ 30 d达到高峰,发育成为神经元样细胞. FACS同步追踪显示了 nestin和 NeuN在培养第 5天时即有表达,前者 3.4%,后者 2.5%.随着骨髓细胞的分化,在 15 d时 nestin阳性细胞为 22.7%,达到高峰,随后下降. NeuN于 30 d达到高峰为 41 2%,而此时 nestin阳性细胞为 5.9%.[结论] 从神经干细胞和神经细胞特征性标记物演变探知骨髓细胞的分化发育规律;骨髓细胞可分化为神经细胞;骨髓源性神经前体细胞早期亦有 nestin和 NeuN的表达.