用体外致敏的鼻咽癌患者B细胞构建噬菌体抗独特型抗体库

目的 :构建噬菌体人源抗独特型抗体库。方法 :体外致敏并用EBV转化鼻咽癌患者的PBMC。用PCR分别扩增VH 和VL 基因并组成ScFv基因。将ScFv基因与载体连接后 ,转化大肠杆菌MC10 6 1,构建噬菌体呈现型ScFv库。结果 :经EBV转化的 10例鼻咽癌患者的PBMC中 ,8例有鼻咽癌抗独特型抗体产生。经多次PCR ,扩增出 5种VH(γ、μ)和 7种VL(κ、λ)基因 ,经连接组成 14种ScFv基因。将ScFv基因与载体连接后 ,导入大肠杆菌MC10 6 1。经四环素抗性筛选 ,得到库容为 1.1× 10 7的初级噬菌体抗独特型抗体库 ,噬菌体DNA中全长ScFv基因的插入率为 70 %。结论 :用体外致敏法结合噬菌体抗体库技术 ,制备人源抗独特型单链抗体(Ab2 βScFv)的策略是可行的     

人源Fab噬菌体抗体库的构建与抗精氨酸加压素抗体的筛选

目的:构建人源天然Fab噬菌体抗体库,筛选抗精氨酸加压素特异性抗体并进行初步鉴定。方法:从18位健康成人的外周血淋巴细胞,提取总RNA。利用RT-PCR扩增人Fab抗体基因片段,将其克隆至噬菌粒载体pComb3XSS内,构建人源天然Fab噬菌体抗体库。以固相化的精氨酸加压素为靶抗原对抗体库进行五轮筛选后,随机挑取50个单克隆进行phage-ELISA检测,阳性克隆行DNA测序分析。结果:成功构建库容为2.4×108的噬菌体抗体库,从中筛选到6株阳性克隆能够与精氨酸加压素特异性结合,其中阳性值最高的C4克隆行DNA测序分析证实其重链属IgG亚类,轻链为λ链。结论:构建大容量人源天然Fab抗体库,从中获得了特异性抗精氨酸加压素人源Fab抗体片段,有望为临床上精氨酸加压素的快速检测技术的建立奠定基础。     

人源性抗HBc单链抗体的筛选、鉴定及基因序列测定

目的:筛选人源性抗乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)单链抗体(ScFv)并在体外原核表达、鉴定和基因序列测定, 为抗HBcScFv的进一步研究奠定基础。方法: 采用噬菌体表面展示技术, 以乙肝病毒核心抗原为包被抗原, 从人源性单链噬菌体抗体库中经过3轮"吸附-感染-扩增"的筛选过程, 获得抗原结合活性较强的人源性抗HBc单链抗体阳性克隆, 并在大肠杆菌HB2151中进行ScFv可溶性表达, 对其进行免疫学鉴定和序列测定。结果:筛选出的ScFv具有抗HBc的特异性, 并可在大肠杆菌中进行可溶性表达;基因序列测定表明, 该ScFv的重链段基因与人类免疫球蛋白重链可变区相符, 轻链段基因为人类免疫球蛋白κ轻链可变区。结论:利用噬菌体抗体库技术, 成功筛选出人源性抗HBcScFv并获得其基因序列。     

抗PSMA全人源单链抗体制备、鉴定及初步应用

目的 构建抗PSMA全人源单链抗体库,筛选抗PSMA人源单链抗体(ScFv)并鉴定,应用人源ScFv进行分子显像.方法 从健康人外周血淋巴细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增人轻链和重链可变区基因,重叠PCR拼接轻重链可变区基因,构建ScFv的表达载体pDF-ScFv,电转染大肠杆菌XL1 Blue,获得噬菌体单链抗体库,酶切鉴定及测序分析,用PSMA抗原进行富集筛选,阳性克隆用Western-Blot 和DNA指纹图谱鉴定.应用直接标记法将125I标记在ScFv上,通过尾静脉注入前列腺癌动物模型体内,2h后进行小动物SPECT/CT显像,观察人源ScFv对前列腺癌的定位性能.结果 成功构建抗PSMA全人源单链抗体库,库容约2.16×108,插入片段经酶切及DNA测序证实为人抗体轻链和重链可变区基因.筛选出6株ScFv阳性克隆,Western-Blot证实6株ScFv均能与PSMA抗原特异性结合,DNA指纹图谱鉴定6株ScFv可变区基因具有多样性.动物模型的分子显像:人源ScFv能与前列腺癌PSMA抗原特异性结合,并使肿瘤显像.结论 成功构建了一个全人源噬菌体单链抗体库,并筛选出了抗PSMA单链抗体,单链抗体在动物模型体内能靶向结合前列腺癌细胞,从而为前列腺癌的靶向诊断和治疗奠定了基础.     

Sj-UV-致弱尾蚴单链抗体库的构建及筛选

目的构建和鉴定日本血吸虫（Schistosoma japonicum,Sj）紫外线（UV）-照射致弱尾蚴单链抗体（single chain Fv,ScFv）表达文库,并以此作为高通量的库源筛选出针对有潜在保护力的Sj尾蚴66-68 kDa抗原（Schistosoma japonicum cercariae antigen 66-68kDa,SCA66-68kDa）的单链抗体。方法选择最佳紫外灯照射条件,构建UV-致弱尾蚴小鼠模型,通过其血清被动转移实验证实其是否具有抗血吸虫攻击感染的保护效果;随后提取该小鼠脾脏mRNA,利用噬菌体展示技术构建UV-照射致弱尾蚴单链抗体库,并从库容量、多样性等方面进行鉴定;运用直接菌落挖集法以SjSCA66-68kDa筛选该抗体库,获得阳性克隆进行蛋白表达,再与SCA进行反应,验证其与SjSCA66-68kDa反应的特异性。结果构建UV-致弱尾蚴动物模型中的血清转移至小鼠体内得到42.5%的减虫率,显著高于日本血吸虫感染血清转移组的减虫率（28.0%）;日本血吸虫UV-致弱尾蚴单链抗体库的库容量测定为1.9×108,重组率为100%;运用抗原直接菌落挖集法筛选共获得6个SCA66-68kDa阳性克隆,经SDS-PAGE、Western-blot分析结果显示可溶性ScFv获得了正确表达,且与相应抗原SjSCA66-68kDa特异性结合,证实成功获得了特异性抗SjSCA66-68kDa单链抗体。结论成功构建了高效日本血吸虫UV-致弱尾蚴单链抗体库,从该库筛选共获得6个阳性克隆,均能诱导表达SjSCA66-68kDa特异性可溶性单链抗体。     

乙酰胆碱受体单链噬菌体抗体的筛选与鉴定

筛选乙酰胆碱受体（ＡＣｈＲ）单链抗体（ＳｃＦｖ），制备可溶性ＡＣｈＲＳｃＦｖ以预防、治疗和诊断重症肌无力。采用电鳐电器官的ＡＣｈＲ（ｔＡＣｈＲ）以亲和吸附法，从鼠源性噬菌体ＳｃＦｖ抗体库中筛选出ＡＣｈＲ特异性抗体。以ＥＬＩＳＡ鉴定噬菌体抗体的特异性，以免疫荧光技术鉴定噬菌体抗体对人肌肉冰冻切片中ＡＣｈＲ的结合特异性。经４轮ＡＣｈＲ筛选后，获得了能与ＡＣｈＲ结合的噬菌体抗体，这种抗体也能与人肌肉冰冻切片中的ＡＣｈＲ结合。以ｔＡＣｈＲ为抗原对噬菌体抗体库进行亲和吸附筛选，可以得到ＡＣｈＲＳｃＦｖ，并且这种抗体也能与人肌肉冰冻切片中ＡＣｈＲ特异性结合。     

噬菌体抗体库技术筛选结肠癌单抗MC3的抗独特型抗体

目的：获得结肠癌单抗MC3的噬菌体呈现型抗独特型抗体（anti-Id）。方法：分离经单抗免疫鼠脾脏的mRNA,经RT－PCR分别扩增抗体VH和VLDNA,进而连接形成ScFv DNA。将ScFv DNA与载体pCANTAB5E的连接产物转化于大肠杆菌TG1,经M13KO7挽救后获得噬菌体呈现型ScFv文库。以MC3对文库进行四轮筛选后,随机挑取克生经ELISA筛选呈现anti-Id ScFv的噬菌体克隆。结果：VH、VL和ScFv DNA分别约为340、320和750bp。抗体ScFv文库经四轮筛选后,在随机筛检的50个克隆中得到15个呈现antii-Id ScFv的菌体单克隆。结论：用噬菌体抗体库技术成功地获得了单抗MC3的anti-Id ScFv,从而为进行结肠癌重组anti-Id疫苗作用的研究提供了候选分子。     

识别胸腺髓质上皮细胞和胸腺树突状细胞的单链抗体的筛选

目的　利用噬菌体展示技术寻找胸腺基质细胞表面的新抗原。方法　用培养的胸腺基质细胞系MTDC作为靶抗原富集初级噬菌体抗体库 ,从经过富集后的次级抗体库中挑选克隆 ,制备单链抗体 ,并在冰冻切片及培养的细胞系上检测抗体的特异性。结果　从经 4轮富集的次级抗体库中挑选到一个新的克隆。用此克隆制备的单链抗体可同时辨认胸腺髓质上皮细胞亚群和胸腺树突状细胞亚群。结论　胸腺髓质上皮细胞和胸腺树突状细胞均具有异质性 ,同时噬菌体展示技术可以作为寻找细胞表面新分子的强有力工具。     

抗P选择素免疫小鼠单链抗体噬菌体展示文库的构建和筛选

目的 构建抗P－选择素的全套单链抗体噬菌体表面展示文库，从中筛选与P－选择素高亲合力的单链抗体，为其临床应用奠定基础。方法 从P－选择素免疫的小鼠脾淋巴细胞中提取总RNA，反转录成cDNA后，用抗体可变区混合引物扩增全套轻、重链可变区基因，经重叠延伸反应，装配成单链抗体（ScFv)基因，将其克隆到噬菌体载体pHEN1中，构建单链抗体噬菌体抗体库。对抗体库进行亲合筛选后，ELISA法鉴定抗活化血小板单链抗体。结果 经过5轮“吸附－洗脱－扩增”的富集过程，phage-ELISA得到一个ELISA活性较高的与P－选择素结合的克隆。序列测定符合抗体可变区结构特点。结论 成功构建了全套抗P－选择素单链抗体噬菌体展示文库，并筛选得到具有P－选择素结合能力的单链抗体基因。     

针对单克隆抗体MGb1的重组抗独特型抗体的筛选与鉴定

目的 利用噬菌体呈现技术筛选针对抗胃癌单克隆抗体（简称单抗）MGb1的重组抗独特型抗体（抗-Id）,为研制胃癌重组抗-Id瘤苗提供候选分子。方法 以单克隆抗体MGb1免疫Balb／c小鼠,取脾分离mRNA。RT-PCR分别扩增抗体VL和VH cDNA,经linker DNA连接形成ScFv DNA。将scFv DNA与载体pCANTAB5E的连接产物转化于大肠杆菌TG1,经M13KO7感染后,获得重组噬菌体抗体ScFv文库。以单抗MGb1对文库进行4轮淘选后,随机挑取克隆经ELISA筛选呈现抗-Id scFv的噬菌体单克隆,进而经竞争ELISA对其所属抗-Id类型进行初步鉴定。结果 VL和VH cDNA分别约为320和340bp,ScFv DNA约为750bp。抗体ScFv文库经四轮淘选后,在随机筛检的50个克隆中得到18个呈现抗-Id ScFv的噬菌体单克隆。在18个克隆中,有4个呈现β或γ型抗-Id ScFv。结论 经重组噬菌体抗体技术成功地筛选到了针对单抗MGb1的噬菌体呈现型抗-Id ScFv,从而为进一步获得能诱导抗胃癌免疫的抗-Id ScFv奠定了基础。     

人源抗丙型肝炎病毒噬菌体抗体库的构建、筛选及表达

用常规RT PCR法 ,直接从 5名丙型肝炎患者外周血混合淋巴细胞中扩增抗体重链Fd基因和κ轻链基因 ,构建噬菌体抗体Fab库。对抗体库进行 5轮吸附 洗脱 扩增的亲和选择后 ,以ELISA法鉴定抗HCV噬菌体抗体。 5轮亲和选择使特异性噬菌体抗体得到高度富集 ,抗HCV噬菌体抗体阳性克隆达 96 %。对一阳性克隆在大肠杆菌中表达 ,经ELISA及Westernblot分析鉴定 ,证实成功表达出人源可溶性Fab。对抗体基因VH和VκDNA序列进行测定 ,证实所获基因为抗体可变区基因。抗HCV噬菌体抗体库的构建和人源抗HCV单克隆抗体Fab段的制备 ,为HCV感染的诊断、治疗和发病机制的研究提供有效的分子工具。     

抗人纤维蛋白噬菌体单链抗体库的构建和鉴定

目的应用噬菌体展示技术构建抗人纤维蛋白单链抗体(scFv)文库,筛选高亲和力抗人纤维蛋白scFv并进行鉴定。方法利用人纤维蛋白免疫小鼠,分别扩增小鼠VH和VL基因,经重叠延伸聚合酶链反应(PCR)将VH和VL基因拼接成scFv基因,SfiⅠ/NotⅠ双酶切克隆入pCANTAB 5E噬菌粒载体,转化E.coli TG1构建成库,采用人纤维蛋白原对抗体库进行负筛选,人纤维蛋白进行正筛选,酶联免疫吸附分析(ELISA)检测阳性克隆的抗原特异性并进行测序分析。结果构建了库容为8.7×106的抗人纤维蛋白scFv库,ELISA测定显示scFv具有较高的抗原特异性;抗人纤维蛋白scFv基因序列长732 bp,编码244个氨基酸,VH和VL基因均有明确的3个互补决定区和4个骨架区。结论成功构建了抗人纤维蛋白scFv文库,并筛选到高亲和力的抗人纤维蛋白scFv,为新型血栓显像剂的开发奠定了实验基础。     

从大容量人源噬菌体抗体库中筛选抗黑素瘤特异性抗体

目的:用黑素瘤(MM)细胞系筛选大容量人源噬菌体抗体库,获得能与MM细胞特异性结合的人源性单链抗体(scFv)。方法:用完整的MM细胞对大容量人源噬菌体抗体库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”筛选,并通过细胞ELISA法对随机挑选的克隆进行抗原结合活性测定,得到的阳性克隆进一步做DNA序列测定和免疫组化染色鉴定。结果:从80个随机挑选的克隆中,筛得1株抗MM细胞的抗体,该抗体对人的鳞癌细胞、角质形成细胞、黑素细胞、角蛋白、胰蛋白酶、转铁蛋白及小鼠IgG等细胞或抗原的结合反应均呈阴性。免疫组化染色显示,该抗体与MM细胞系Libr的染色呈阳性,对黑素细胞和痣细胞的染色呈阴性。DNA测序结果表明,该抗体VH属于人IgGVH5亚群,VL属于人Vκ亚型。结论:通过筛选噬菌体抗体库获得到1株抗MM细胞的特异性抗体,为MM的靶向治疗研究奠定了基础。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白4A人源单链可变区抗体的筛选与鉴定

目的 利用噬菌体表面展示技术,从半合成人源化单链可变区抗体库中筛选、鉴定丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）非结构蛋白ＮＳ４Ａ的单链可变区抗体（ＳｃＦｖ）及其编码基因,为抗ＨＣＶ的细胞内免疫基因治疗研究开辟新途径。方法 采用噬菌体表达展示技术,以重组的ＨＣＶ非结构蛋白ＮＳ４Ａ为包被抗原,从噬菌单链可变区抗体库中经过３轮“吸附－洗脱－扩增”筛选过程,获得抗原结合活性较强的ＨＣＶ ＮＳ４Ａ人单链可变区抗体段阳性克隆     

人源抗梭曼过渡态类似物(P6)的抗体筛选

目的:从大容量天然噬菌体抗体库中筛选抗梭曼过渡态类似物的人源单链抗体(scFv)并进行鉴定。方法:以膦酸梭曼水解过渡态类似物五配位-羟基膦酸酯,3-羟基-1-对硝基苯基甲膦酸单频哪基醇酯,为半抗原,通过吸附-洗脱-扩增过程从大容量天然噬菌体抗体库中筛选特异性抗体,对其抗原结合活性进行鉴定。结果:经过4轮的筛选,分别获得14个抗梭曼类似物的阳性克隆。经DNA指纹分析,判断所获克隆分别包含4个不同的抗梭曼类似物的scFv基因。结论:利用噬菌体抗体库技术获得了特异性的人源抗梭曼类似物抗体。     

人源性bFGF单链抗体的筛选、表达及鉴定

目的 用重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)筛选大容量人源噬菌体抗体库,获得能与bFGF特异性结合的人源性单链抗体(scFv).方法 用rhbFGF对大容量人源噬菌体抗体库进行4轮"吸附-洗脱-扩增"筛选,并通过phage ELISA法对随机挑选的克隆进行抗原结合活性测定,得到的阳性克隆进一步进行原核可溶性表达及鉴定.结果 从104个随机挑选的克隆中,筛得39株抗bFGF的抗体,通过对抗体可变区基因进行多样性分析,发现存在8种不同抗体可变区基因,挑选其中8株phage ELISA显色最高的克隆进行酶切和测序鉴定,发现其中7株为正确的抗体基因序列,通过大肠杆菌成功的进行了scFv的可溶性表达,通过竞争ELISA发现其中一株scFv能够抑制bFGF与其高亲和力受体FGFR1βⅢC的结合.结论 通过筛选噬菌体抗体库获得到7株抗bFGF特异性抗体,其中一株抗体能够抑制bFGF与其高亲和力受体FGFR1的结合.     

Monitoring of scFv selected by phage display using detection of scFv–pIII fusion proteins in a microtiter scale assay

We describe here a method for the efficient and rapid analysis of antigen binding characteristics of recombinant antibodies (ab) selected by phage display. This novel approach combines the bacterial production of soluble single chain ab (scFv)–pIII fusion proteins on a microtiter scale with the detection of these fusion proteins via a pIII-specific ab. It facilitates the parallel analysis of large numbers of clones and is more efficient than current analysis protocols. Applying this technique, we analysed phage display selection of tetanus toxoid (TTX) specific scFv with respect to: (i) the productive expression of fusion proteins; (ii) the enrichment of specific scFv in subsequent rounds of phage display selection on a polyclonal level; (iii) the antigen specificity of individual scFv clones; (iv) the antigen binding affinity of a selected scFv. A TTX-specific scFv (clone 4.3) was further examined in a mono- and bivalent form by surface plasmon resonance analysis. ScFv 4.3 possesses a subnanomolar affinity and a low off rate constant.     

重链可变区基因随机CDR3ScFv噬菌体抗体库的构建及筛选

目的构建VH 基因随机CDR3ScFv噬菌体抗体库 ,并筛选抗HFRS病毒NP抗原的噬菌体抗体。方法采用随机引物PCR法扩增抗HFRS病毒mAb1A8的VH 基因 ,并与1A8VL 基因共同克隆入噬菌粒表达载体 pHEN1后 ,构建VH 基因随机CDR3ScFv基因库。继用辅噬菌体VCSM13超感染后得到噬菌体抗体库 ,然后用HFRS病毒抗原进行筛选。随机挑取筛选的菌落超感染 ,用夹心ELISA检测超感染上清。结果获得库容量约为107 噬菌体抗体库。夹心ELISA的结果表明 ,筛选出的噬菌体抗体可与HFRS病毒NP抗原特异性结合。结论成功地构建了库容量较高的ScFv噬菌体抗体库 ,并获得可与HFRS病毒NP抗原结合的噬菌体抗体。     

Subtractive Phage Display Selection from Canine Visceral Leishmaniasis Identifies Novel Epitopes That Mimic Leishmania infantum Antigens with Potential Serodiagnosis Applications

Visceral leishmaniasis (VL) is a zoonotic disease that is endemic to Brazil, where dogs are the main domestic parasite reservoirs, and the percentages of infected dogs living in regions where canine VL (CVL) is endemic have ranged from 10% to 62%. Despite technological advances, some problems have been reported with CVL serodiagnosis. The present study describes a sequential subtractive selection through phage display technology from polyclonal antibodies of negative and positive sera that resulted in the identification of potential bacteriophage-fused peptides that were highly sensitive and specific to antibodies of CVL. A negative selection was performed in which phage clones were adhered to purified IgGs from healthy and Trypanosoma cruzi-infected dogs to eliminate cross-reactive phages. The remaining supernatant nonadhered phages were submitted to positive selection against IgG from the blood serum of dogs that were infected with Leishmania infantum. Phage clones that adhered to purified IgGs from the CVL-infected serum samples were selected. Eighteen clones were identified and their reactivities tested by a phage enzyme-linked immunosorbent assay (phage-ELISA) against the serum samples from infected dogs (n = 31) compared to those from vaccinated dogs (n = 21), experimentally infected dogs with cross-reactive parasites (n = 23), and healthy controls (n = 17). Eight clones presented sensitivity, specificity, and positive and negative predictive values of 100%, and they showed no cross-reactivity with T. cruzi- or Ehrlichia canis-infected dogs or with dogs vaccinated with two different commercial CVL vaccines in Brazil. Our study identified eight mimotopes of L. infantum antigens with 100% accuracy for CVL serodiagnosis. The use of these mimotopes by phage-ELISA proved to be an excellent assay that was reproducible, simple, fast, and inexpensive, and it can be applied in CVL-monitoring programs.     

人源性抗汉坦病毒抗体VH基因噬菌体表面展示文库的构建与筛选

目的 构建人抗汉坦病毒（HV）抗体重链可变区（VH）基因噬菌体表面展示文库,筛选人源性抗HV单克隆抗体（mAb）。方法 从HV吸附筛选的特异性人外周血B淋巴细胞中,用RT－PCR扩增VH基因,与噬菌粒pHEN1连接,构建VH基因噬菌体表面展示文库。经3轮吸附－洗脱－扩增的亲和筛选后,用ELISA鉴定抗HV噬菌体抗体的活性。结果 HV吸附筛选的特异性人外周血B淋巴细胞中,成功扩增出VH基因,并构建了VH基因噬菌体表面展示文库。经3轮亲和筛选,获得24个具有与HV结合活性的重组噬菌粒克隆。对其中一个克隆的VH基因（VH－D10）的序列分析表明,该基因的全长为363bp,编码121个氨基酸,与EMBL和GenBank中所有已知免疫球蛋白（Ig）基因进行同源性比较,其同源序列均人为IgVH原因。结论 成功地构建了人抗HV抗体VH基因噬菌体表面展示文库,并筛选到有HV结合活性的重组噬菌体克隆,为制备人源性抗HVmAb奠定了基础。