早孕绒毛外细胞滋养细胞的体外培养方法

目的:探讨改良人早孕绒毛外细胞滋养细胞原代分离培养方法。方法:建立改良的复合酶消化梯度离心法,分离培养绒毛外细胞滋养细胞,通过免疫细胞化学、Giemsa染色和细胞侵袭实验检测细胞纯度、数量及生物学活性(侵袭性),并与低浓度胰蛋白酶消化方法进行比较。结果:低浓度胰蛋白酶消化方法和改良的复合酶消化梯度离心法所得贴壁细胞量分别为(11.69±1.26)×104和(17.21±0.51)×104,两者比较有统计学差异(P<0.05);绒毛外细胞滋养细胞纯度分别为(63.20±7.12)%和(92.10±5.11)%,两者比较有统计学差异(P<0.05),穿膜细胞数分别为(36.10±3.28)和(66.20±5.17),两者比较有统计学差异(P<0.05),提示该实验室改良的复合酶消化梯度离心法所得细胞总量、绒毛外细胞滋养细胞纯度及数量均显著高于低浓度胰蛋白酶消化方法。结论:该实验室改良的复合酶消化梯度离心法获得绒毛外细胞滋养细胞纯度和数量显著提高。     

两种人早孕绒毛滋养层细胞的原代培养方法

目的:比较两种不同方法进行人早孕绒毛滋养层细胞原代培养的异同。方法:分别用组织块培养法和3种酶联合消化法(Ⅳ型胶原酶、低浓度胰酶及DNaseⅠ)、Ficoll 400梯度密度离心法对人早孕绒毛滋养层细胞培养。结果:两种方法进行早孕滋养层细胞的培养均获得成功,其生长率比较差异无显著性意义(P>0.05)。结论:组织块培养法简单易行,但细胞数量少,生长缓慢,难以完成后续实验;3酶联合消化、Ficoll 400梯度密度离心法相比较而言,可获得数量更多的活力好、纯度较高的具有不同分化功能的滋养层细胞,为进一步研究其侵袭、增殖能力等生理、病理作用提供了坚实的基础。     

胎盘生长因子及瘦素在早孕绒毛及妊娠滋养细胞疾病中的表达及意义

妊娠滋养细胞疾病( gestational trophoblastic disease,GTD)是一组来源于胎盘绒毛滋养细胞的疾病.根据滋养细胞的分化程度、绒毛间质多少及生物学行为,GTD可分为葡萄胎、侵蚀性葡萄胎(invasivemole)、绒毛膜癌(chorionic carcinoma)及胎盘部位滋养细胞肿瘤[1].本研究排除胎盘部位滋养细胞肿瘤.     

人巨细胞病毒影响绒毛外细胞滋养细胞增殖功能的体外研究

目的:探讨人巨细胞病毒(HCMV)对绒毛外细胞滋养细胞增殖功能的影响。方法:选择绒毛外细胞滋养细胞株HPT-8进行研究,体外培养时加入HCMV,免疫荧光法检测HCMV PP65,MTT法检测不同浓度HCMV、不同作用时间对HPT-8增殖的影响。结果:病毒感染组HPT-8细胞内可见大量红色HCMV PP65抗原信号;与正常对照组比较,10～100μl病毒液作用12 h HPT-8增殖均无异常(P>0.05),70μl和100μl病毒液作用24 h HPT-8增殖明显抑制(P<0.05),20、30、40、50μl病毒液作用48 h HPT-8增殖均明显抑制(P<0.05),10μl病毒液作用72 h HPT-8增殖明显抑制(P<0.05);其中,48 h和72 h时间点,20μl、30μl、40μl病毒液导致的细胞增殖异常差异无统计学意义(P>0.05)。结论:HCMV可感染HPT-8并在细胞内复制,抑制细胞增殖。     

人正常早孕滋养细胞体外培养株的系统鉴定

目的 建立人早孕滋养细胞株（HPT-8）的系统鉴定方法。方法 通过光镜、扫描电镜、透射电镜、免疫组化和免疫荧光激光共聚焦的方法对体外培养出的HPT-8进行系统鉴定评价。结果 电镜下可见细胞表面微绒毛丰富；胞质丰富；内质网扩张明显，细胞间紧密的桥粒样结构连接；检测细胞胞浆中角蛋白18和波形蛋白均为阳性，细胞胞浆中角蛋白7为阳性，细胞膜上移动相关蛋白为阳性。表皮生长因子受体、滋养细胞趋化因子和胎盘碱性磷酸酶结果均阳性，而人绒毛促性腺激素和胎盘催乳素结果均为阴性。结论 通过多种方法对HPT-8进行形态、超微结构、蛋白骨架和功能指标的综合评价，可以较全面的确定体外传至72代的细胞株HPT-8为具有部分内分泌功能的滋养细胞株，为进一步开展实验研究建立细胞模型。     

维生素E对体外人绒毛膜滋养细胞抗凋亡保护机制的研究

目的探讨维生素E对体外人绒毛膜滋养层细胞的保护作用及机制,为维生素E保胎机制提供理论基础。方法以体外培养的滋养层细胞为模型,采用实时荧光定量PCR的方法检测维生素E对体外培养的滋养层细胞中Foxo3a和Survivin表达水平的影响,采用酶联免疫吸附方法分析维生素E对体外培养的滋养层细胞中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase3)活性的影响。结果维生素E下调Foxo3a表达水平;上调凋亡抑制基因Survivin表达水平;下调Caspase3活性水平,且250 mg/L实验组结果差异最显著。结论维生素E可能通过抑制Foxo3a的表达,从而促进Survivin表达,降低Caspase3活性水平,达到抑制细胞凋亡的作用,此研究为临床应用维生素E保胎治疗提供理论基础,为提高生育率、减少自然流产率及提高人口素质打下坚实的基础,具有重要的临床及社会意义。     

诊断超声对人早孕绒毛组织的影响

目的探讨诊断级B超对人胚胎发育的安全性。方法取120名孕6～8周拟行人工流产术的孕妇，随机分成正常对照组（Ⅰ组）、辐照5min（Ⅱ组）、10min（Ⅲ组）、20min（Ⅳ组）、30min（Ⅴ组）于1h内取绒毛，超声辐照30min（Ⅵ组）于7—10d后取绒毛。检测绒毛的生物化学变化。结果诊断剂量超声辐照20min可致人体宫内绒毛发生生物化学变化。丙二醛（MDA）值随超声剂量增加而升高（PⅠ—Ⅲ〉0．05，PⅠ-Ⅳ〈0．01，PⅠ—Ⅴ〈0．01），而超氧化物歧化酶（SOD）及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH—px）活性随超声辐照剂量增加而下降（PⅠ-Ⅲ〉0．05，PⅠ-Ⅳ〈0．01，PⅠ-Ⅴ〈0．01）。对照组与Ⅵ组比较P〉0．05，提示损伤作用是可复性的。结论诊断超声辐照时间20min以上时对绒毛可造成潜在危害。     

甲醛对人绒毛滋养细胞毒性的研究

目的：研究甲醛对人绒毛膜滋养细胞活性及分泌功能的影响。方法：收集9例早孕人工流产患者的绒毛组织,原代培养绒毛膜滋养细胞,分别加入50,100,150,200 μmol/L甲醛处理细胞48 h。用Cell Counting Kit-8（CCK-8）检测滋养细胞活性、放射免疫法检测人绒毛膜促性腺激素（hCG）水平。以DMEM/F12培养液为对照。结果：与对照组比较,100,150,200 μmol/L甲醛染毒组的细胞活性显著抑制,差异有统计学意义（均P＜0.05）;各组之间hCG水平差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：甲醛达到一定浓度时（≥100 μmol/L）对人绒毛膜滋养细胞的细胞活性有毒性作用。     

胰岛素生长因子Ⅱ促进人早孕滋养细胞的迁移和侵袭

目的:探讨胰岛素生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)对人早孕滋养细胞的迁移和侵袭力的影响。方法:采用原代培养人早孕滋养细胞,划痕实验检测不同IGF-Ⅱ浓度(0μg/L,10.5μg/L,26.5μg/L,52.5μg/L,112.5μg/L)对滋养细胞迁移力的影响,Ma-trigel侵袭试验分析不同浓度IGF-Ⅱ对滋养细胞的侵袭力的影响。结果:IGF-Ⅱ可以明显促进原代培养的人早孕滋养细胞的迁移和侵袭力,并随着药物浓度和时间的增加而增强,各组间有显著性差异。结论:IGF-Ⅱ可明显促进人早孕滋养细胞的迁移和侵袭能力,可能在绒毛外滋养细胞的入侵和胚胎着床过程中具有重要作用。     

诊断超声对人早孕绒毛细胞凋亡的影响及机制

目的:探讨诊断超声对人早孕绒毛细胞凋亡的影响及机制。方法:应用ALOKA5500彩色多普勒超声诊断仪,对拟进行人工流产的32例早孕(45～60天)妇女的孕囊进行不同时间的持续照射,孕妇随机分为4组:对照组(0min组)、10min组、20min组和30min组,照射后24h取材。DNA Lader检测人早孕绒毛细胞凋亡;Western blot检测胚胎组织Bcl-2、Bax、Cytochrome-C、Caspase-3蛋白表达及绒毛细胞线粒体和细胞浆内的Bax蛋白表达。结果:对照组和超声照射10min组绒毛组织未见到DNA核小体断裂,照射20min组DNA核小体断裂开始出现,照射30min组DNA核小体断裂最明显。超声照射10min组绒毛组织Bcl-2、Bax、Cytochrome-C、Caspase-3蛋白表达与对照组无差别;各实验组人早孕绒毛细胞内总Bax蛋白表达无明显改变;但超声照射20min组,细胞浆中的Bax表达减少,照射30min组明显减少,而线粒体中的Bax在照射20min组表达增加,30min组明显增加;Bcl-2蛋白在照射20min组表达下降,照射30min组明显下降,而Cytochrome-C和Caspase-3蛋白在照射20min组表达升高,照射30min组明显升高。结论:诊断超声持续照射早孕孕囊组织10min可引起绒毛滋养层细胞凋亡增加,且随照射时间延长而继续增加,超声诱导凋亡是通过线粒体途径。     

早孕期经腹绒毛穿刺125例临床分析

目的开展经腹绒毛取材在早孕期产前诊断中的应用,提前产前诊断的时间窗口。方法早孕期采用经腹绒毛取材125例,其中人工流产组38例,产前诊断87例。结果平均取材孕周(12.12±1.31)周;穿刺成功率第一阶段68.42%,第二阶段97.65%;对过度倾屈的子宫辅助调整子宫位置后穿刺率由88.07%提高到100%;培养成功率为98.17%。未发生穿刺相关的并发症,发现异常核型4例,而终止妊娠;已分娩正常新生儿62例,继续妊娠中21例。结论孕12周左右在超声引导下经腹绒毛取材是一项安全、可行的早孕期产前诊断方法,可前移产前诊断的时间窗口。     

人早孕流产蜕膜细胞的原代培养研究

目的建立纯度较高的适于实验研究的人蜕膜细胞。方法胶原酶I消化法培养人蜕膜细胞,光镜、扫描电镜、透射电镜观察细胞内部结构,间接免疫染色进行细胞鉴定。结果倒置显微镜下,可见细胞呈不规则多角形,呈片状铺展生长,核大卵圆形,胞质透明、糖原丰富,内质网扩张明显。免疫组化法检测细胞功能性指标胎盘催乳素,有99%培养的蜕膜细胞呈阳性。结论该法简便易行,可获得合乎实验要求的人蜕膜细胞,为进一步开展实验研究建立细胞模型。     

早孕期经腹绒毛活检产前诊断地中海贫血

目的 探讨绒毛活检在重型地中海贫血早期诊断的应用价值.方法 对40例夫妇双方均为地中海贫血基因携带者的孕妇在孕11～13 w时经腹抽取绒毛,进行地中海贫血基因检测,高龄者同时做粢色体核型分析.结果 40例孕妇绒毛抽吸均一次成功,诊断重型α-地中海贫血7例,重型β-地中海贫血2例,1例孕中期超声检查发现胎儿重度脑积水引产,余30例正常妊娠至足月分娩,新生儿无异常;8例高龄孕妇绒毛染色体检查核型正常.结论 早孕期经腹绒毛活检具有早期、快速和安全的特点,适用于地中海贫血的产前诊断.     

早孕合并子宫肌瘤人工流产术临床分析

目的:探讨早孕合并子宫肌瘤患者终止妊娠方式、手术并发症的预防和处理。方法:回顾性分析212例早孕合并子宫肌瘤终止妊娠患者的临床资料。结果:203例行电吸术及钳刮术,2例出血较多,为合并肌壁间肌瘤,直径>5cm。9例行药物流产术,顺利排出胎囊,排出时间平均136min。出血未超过月经量。结论:早孕合并较小子宫肌瘤病例(肌瘤结节<5cm),或者肌瘤位于浆膜下者,手术难度及风险较小。合并多发性、肌壁间子宫肌瘤,以及直径≥5cm的子宫肌瘤患者,人工流产手术并发症的发生率均明显增高。早孕合并子宫肌瘤行药物流产是可行、有效的,在药流过程中,严密观察、及时处理,可减少并发症的发生率。     

妊娠早期不良结局的相关因素分析

目的:探讨与早期妊娠不良结局的相关因素,为临床处理提供依据。方法:收集2005年1月～2007年12月产科门诊以停经就诊或者以阴道出血就诊而尿妊娠试验阳性的患者资料,填写调查表,追踪妊娠结局。结果:共收集病例508例,其中早孕不良结局者122例,包括不全流产9例,完全流产22例,过期流产7例以及异位妊娠62例。阴道出血是患者就诊的主要症状,阴道出血的发生率在不良妊娠结局组显著高于对照组(P<0.05),同时,年龄>35岁,既往有自然流产史或者异位妊娠史、不良生活习惯、高体重指数不良妊娠结局组与对照组相比差异均有显著性(P<0.05),而距离前次妊娠间隔<6个月、是否意愿或者计划妊娠,以及近3个月发热病史两组比较差异无显著性。结论:与妊娠早期不良结局相关的因素包括高龄、高体重指数、不良生活习惯、不良孕产史,应早期识别危险因素,避免延误诊断和过度检查。     

Leptin对人早孕期滋养细胞CXCR4、MMP_9及VEGF表达的影响

目的:研究不同浓度leptin对人早孕期滋养细胞表达CXCR4、MMP9及VEGF的影响。方法:分离、培养早孕期滋养细胞,并添加不同浓度的leptin,培养24 h后,RT-PCR法检测滋养细胞中CXCR4、MMP9及VEGF mRNA表达水平的变化。结果:添加了Leptin的滋养细胞表达CXCR4、MMP9及VEGF mRNA的量较空白对照组明显增加(P<0.01),其中,当Leptin剂量达到500 ng/m l时,CXCR4 mRNA 2倍增加、MMP9及VEGF mRNA均5倍增加。结论:Leptin能增强滋养细胞分泌CXCR4、MMP9及VEGF的能力。与早孕期滋养细胞分泌的CXCR4、MMP9及VEGF维系正常妊娠的作用相同,leptin可能在孕早期参与了胎盘形成等病理生理过程。     

两株人胚胎干细胞的无饲养层扩增

目的:建立两株中国人胚胎干细胞(hESCs)的无饲养层的培养体系,观察条件培养基所需的饲养层密度,并探索最佳的传代方式。方法:两株人胚胎干细胞hES-846XX和hES-1846XY分别使用不同密度(3×105/mL、6×105/mL和1.2×106/mL)获得的条件培养基(CM)在无饲养层培养体系培养12代以上,用机械分离法和Ⅳ型胶原酶法进行传代,观察比较结果并对所得hESCs鉴定。结果:6×105/mL～1.2×106/mL之间的密度都是合适密度;Ⅳ型胶原酶在长期传代中优于机械法传代;所得细胞维持干细胞未分化状态和全能性。结论:无饲养层的培养体系可以用于中国胚胎干细胞培养,两株中国人胚胎干细胞(hESCs)的倍增周期、所需饲养层密度及分化率等方面与国外hESCs有明显差别。     

160例米非司酮配伍米索前列醇不同给药方式在终止孕早期妊娠临床应用

目的:探讨米非司酮配伍米索前列醇不同给药方式在孕6～13周早孕引产中的应用效果。方法:回顾分析2006年1月～2009年10月要求终止妊娠患者160例。分析米非司酮配伍米索前列醇早孕引产的临床疗法及安全性,米非司酮总剂量为150mg,根据不同服药方法分为两日服法和3日服法;根据米索前列醇不同给药方式分为口服给药和阴道给药;将160例实验对象分为4组:A组米非司酮3日服法,第3日晨顿服米索前列醇500mg;B组米非司酮服法同A组,第3天晨阴道置入米索列醇500mg;C组米非司酮两日服法,第3天空腹顿服米索前列醇500mg;D组米非司酮服法同C组,第3天晨阴道置入米索前列醇500mg。结果:米非司酮配伍米索前列醇引产4组成功率均令人满意。相同剂量的药物,相同的给药途径引产效果差异无统计学意义(P>0.05),而不同的给药途径引产效果差异有统计学意义(P<0.05)。结论:非米司酮两日服法,即75mg每天1次顿服共2天,配伍米索前列醇500mg阴道给药的早期引产方法更为简便、安全、有效、痛苦小,值得临床推广应用。