CIITA锤头状核酶的克隆及其体外活性

通过CIITA核酶抑制HeLa细胞表面MHCⅡ类分子的表达。设计并合成针对人类CIITA的核酶Rz464,通过体外转录和切割实验鉴定其活性。将Rz464亚克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP(pRz464),并稳定转染HeLa细胞株,流式细胞术检测MHCⅡ类抗原表达,RT-PCR检测CIITA mRNA水平。结果表明,Rz464与CIITA靶序列体外切割产物电泳见预期切割条带。pRz464~+HeLa细胞与对照组比较,HLA-DR、DP、DQ抗原诱导型表达分别降低了79.21%、90.31%及48.30%;同时CIITA的诱导型mRNA含量明显减少。Rz464通过切割CIITA mRNA,进而阻止了后者调控的MHCⅡ类分子的表达。     

MHCⅡ类分子转录激活因子锤头状核酶的生物学活性

目的 探讨MHCⅡ类分子转录激活因子（CⅡTA）锤头状核酶抑制细胞表面MHCⅡ类分子的表达。方法设计并克隆针对CⅡTA第464位点的锤头状核酶（Rz464）及其相应的CⅡTA靶基因,分别插入pGEM-T载体,进行细胞外切割活性鉴定,进一步将Rz464亚克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP（pIRES2-EGFP-Rz464,pRz464）,并稳定转染Raji细胞株,流式细胞术检测经典的MHCⅡ（HLA-DR、-DP、-DQ）类抗原表达,RT-PCR分析CⅡTA mRNA水平。结果细胞外活性鉴定表明,Rz464具有明显的切割活性。细胞内切割实验显示：pRz464阳性Raji细胞表面HLA-DR、DP、DQ抗原表达分别降低了75．93％、64．14％、78．32％;同时CⅡTA的mRNA含量降低（P〈0．05）。结论抗CⅡTA锤头状核酶Rz464可有效抑制MHCⅡ类抗原的表达。     

抗CⅡTA RNaseP(M1-3408-GS)的生物学活性

目的 通过抗CⅡ TA RNaseP抑制HeLa细胞表面MHCⅡ分子的表达。方法 M1-RNA是RNaseP的催化活性单位，从包含M1．RNA的pTK117质粒克隆抗CⅡTA RNaseP(M1-3408-GS)，定向插入腺相关病毒载体psNAV(paAV-M1-3408-GS)；以RT-PCR从Raji细胞株克隆靶基因模板，插入pEM-7zf( )载体(pGEM-3176)。psNAV-M1-3408-GS和pGEM-3176分别进行体外转录和体外切割实验。通过纳米载体介导psNAV-M1-3408-GS质粒稳定转染HeLa细胞，应用流式细胞术检测其表面HLA-DR、DP、DQ抗原表达，RT-PCR检测其CⅡTAmRNA水平。结果 M1-3408-GS与pGEM-3176体外切割产物电泳见预期切割条带。M1-3408-GS HeLa细胞与对照组比较，其表面HLA-DR、DP、DQ抗原诱导型表达分别降低了79．21％、90．31％及48．30％；同时诱导型CⅡTA mRNA含量减少。结论 抗CⅡTA核糖核酸酶P(M1-3408-GS)有可能发展为新一代抑制自身免疫疾病的核酸药物。     

靶向CⅡTA基因siRNA对大鼠角膜基质细胞MHCⅡ基因表达影响的研究

目的：探讨靶向主要组织相容性复合物(MHC)Ⅱ类抗原转录激活因子（MHCⅡtransactivator CⅡTA）的化学合成小干扰RNA(small interfering RNA)抑制大鼠角膜基质细胞表面的MHCⅡ类抗原表达的可行性。 方法： 设计并合成靶向CⅡTA基因的5条siRNA，分离并培养大鼠角膜基质细胞，经重组大鼠IFN-γ刺激后，在阳离子脂质体的介导下，将siRNA转染大鼠角膜基质细胞。于转染后24 h收集细胞,用荧光定量PCR方法检测CⅡTA和MHCⅡ mRNA水平的变化;流式细胞仪检测MHCⅡ抗原表达的变化。 结果： 大鼠角膜基质细胞经重组大鼠IFN-γ刺激后，CⅡTA和MHCⅡ的表达大幅增强。荧光定量PCR检测显示化学合成的5条siRNA通过脂质体转染大鼠角膜基质细胞后,均能不同程度地抑制CⅡTA和MHCⅡ的表达，与对照组具有显著差异(P<0.01)。其中siRNA-4组的抑制作用最明显，对CⅡTA、MHCⅡ基因的mRNA抑制率分别为95.10%±1.25%、82.70%±1.95%。流式细胞仪检测显示siRNA-4组对MHCⅡ抗原分子表达抑制率为81.90%±1.23%。 结论： 在大鼠角膜基质细胞中，靶向CⅡTA siRNA抑制了自身mRNA表达,并阻止其调控的MHCⅡ类分子的相应表达。从而为进一步研究利用siRNA技术抑制MHCⅡ的表达防治角膜缘移植排斥反应提供了实验依据。     

CⅡTA M1-RNA对MHCⅡ类分子表达的抑制作用

目的探讨MHCⅡ类分子转录激活因子（CⅡTA）的M1-RNA对细胞表面MHCⅡ类分子表达的抑制。方法M1-RNA是核糖核酸酶P的催化活性单位，设计并克隆针对CⅡTA第452、629位点的M1-RNA（分别为M1-452-GS、M1-629-GS）及其相应的CⅡTA靶基因，分别插入pUC19、pGEM-7zf（＋）载体，进行细胞外切割活性筛选。将细胞外切割作甩明显的M1-629-GS亚克隆入psNAV载体（psNAV-M1-629-GS，pA629）并稳定转染ECV304细胞株，流式细胞术检测经典的MHCⅡ（HLA-DR、-DP、-DQ）类抗原表达，RT-PCR检测CⅡTA的mRNA水平。结果pA629阳性ECV304细胞株与对照组比较，HLA-DR、-DP抗原表达分别降低了89．21％及92．31％；同时CⅡTA的mRNA含量降低（P〈0．05）。结论CⅡTA的M1-RNA（M1-629-GS）降低了自身mRNA含量，从而阻止其调控的MHCⅡ类分子的表达。     

CⅡTA基因编码区不同单倍型cDNA的功能研究

目的 研究MHCⅡ类反式激活因子(cⅡTA)基因编码区非同义单核苷酸多态性(SNP)位点C19170G(Leu45Val)和C30799G(Ala500Gly)构成的4种不同单倍型cDNA的功能.方法 将4种不同单倍型的真核表达载体和卒载体分别转染至HeLa细胞.用RT-PCR和间接细胞免疫荧光技术检测未经转染的HeLa细胞、转染4种真核表达载体及卒载体的HeLa细胞cⅡTA mRNA与3种HLAⅡ类分子(HLA-DR、DP、DQ)的表达,并用流式细胞技术对其表达的3种HLAⅡ类蛋白进行定量分析.结果 未经转染和转染空载体的HeLa细胞均尤CⅡTA mRNA和3种HLAⅡ类分子的表达,而转染4种不同单倍型真核表达载体的HeLa细胞均出现CⅡTA mRNA表达,并表达3种HLAⅡ类分子.证实了转染4种不同单倍型真核表达载体后的HeLa细胞3种HLAⅡ类分子表达水平差异无统计学意义(P均>0.05).结论 中国人CⅡTA基因编码区这两个SNP位点的多态性(2个位点氨基酸的改变)不影响CⅡTA反式激活HLAⅡ类基因表达的能力.     

小鼠pIV启动子调控CⅡTA突变体重组腺病毒表达选择性抑制MHC Ⅱ类分子的表达

目的：观察受CⅡTA-pIV启动子驱动的MHCⅡ类分子反式激活因子突变体（CⅡTAm）重组腺病毒对MHCⅡ类分子表达的选择性抑制作用，并探讨其相关机制。方法：构建了N-端酸性氨基酸区缺失了118aa的CⅡTA突变体及其CⅡTA-pIV启动子驱动的重组腺病毒Ad-pⅣ-CⅡTAm，将Ad-pIV-CⅡTAm或对照腺病毒Ad-GFP感染小鼠内皮细胞株SVEC细胞和转染巨噬细胞株J774细胞，并以IFN-γ刺激。用RT-PCR检测野生型和突变型CⅡTA mRNA的表达，用流式细胞术检测MHCⅡ类分子在细胞表面的表达。结果：成功构建CⅡTA-pIV启动子调控下的CⅡTA突变体基因重组腺病毒表达载体Ad-pIV-CⅡTAm；该腺病毒介导的CⅡTA突变体mRNA在SVEC和J774细胞内的表达受到IFN-7的上调，同时抑制这些细胞上诱导型和组成型MHCⅡ类分子的表达。结论：Ad-pIV-CⅡTAm重组腺病毒是一种WN-γ调控型表达载体，可有效地抑制受感染细胞上MHCⅡ类分子的表达。     

MHCⅡ类反式激活因子基因的克隆、鉴定及初步功能测定

目的 克隆MHCⅡ类反式激活因子（class Ⅱ rtansactivator,CⅡTA）基因并进行初步功能测试，为CⅡTA的应用研究奠定基础。方法 RT－PCR扩增CⅡTA基因，将其克隆到pGEM-T载体上并进行酶切和测序鉴定，用EcoRⅡ、XhoⅠ将CⅡTA定向克隆到表达载体pcDNA3上，用脂质体转染法将pcDNA3/CⅡTA转入HeLa细胞；流式细胞术观察细胞表面HLA－DR／DQ的表达变化。结果 成功克隆CⅡTA基因，CⅡTA的转入使HeLa细胞表面表达HLA－DR／DQ分子。结论 转入CⅡTA能使HeLa细胞表面表达MHCⅡ类分子表达，CⅡTA参与调控MHCⅡ类基因的转录和表达。     

腺病毒介导CⅡTA突变体基因转移抑制MHCⅡ类分子表达的体外研究

目的:构建携带小鼠MHCⅡ类分子反式激活因子(MHC class Ⅱ molecule transactivator,CⅡTA)突变体基因的腺病毒,并观察腺病毒介导该基因的表达情况以及表达产物的体外功能.方法:采用常规分子生物学方法从IFN-γ诱导后的BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞中获得Ⅳ型CIITAcDNA;利用重叠延伸PCR法构建CIITA突变体基因,并克隆入表达载体pIRES;采用pAdEasy-1系统获得具有感染能力的、携带CIITA突变体基因的缺陷型重组腺病毒(Ad-CIITAm)和空载对照病毒(Ad-GFP),并经大量扩增、纯化及滴度测定;将Ad-CⅡTAm和Ad-GFP分别感染HeLa细胞和Raji细胞,流式细胞术观察对诱导型和组成型HLA-DR分子表达的影响.结果:成功克隆了小鼠CⅡTA突变体基因,并构建了携带小鼠CⅡTA突变体基因的重组腺病毒Ad-CⅡTAm;经流式细胞术证实感染Ad-CⅡTAm的Hela和Raji细胞较感染Ad-GFP的细胞,其表面HLA-DR分子的表达均受到明显的抑制.结论:本实验证实了重组腺病毒介导表达的小鼠CⅡTA突变体在体外能够有效地抑制MHCⅡ类分子的表达.     

质粒介导的RNAi技术对大鼠CⅡTA和MHCⅡ基因表达抑制的检测

目的 研究应用质粒介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术对大鼠MHC Ⅱ类分子反式激活因子(MHCclass Ⅱ transactivator,C Ⅱ TA)和MHC Ⅱ基因表达的抑制作用.方法 根据大鼠CⅡTA基因信息,设计合成3条短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)并构建质粒载体,于体外转染大鼠骨髓源树突状细胞(DC)及体内转染大鼠脾脏,采用实时定量RT-PCR技术检测转染后DC和脾脏的C Ⅱ TA及MHCⅡ的mRNA表达变化,流式细胞术检测转染后MHCⅡ蛋白表达变化.结果 成功构建shRNA质粒载体,3个shRNA质粒转染组的DC和脾脏转染后的CⅡTA和MHC Ⅱ的mRNA表达水平及MHC Ⅱ抗原表达水平均明显减低(P<0.01),其中第1条shRNA的质粒转染组抑制效果最侍,C ⅡTA与MHCⅡ基因表达呈正相关.结论 应用C Ⅱ TA靶向shRNA质粒载体在体内外均能显著抑制C Ⅱ TA和MHC Ⅱ基因表达,为进一步基因治疗研究奠定实验基础.     

抗自身免疫的新途径-CⅡTA siRNA的体外筛选及活性

目的 探讨主要组织相容性复合物II类转录激活因子(CⅡTA)的siRNA对软骨细胞表面主要组织相容性复合物(MHC)Ⅱ类分子表达的抑制.方法 设计并合成针对CⅡTA编码区第176、741及3061位点的siRNA(分别为siRNA1、siRNA2、siRNA3).通过纳米载体介导siRNA稳定转染原代软骨细胞,流式细胞术检测经典的MHC-Ⅱ(HLA-DR、-DP、-DQ)类抗原表达,RT-PCR检测CⅡTA及其调控的MHC-Ⅱ类分子的mRNA水平.结果 在重组人干扰素(interferon, IFN)-γ诱导下,siRNA3阳性软骨细胞表面HLA-DR、-DP抗原表达分别降低了93.36%、94.16%,同时CⅡTA的mRNA含量明显减少.结论 siRNA3抑制了CⅡTA的mRNA含量,并阻止其调控的MHC-Ⅱ类分子的表达.     

CIITA M1-RNA抑制HeLa细胞表面MHC Ⅱ类抗原的表达

探讨MHC Ⅱ类转录激活因子(CIITA)的M1-RNA对细胞表面MHC Ⅱ类分子表达的抑制.M1-RNA是核糖核酸酶P的催化活性单位,设计并克隆针对CIITA第452、629位点的M1-RNA(分别为M1-452-GS、M1-629-GS)及其相应的CIITA靶基因,分别插入pUC19、pGEM-7zf( )载体,进行细胞外切割活性筛选.将细胞外切割作用明显的M1-629-GS亚克隆入psNAV载体(psNAV-M1-629-GS,pA629)并稳定转染HeLa细胞株,流式细胞术检测经典的MHC Ⅱ类抗原(HLA-DR、-DP、-DQ)的表达,RT-PCR检测CIITA的mRNA水平.在重组人γ干扰素诱导下,pA629阳性HeLa细胞株表面HLA-DR、-DP抗原表达分别降低了83.03%及89.91%;同时CIITA的mRNA含量明显减少(P＜0.05).CIITA的M1-RNA抑制了自身mRNA含量,从而阻止其调控的MHC Ⅱ类分子的表达,为移植物抗宿主病的研究提供了一种新方法.     

TLR激动剂抑制IL-27诱导的THP-1细胞HLA-DR的表达

目的研究白介素27(IL-27)对THP-1单核细胞系Ⅱ类转录活化子(classⅡtransactivator,CⅡTA)和Ⅱ类主要组织相容性复合物(major histocom patibility complex classⅡ,MHCⅡ)分子的表达的影响及Toll样受体(Toll-likereceptor,TLR)激动剂LPS和Pam3CSK4的干预作用。方法RT-PCR检测CⅡTAⅠ、Ⅲ和Ⅳ以及人白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)-DRA和干扰素调节因子-1(interferon regulatory factor-1,IRF-1)mRNA的表达。半定量PCR检测HLA-DRA、DRB、DPA、DPB、DQA、DQB、IRF-1、CⅡTA mRNA的表达。流式细胞术检测细胞表面HLA-DR的表达。结果IL-27刺激24h后可分别上调THP-1细胞CⅡTAⅢ、CⅡTAⅣ和IRF-1mRNA表达水平。IL-27刺激24h和48h可升高MHCⅡ类分子mRNA的表达,并能诱导HLA-DR在28%和53%的THP-1细胞表面表达。在THP-1细胞和PMA诱导的THP-1巨噬细胞,LPS和Pam3CSK4均可抑制IL-27诱导的CⅡTA和HLA-DR的表达。结论IL-27可上调THP-1细胞CⅡTA和MHCⅡ类分子的表达,这种作用可被LPS和Pam3CSK4抑制。     

012 CⅡTA研究进展

CⅡTA(MHC classⅡtransactivator)是近年新发现的转录活化因子,对MHCⅡ类分子的表达起严格且专一的调控作用.CⅡTA通过其细胞和组织专一性的启动子表达不同的转录本,并以此调节MHCⅡ类分子在不同组织及时段的特异性表达.CⅡTA蛋白与基础转录复合物及多种MHCⅡ类基因转录因子之间存在相互作用,并与之形成复合物以实现转录活化功能.对CⅡTA基因结构和功能的研究将极大地促进其在免疫调节和疾病治疗研究中的应用.     

Ⅱ类反式激活蛋白与免疫应答

MHCⅡ类分子在向CD4 T细胞提呈经过加工的抗原和诱发免疫反应中起重要作用。MHCⅡ类分子异常表达会引起裸淋巴细胞综合征等严重的免疫缺陷性疾病。目前已知CⅡTA是决定MHCⅡ类分子表达的主要调节因子。此外CⅡTA还影响着自身免疫性疾病、感染性疾病、肿瘤排斥、移植耐受等。因此,Ⅱ类反式激活蛋白作为影响诸多基因的单体蛋白,在干预MHCⅡ类分子提呈抗原途径上是理想的药物治疗靶点。     

068 CⅡTA对MHCⅠ/Ⅱ类分子的反式激活作用

CⅡTA(MHC classⅡtransactivator)指MHCⅡ类分子反式激活因子,与MHC Ⅰ/Ⅱ类基因及各种抗原递呈相关基因的表达密切相关,涉及的机理较为复杂.本文拟就CⅡTA对MHCⅠ/Ⅱ类分子的反式激活机理作一综述.     

氟伐他汀抑制内皮细胞MHCⅡ表达的研究

目的 研究氟伐他汀抑制干扰素-γ（IFN-γ）诱导的内皮细胞表面主要组织相容性抗原复合物Ⅱ（MHCⅡ）表达的作用，并研究其抑制作用的机理。方法 通过流式细胞仪检测分析MHCⅡ在内皮细胞中的表达，通过RT-PCR检测Ⅱ类反式激活因子（CⅡTA）mRNA的生成，通过Western blot分析信号转导和转录激活因子1（STAT1）的总量和磷酸化STAT1（P-STAT1）。结果 氟伐他汀预处理可以抑制由IFN-γ刺激诱导的内皮细胞表面MHCⅡ表达，RT-PCR分析表明CⅡTA mRNA的诱导生成可以被氟伐他汀阻断。Western blot分析表明氟伐他汀预处理并不影响STAT1的总量和在IFN-γ刺激后STAT1的磷酸化。结论在内皮细胞中，氟伐他汀预处理可以抑制由IFN-γ刺激诱导的CⅡTA mRNA的表达，并因此抑制了细胞表面MHCⅡ表达，这种抑制作用主要发生在CⅡTA的转录水平，可能与转录因子和CⅡTA启动子的结合有关。     

CⅡTA对MHCⅠ/Ⅱ类分子的反式激活作用

CⅡTA(MHCclassⅡtransactivator)指MHCⅡ类分子反式激活因子 ,与MHCⅠ /Ⅱ类基因及各种抗原递呈相关基因的表达密切相关 ,涉及的机理较为复杂。本文拟就CⅡTA对MHCⅠ /Ⅱ类分子的反式激活机理作一综述     

阿托伐他汀对实验性自身免疫性心肌炎MHCⅡ类分子表达的调节作用

目的探讨阿托伐他汀对实验性自身免疫性心肌炎（experimental autoimmune myocarditis,EAM）的作用及对心肌MHCⅡ类分子表达的影响.方法以纯化猪心肌肌球蛋白免疫Lewis大鼠诱导EAM模型.随机分为阿托伐他汀治疗组和未治疗组.治疗组给予阿托伐他汀每天10 mg/kg,未治疗组给予等体积饮用水,分别以灌胃器给药,连续用药3周.以未免疫的同周龄Lewis大鼠为正常对照组.用药21 d后,检测超声心动图,脾T淋巴细胞增殖试验、HE染色观察心肌组织炎症浸润程度,免疫组化检测心肌内CD4＋或CD8＋T细胞的浸润及心肌组织MHCⅡ类分子的表达.RT-PCR检测心肌Ⅰ型、Ⅲ型及Ⅳ型MHCⅡ类分子转录活化因子（classⅡ transactivator,CⅡTA）启动子转录.结果阿托伐他汀显著改善EAM大鼠心功能,治疗组心肌组织炎症浸润减轻,MHCⅡ类分子表达减少,抗原诱导的T淋巴细胞增殖显著受抑制.Ⅳ型CⅡTA启动子表达下调,而Ⅰ、Ⅲ型CⅡTA启动子表达与未治疗组比较差异无统计学意义.结论阿托伐他汀显著改善EAM大鼠心功能及组织病理学表现,其机制可能通过下调Ⅳ型CⅡTA启动子转录,抑制心肌非专职性APC MHCⅡ类分子表达.表明他汀类对EAM具有免疫调节效应,从而在器官特异性自身免疫性心肌损伤的治疗中具有应用前景.     

CⅡTA研究进展

CⅡTA(MHCclassⅡtransactivator)是近年新发现的转录活化因子 ,对MHCⅡ类分子的表达起严格且专一的调控作用。CⅡTA通过其细胞和组织专一性的启动子表达不同的转录本 ,并以此调节MHCⅡ类分子在不同组织及时段的特异性表达。CⅡTA蛋白与基础转录复合物及多种MHCⅡ类基因转录因子之间存在相互作用 ,并与之形成复合物以实现转录活化功能。对CⅡTA基因结构和功能的研究将极大地促进其在免疫调节和疾病治疗研究中的应用。