抗乙型肝炎病毒特异联合型核酶的体外切割作用

目的：探讨单一及多位点核酶对乙型肝炎病毒靶ＲＮＡ的切割作用。方法：利用计算机辅助设计针对乙型肝炎病毒Ｃ基因的三个单一核酶及特异联合型核酶,构建三个核酶各自及三个核酶串联的自剪切转录载体（ｐＧＥＭＲｚ１２３）观察单一及串联核酶（Ｒｚ１２３）对靶ＲＮＡ的切割作用。结果：构建的串联核酶自剪切转录载体体外转录后,在顺式核酶发生自剪切后可将目的核酶正确地释放出来,计算机设计的单一核酶体外可剪切靶ＲＮＡ,串联     

核酶对乙型肝炎病毒基因表达的抑制作用

目的 探讨核酶在细胞内抑制乙型肝炎病毒基因表达的作用。方法 计算机设计针对Ｃ基因的三个切点的核酶Ｒｚ１,Ｒｚ２,Ｒｚ３,合成核酶基因并将三个核酶基因两两组合克隆入ｐＧＥＭ７ｚｆ（一）质粒中,经体外转 录后切割靶ＲＮＡ;选择Ｒｚ２和Ｒｚ３串联的双位点核酶基因构建入逆转录病毒载体ｐＢＢＳ２１２中,重组质粒转染２．２．１５细胞,ＥＬＩＳＡ方法惭型肝炎病毒基因表达的抑制作用。结果 三种不同组合的核酶均可有     

核酶及突变核酶在体外对HBV mRNA的切割作用

目的：探讨多位点核酶对乙型肝炎病毒（HBV）信使核糖核酸（mRNA)的切割作用，以及保守碱基突变后对切割活性的影响。方法：利用计算机辅助设计针对HBV C区基因的多位点核酶及保守碱基突变的双位点核酶，构建多位点核酶及双位点突变核酶的自剪切载体（pGEMRz123,pGEMmRz12)，观察核酶及突变核酶对RNA的切割作用。结果：构建后的多位点串联核酶及突变核酶的自剪切转录载体在体外转录后，其顺式核酶可发生自剪切，并可将目的的核酶释放出来。多位点核酶对HBV mRNA有明确的切割作用，而保守碱基突变后对HBV mRNA则无切割作用。结果 ：抗HBV多位点酶在体外可明确切割HBV靶RNA，突变后的核酶无切割活性，保守碱基为核酶保持活性所必需。     

原癌基因K-ras mRNA的体外核酶定点切割

目的：确定人工设计的梅核Ｒｘ１９９对原癌基因Ｋ－ｒａｓ ｍＲＮＡ的体外切割活性，为Ｋ－ｒａｓ特异性核酶的体内应用提供依据。方法：利用ＤＮＡ重组技术构建Ｋ－ｒａｓ外显子１及核酶Ｒｚ１９９的体外转录质粒，以Ｔ７ＲＮＡ聚合酶进行转录获得核酶Ｒｚ１９９对其靶ＲＮＡ分子进行切割。结果：Ｋ－ｒａｓ体外转录体为２５４ｎｔ的ＲＮＡ分子，能被核酶Ｒｚ１９９切割成大小分别为９０，１６４ｎｔ的２个片段。结论：梅核Ｒａ１     

抗HBVC基因核酶自剪切转录载体的构建

抗ＨＢＶＣ基因核酶自剪切转录载体的构建＊连建奇１周永兴１金由辛２（１第四军医大学唐都医院传染科西安７１００３８２中国科学院上海生物化学研究所）关键词乙型肝炎病毒Ｃ基因核酶自剪切中图号Ｒ５７５．１核酶（Ｒｚ）是一类具有酶特异性的ＲＮＡ分子，它能够序列特...     

血管内皮生长因子165核酶的合成及其体外活性

目的 探讨抗血管内皮生长因子165（VEGF165）核酶的设计合成及其生物学活性。方法 利用计算机辅助设计针对VEGF165的锤头状核酶，构建核酶的自剪切转录载体pGEMRz212，体外转录合成核酶Rz212及其相应的底物VEGF165mRNA，在无细胞体系中观察核酶对靶RNA的切割作用。结果 构建的自剪切转录载体在转录的过程中发生了自身剪切，并释放出目的核酶Rz212，该核酶具有切割VEGF165 mRNA的作用。结论 计算机辅助设计的VEGF165锤头状核酶体外可有效切割靶RNA，具有较高的生物活性。     

丁型肝炎病毒基因组核酶的反式剪切活性

目的 观察丁型肝炎病毒２种基因组核酶（ＨＤＶ ｇｅｎｏｍｉｃ ｒｉｂｏｚｙｍｅ，ｇ Ｂｚ）是否存在式剪切活性。方法 合成ｇ。．Ｒｚ７４、ｇ．Ｒｚ５５的ＣＤＮＡ，克隆人质粒ｐＧＥＭ－４Ｚ，体外转录获取核酶ＲＮＡ，同时从质粒Ｒｚ２７７Ｂ上转嫌出同源性底物ＲＮＡ，以β－３２ｐ－ＵＴＰ标志，再将核酶与底物按比例混合，在一定条件下观察是否出现的剪切作用，结果 启动反应３０ｍｉｎ后，可以观察到的切产物，９０ｍ     

抗血管内皮生长因子多位点核酶的合成及其体外切割作用

目的: 设计合成血管内皮生长因子多位点核酶,探讨其对靶RNA的切割作用.方法: 利用计算机辅助设计针对VEGF165的3个单位点核酶 (Rz1, Rz2, Rz3) 和联合型多位点核酶 (Rz123),构建其自剪切转录载体,观察多位点核酶对靶RNA的切割作用.结果: 构建的多位点核酶自剪切转录载体在体外转录中,顺式核酶发生了自身剪切,并释放出正确的目的核酶,多位点核酶可切割靶RNA,且效率高于单一核酶,其切割效率分别为 (37±10)% (Rz1), (51±8)% (Rz2 ), (68±15)% (Rz3) 和(88±11)% (Rz123).结论: 抗血管内皮生长因子多位点核酶体外可联合切割靶RNA,具有较高的生物活性.     

抗丙型肝炎病毒核酶的细胞内免疫及其意义

目的 探讨抗丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核酶（Ｒｚ）预先转染的细胞内免疫效应。方法 人前构建的ＨＣＶ２锤头结构Ｒｚ（Ｒｚ２１３），通过脂质体介导的基因转染方法，转染人肝癌细胞（ＨＨＣＣ），经Ｇ４１８筛选转染Ｒｚ２１３的生，应用１ｕｃ报告基因的表达活性，观察该细胞克隆对靶基因（ｐＣＭＶＮＣＲ１ｕｃ）转染的抑制作用。结果 Ｇ４１８筛选能使ｚ２３１在转染细胞内有效表达Ｒｚ ＲＮＡ，转染Ｒｚ的多克隆细胞能有效地     

c—myc基因特异核酶的设计及其对靶mRNA的切割

目的：针对ｃ－ｍｙｃ基因第二外显子部分序列设计核酶，探讨生理温度下核酶的切割活性，方法：计算机模拟分析ｃ－ｍｙｃ基因第二外显子部分二级结构，选择核酶切位点，设计核酶，分别构建ｃ－ｍｙｃ基因第二外显子部分序列和核酶体外转录载体并经双脱氧末端终止法测定核酶序列正确无误，体外转录核酶和靶ＲＮＡ分子，生理温度下测定核酶切割活性，结果：所设计的核酶可有效地切割靶ｍＲＮＡ分子。结论：所设计的核酶在生理温度下具     

抗HPV16E7－ribozyme和靶RNA相互作用的计算机分析

应用计算机分析了抗ＨＰＶ１６Ｅ７－ｒｉｂｏｚｙｍｅ的体外切割反应结果，发现ｒｉｂｏｚｙｍｅ和靶ＲＮＡ的二级结构及其能量变化能影响ｒｉｂｏｚｙｍｅ的切割活性。根据锤头结构ｒｉｂｏｚｙｍｅ的能量变化模型，对抗ＨＰＶ１６Ｅ７－ｒｉｂｏｚｙｍｅ和靶ＲＮＡ在痘苗表达体系及稳定表达体系中的相互作用，进行计算机模拟分析。结果表明，计算机分析ｒｉｂｏｚｙｍｅ和靶ＲＮＡ在细胞内的相互作用，可以指导ｒｉｂｏｚｙｍｅ的设计和在体内的应用研究。     

重组HDV核酶逆转录病毒的生产及对HBV抑制效率的测定

目的:构建含HDV核酶基因的重组逆转录病毒载体,包装出逆转录病毒实现其在HepG2215细胞中稳定表达,并研究其是否抑制HBV的复制。方法:应用PCR方法扩增HDV核酶基因,克隆入逆转录病毒载体pMSCV/U6中,用脂质体法转染逆转录病毒载体包装细胞,嘌呤霉素筛选稳定表达细胞株,用PCR和药物抗性水平传播分析检测野生型辅助病毒。收获的病毒感染HepG2215细胞,用酶联免疫实验测定对HBV的抑制率。结果:重组逆转录病毒载体的酶切鉴定片段约为73bp,与预期值一致。脂质体转染包装细胞,嘌呤霉素加压筛选出高病毒滴度(4.0×10⁶ CFU/ml)的细胞克隆,且未检测到辅助病毒,对HBV的抑制率最高可达61.56 %。结论:成功构建重组逆转录病毒载体,在包装细胞系中能生产出高滴度的逆转录病毒,能有效的抑制HepG2215细胞内HBV的复制,为HBV的基因治疗提供了实验数据。     

AIV PB2基因靶向性M1GS核酶的构建及其体外切割活性测定

目的 针对禽流感病毒(AIV)复制酶PB2亚基的基因构建具有靶向切割作用的M1GS核酶,为新型抗AIV反义药物的开发奠定基础.方法 基于大肠埃希菌的核糖核酸酶P(RNase P),根据AIV PB2基因的序列特征,设计一小段与之互补的引导序列GS,通过PCR技术将其共价连接至大肠埃希菌RNase P催化性亚基(M1 RNA)的3'末端,以构建靶向性M1GS核酶.通过体外切割试验测定M1GS核酶的活性.结果 构建了M1GS-T436、M1GS-C341两种M1GS核酶.体外切割实验证实,核酶M1GS-T436可对靶RNA片段产生特异性切割;核酶M1GS-C341虽可切割靶RNA片段,但可能属于非特异性切割.结论 成功构建并筛选出一种具有显著体外切割活性的M1GS核酶(M1GS-T436),为今后进一步研究其胞内及体内抗病毒活性奠定了基础.     

抗肿瘤多药抗性核酶转录质粒的构建及其体外切割研究

目的 探讨体外核酶对肿瘤多药抗性相关基因mdr1靶RNA分子的切割作用及其影响因素。方法 利用计算机软件设计能特异切割mdr1 mRNA的锤头状核酶（ribozyme）,并构建抗mdr1-ribozyme和靶分子的体外转录质粒,进行体外切割实验。结果 发现抗mdr1-ribozyme能较好地切割mdr1 mRNA。 结论 抗肿瘤多药抗性核酶的体外研究为其体内应用提供了参考,ribozyme有可能成为逆转肿瘤多药抗性的新药物。     

核酶切割per基因所致的缓解吗啡成瘾作用研究

目的　探讨 per基因与阿片类成瘾的相关性 ,进而寻找治疗阿片成瘾的基因戒毒疗法。方法　设计并合成特异性 per锤头状核酶基因和 per核酶靶 m RNA组分基因 ,并分别重组入体外转录质粒 ,而后将经体外转录反应得到 per核酶 RNA和地高辛标记的 per核酶靶 m RNA组分。将转录产物混合 ,在不同条件下进行体外切割反应后 ,采用地高辛化学发光法检测 per核酶的体外切割效率。小鼠脑室注射直接导入脂质体包裹的重组质粒 pc DNA3.1- per RZ DNA,按剂量递增法建立吗啡依赖动物模型 ,用纳洛酮催瘾 ,观察戒断反应的变化。结果per核酶对 per核酶靶 m RNA组分的体外切割效率达到 6 0 %。重组质粒组小鼠的刻板跳跃、“湿狗”样抖动和打洞次数与空质粒组、生理盐水组相比明显减少 ,但并不抑制小鼠的体重下降。结论　 per核酶具有体外定点切割 per基因 m RNA组分的活性。经小鼠吗啡成瘾模型检测 ,该重组质粒能成功转染活体小鼠脑细胞并在脑组织内稳定表达 per核酶 ,发挥阻断 per基因表达的作用 ,有效地减轻吗啡成瘾的戒断症状。     

Effects of hammerhead ribozyme (RCP) on HBV P gene in vitro

Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｈａｍｍｅｒｈｅａｄｒｉｂｏｚｙｍｅ（ＲＣＰ）ｏｎＨＢＶＰｇｅｎｅｉｎｖｉｔｒｏＧａｎＬｉｘｉａ（甘立霞），ＷａｎｇＰｉｎｇ（王平），ＺｈｕＸｉｈｕａ（朱锡华），ＤｏｎｇＹａｎｌｉｎ（董燕麟），ＨｏｕＹｕｎｄｅ（侯云德）（Ｄｅｐａｒ...     

c-myc基因核酶对靶mRNA的切割作用

目的：构建c—myc基因核酶及其靶mRNA的体外转录载体，探讨核酶对靶mRNA的体外切割作用。方法：通过计算机分析c—myc基因mRNA的二级结构，设计核酶基因序列，采用DNA合成仪合成核酶基因，以克隆技术将核酶基因构建入pGEM3Zf( )体外转录载体，将大鼠c—myc基因第2外显子及部分第3外显子的基因片段克隆入pGEM7Zf(-)体外转录载体，分别进行体外转录获得核酶及靶mRNA。在含有Mg^2 的反应体系中，进行核酶对靶mRNA的体外切割反应。结果：经限制性内切酶酶切鉴定，核酶基因准确克隆入pGEM3Zf( )载体，经DNA自动序列分析仪测序分析，大鼠c—myc基因第2外显子及部分第3外显子的基因片段准确克隆入pGEM7Zf(-)载体。核酶对靶mRNA的体外切割活性约为64．5％。结论：该核酶具有切割靶mRNA的活性，可进一步用于细胞内和体内研究。