多药耐药基因转染人骨髓间充质干细胞及对其化疗保护作用的实验研究

目的探讨逆转录病毒介导多药耐药基因（mdr1）体外转染人骨髓间充质干细胞（MSCs）能否提高其对化疗药物的耐受性。方法采用percon密度梯度离心法自骨髓中分离MSC并进行纯化和扩增；脂质体转染法将携带有mdr1基因的逆转录病毒载体导入293T包装细胞，获得的病毒上清感染MSC，流式细胞术测定mdr1基因编码产物P-糖蛋白（P-g170）的表达水平；罗丹明（Rh123）排泌试验检测P-g170的功能活性；MTT法测定转染MSC对化疗药物耐受性。结果mdr1基因导入骨髓MSC后稳定表达P-g170的阳性细胞百分率为33．9％，对照组为0．7％；Rh123排泌试验证实P-g170具有功能活性；转染MSC对多种化疗药物的耐受性明显强于未转染MSC。结论mdr1基因体外转染人骨髓MSC可明显提高MSC对多种化疗药物的耐受性，为有效提高大剂量化疗在肿瘤治疗中的应用提供了有力依据。     

急性髓细胞白血病患者多药耐药基因mdr1表达的研究

为了评估患预后，用ＲＴ－ＰＣＲ方法研究了２７例急性髓细胞白血病（ＡＭＬ）患骨髓细胞中ｍｄｒ１ｍＲＮＡ表达，同时用３例正常人白细胞、敏感Ｋ５６２和耐药Ｋ５６２／ＶＣＲ细胞系作对照。     

WT1基因转染增加白血病细胞凋亡的实验研究

为了探讨WT1基因异构体对急性早幼粒细胞性白血病细胞株NB4凋亡的影响及其分子机制,应用电穿孔的方法将携带WT1基因异构体WTA（-17AA/-KTS）全长cDNA的真核表达载体及其对照质粒pCB6^＋转导白血病细胞株NB4,建立WT1基因异构体表达比例改变的单克隆细胞株;用MTT、形态学观察、DNA凝胶电泳、An-nexin V结合力测定等方法观察WT1基因异构体表达比例的转变对白血病细胞NB4诱导凋亡的影响;用RT-PCR方法检测细胞中p21、p53、bcl-2、bcl-XL、和c-myc等凋亡相关基因表达的改变.研究结果表明,MTT显示NB4/WTA细胞对As2O3的IC50值较对照组明显降低;经As2O3作用48小时,NB4/WTA细胞Annexin V结合力较对照组细胞升高,出现更为典型的凋亡形态学改变;在DNA凝胶电泳可见更为明显的DNA梯形条带,RT-PCR检测提示NB4/WTA细胞p21、c-myc基因的表达较对照组高,bcl-2表达下降,p53、bcl-XL基因表达无明显改变.结论：增加外源性WT1基因异构体WTA的表达从而将WT1基因异构体表达的比例由＋17AA/＋KTS优势型转变为-17AA/-KTS优势型,能使NB4细胞对As2O3引起的凋亡更为敏感,这些改变可能与p21、c-myc等基因的表达上调和bcl-2基因的表达下调有关.     

多药耐药基因在人骨髓CD34+细胞中的表达及对化疗药物的耐受性

目的　探讨人多药耐药 (MDR1)基因过表达能否提高骨髓造血干 /祖细胞对化疗药物的耐受性。方法　应用免疫磁性分选系统 (miniMACS)体外分离、纯化骨髓CD34 细胞并进行扩增 ;采用脂质体介导的基因转移方法 ,将人MDR1基因转染骨髓CD34 细胞 ,并运用流式细胞术检测基因转导前后造血干 /祖细胞中MDR1基因的编码产物 Pl70糖蛋白表达和功能变化。MTT法检测基因转导前后造血干 /祖细胞对化疗药物耐受性的改变。结果　MDR1基因转导后 4 8h骨髓造血干 /祖细胞Pl70抗原表达为 (2 3 6± 2 34) % ,明显高于转导前 (11 2± 2 2 ) % (P <0 0 1)。P170的功能活性被Rh 12 3的摄取和排除试验证实。转基因后细胞表现为典型的多药耐药表型 ,对P170谱的多种化疗药的耐受性提高了约 2～ 8倍 ,对非P170谱的顺铂、氨甲喋呤耐受性没有改变。结论　人多药耐药基因能提高骨髓造血干 /祖细胞对多种化疗药物的耐受性 ,表现为典型的多药耐药表型。     

骨髓基质细胞对白血病细胞株的保护作用

目的研究原代正常骨髓基质细胞与白血病细胞耐药、抗凋亡的关系。方法应用Percoll分离骨髓基质细胞14份,设实验组体外与白血病细胞共培养组,模拟骨髓微环境功能,另设单独悬浮培养组;同时没自发凋亡组做对照。AnnexinV/PI双标法检测3组白血病细胞凋亡率。结果共培养后骨髓基质细胞抑制药物诱导的白血病细胞凋亡率较对照组显著降低(P<0.005)。结论骨髓基质细胞对白血病细胞有保护作用。     

多西环素诱导表达下IL-3基因转染小鼠骨髓基质细胞促进造血

本研究探讨用多西环素调控IL-3基因表达的小鼠骨髓基质细胞系对小鼠造血干细胞增殖分化的促进作用。构建含小鼠IL-3基因逆转录病毒载体系统，转染小鼠骨髓基质细胞系，获得QXMSClTet-on-IL-3；体外加入多西环素诱导IL-3基因表达并检测IL-3表达活性；观察细胞培养条件上清液对造血祖细胞集落形成单位的作用及QXMSClTet-on-IL-3与骨髓细胞共培养对造血干细胞增殖分化的影响。结果表明：多西环素提高了QXMSClTet-on-IL-3细胞系IL-3的表达，促进骨髓造血祖细胞克隆形成数；与骨髓细胞共培养可促进造血干细胞的增殖分化。结论：应用多西环素诱导外源基因转染的骨髓基质细胞IL-3的表达，可促进造血。     

双耐药基因导入脐血干／祖细胞降低联合化疗骨髓毒性作用的临床前研究

目的　探讨转染醛脱氢酶基因 (ALDH3)和多药耐药基因 (mdr 1)的人脐血CD3 4 细胞能否同时增强对活性环磷酰胺 (4 HC)和mdr 1基因靶药的抗性。方法　构建含ALDH3和mdr 1双耐药基因的逆转录病毒表达质粒G1Na ALDH3 IRES MDR1,经LipofectAMINE介导转染包装细胞 ,采用含 4 HC和长春新碱 (VCR)的培养基克隆选择后收集重组病毒上清于单向型GP E86与双嗜型PA317包装细胞行乒乓交互感染 ,将含ALDH3和mdr 1双耐药基因重组病毒的上清在细胞生长因子刺激下重复感染经免疫磁珠分离系统 (MACS)纯化后的人脐血CD3 4 细胞 ,用PCR、RT PCR、Southernblot、Northernblot、FACS和MTT等方法检测外源ALDH3与mdr 1基因在CD3 4 细胞中的转移和表达。结果　MACS分离纯化后的人脐血CD3 4 细胞纯度平均达 91% ,回收率为 72 % ,含双耐药基因重组病毒的上清最高滴度为 6 .5× 10 5CFU/ml,应用集落计数、PCR和FACS方法测定基因转导效率分别为 18.0 %、2 0 .0 %和16 7% ,未检测到辅助病毒存在 ,有P170功能的细胞占 16 0 % ,经双耐药基因修饰的脐血CD3 4 细胞对 4 HC的IC50 较对照组提高 3.5倍 ,对VCR和柔红霉素的IC50 较未转染细胞分别高 6 .8和 5 .5倍。结论　逆转录病毒载体介导双耐药基因转导脐血造血干 /祖细胞获高效共表     

转染IL-3基因的骨髓基质细胞促进骨髓移植小鼠造血功能重建

为了探讨可调控表达IL 3基因的骨髓基质细胞系对异基因骨髓移植小鼠造血功能重建的促进作用 ,建立了可诱导表达IL 3基因的工程化骨髓基质细胞系QXMSC1tet on +IL 3,加入多西环素 (Dox)诱导骨髓基质细胞系表达IL 3并检测其活性。C5 7BL/ 6 (H 2 b)小鼠经γ射线致死剂量照射后 ,输入供体BALB/C(H 2 d)小鼠去除T细胞的骨髓细胞 1× 10 7/只 ,同时输注骨髓基质细胞QXMSC1tet on +IL 35× 10 5/只 ,并灌服多西环素诱导IL 3表达。在第 30天 ,6 0天检测骨髓移植小鼠外周血红细胞 ,白细胞数 ,骨髓有核细胞数 ,骨髓CFU S ,CFU GM ,CFU E和CFU GEMM数。结果表明 :成功建立可诱导表达IL 3基因的骨髓基质细胞系QXMSC1tet on +IL 3,异基因骨髓移植共输注基质细胞系QXMSC1tet on +IL 3可使异基因骨髓移植小鼠外周血红细胞、血小板、白细胞明显恢复 ,骨髓中有核细胞数 ,CFU S ,CFU GM ,CFU E ,CFU GMEE明显增加。结论 :输注基因工程化基质细胞 ,并诱导细胞因子IL 3基因表达可以进一步促进异基因骨髓移植小鼠造血功能重建     

用逆转录－多聚酶链反应检测白血病患者多药耐药基因的表达

作者应用逆转录－多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测２５例急性白血病患者骨髓细胞中ｍｄｒ＿１基因的表达。以Ｋ５６２敏感细胞和体外诱导的耐药细胞株Ｋ５６２／Ａ０２分别作为阴性和阳性对照，发现复发和未缓解患者中ｍｄｒ＿１表达增高者占９０．９％（１０／１１），而初治患者中仅为２１．４％（３／１４），ｍｄｒ＿１表达增高者化疗效果差。应用单克隆抗体ＪＳＢ－１检测Ｐ－１７０结果与ＲＴ－ＰＣＲ一致。此ＲＴ－ＰＣＲ具有高度敏感性，可以检出２Ｐｇ的ｍｄｒ＿１ｃＤＮＡ，对于检测白血病ｍｄｒ＿１的表达是一种灵敏、特异的方法。     

急性白血病多药耐药基因表达与化疗的关系--附25例临床分析

目的：了解急性白血病多药耐药基因表达情况与临床化疗的关系。方法：对２５例初治急性白血病人采用逆转录ＰＣＲ技术检测多药耐药基因（ＭＤＲ１），并对其阳性和阴性表达的２组病人化疗效果进行分析，结果；本组病例ＭＤＲ１阳性表达６例（２４％），以急性非淋巴细胞白血病为主，占５例，这６例ＭＤＲ１阳性的急性白血病患者，没有１例经１个疗程化疗即能完全缓解，ＭＤＲ１阳性的急性白血病患者，完全缓解率为２／６，ＭＤＲ１阴     

扩增人脐血造血干/祖细胞重建SCID小鼠造血的实验研究

目的　探讨Ｆｌｔ３ 配基（ＦＬ） 、Ｔｐｏ、ＳＣＦ等细胞因子组合对人脐血干／ 祖细胞的扩增及自我更新能力的维持作用。方法　用ＦＬ＋ Ｔｐｏ＋ ＳＣＦ＋ＩＬ６ ＋ＩＬ３＋ ＧＣＳＦ组合,体外扩增脐血ＣＤ３４ ＋ 细胞１４天,将其移植给亚致死剂量照射的ＳＣＩＤ小鼠。结果　扩增的脐血造血细胞可顺利植入ＳＣＩＤ小鼠并重建造血,１８ 只小鼠移植后存活６ 周的有８ 只,其骨髓中仍可检测到人的造血细胞,死亡率５６ ％ ,与对照组（ 死亡率１００％） 比较,χ２ ＝１０．０８,Ｐ＜０．０１。结论　ＦＬ＋ Ｔｐｏ＋ ＳＣＦ＋ＩＬ６ ＋ＩＬ３ ＋ ＧＣＳＦ组合在有效扩增造血细胞的同时可保留造血干／祖细胞的自我更新及造血重建能力。     

IL-3影响脐血单个核细胞体外扩增、凋亡及再植入能力的研究

目的探讨细胞因子IL-3对脐血单个核细胞(MNC)体外扩增、凋亡和植入能力的影响,寻找扩增后脐血应用于临床移植的可行方案。方法采用早期作用的细胞因子组合对脐血MNC进行短期无血清悬浮培养,比较有或无IL-3支持的扩增效果和细胞凋亡变化;MNC扩增6d后移植给亚致死剂量照射的非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠,观察6周后存活小鼠的人脐血细胞植入情况。结果脐血MNC在有IL-3支持的体系中培养6~10d获得最佳扩增效果,同时细胞表面膜联蛋白V(annexinⅤ)的表达明显减少;移植6周后存活小鼠的骨髓、脾和胸腺细胞中能检出人类CD45抗原,外周血提取的DNA也能检出人特异的Alu序列。结论短期培养下IL-3有助于脐血单个核细胞体外适度扩增,减少凋亡且并不损伤扩增后细胞的植入能力。     

人骨髓及脐血间充质干细胞体外大量扩增及建库的质量控制

目的:研究人骨髓和脐血间充质干细胞(MSC)的体外培养特性及建立细胞库的可行性。方法:Ficoll离心剂法分离人骨髓及脐血来源单个核细胞,进行体外培养并大量扩增,观察细胞生长特性,流式细胞术检测MSC表面分子标志物表达情况。结果:骨髓样本比脐血标本的MSC更易于体外短期培养扩增,骨髓样本(5×106)体外培养2周约获得MSC3×107～1.2×108,成功率达100%,而脐血样本的MSC较难培养,成功率低(12.9%),细胞数扩增有限。对冻存复苏前后的细胞进行流式细胞术检测提示MSC表面标志物CD29、CD44、CD59、CD90、CD105、CD166等均阳性表达,造血细胞标志物CD34、CD14和CD45为阴性表达,提示MSC对本室的冻存复苏程序耐受能力较好,可获得复苏后扩增培养。结论:本研究表明对成人骨髓MSC建库的条件较成熟,获得成功培养的MSC分子表型在冻存复苏前后无明显改变。而脐血来源的MSC培养条件有待改善方能提高MSC培养成功率。     

NOD/SCID小鼠脐血单个核细胞骨髓腔内移植的实验研究

目的观察骨髓腔内移植(iBM)人脐血单个核细胞(MNC)对小鼠造血重建和免疫功能恢复的作用。方法NOD/SCID小鼠经137Cs全身照射后,在4h内无菌条件下局部麻醉后从尾静脉或骨髓腔内输注分离脐血MNC。受体小鼠随机分为5组:①对照组:骨髓腔内输注培养液;②阳性对照组(iTV):尾静脉输注脐血MNC3×107/只;③实验Ⅰ组(iBM1):骨髓腔内输注脐血MNC3×106/只;④实验Ⅱ组(iBM2):骨髓腔内输注脐血MNC1×107/只;⑤实验Ⅲ组(iBM3):骨髓腔内输注脐血MNC3×107/只。对照组4只小鼠,实验Ⅱ组7只小鼠,其余每组5只。24h后观察iBM22只小鼠未移植侧胫骨骨髓腔脐血细胞的迁移分布,动态观察移植后小鼠的存活和造血重建情况,7～8周后处死各组小鼠,检测骨髓细胞表面CD分子表达、碳青花(DilCM)染料示踪研究和脐血βactin的DNA标记。结果①照射后骨髓腔内输注脐血MNC,24h后在未输注脐血MNC的一侧胫骨骨髓细胞膜有DilCM标记;②7～8周后小鼠存活14只,其中对照组存活1只,iTV组、iBM1组各存活2只,iBM2组存活4只,iBM3组存活5只;③外周血常规检查结果显示iBM组白细胞的恢复速度比iTV组和对照组快而且稳定;④移植后存活小鼠骨髓细胞表面CD45标记、DilCM染料示踪研究和βactin均显示人源的标记。结论经iBM途径移植脐血MNC至NOD/SCID小鼠骨髓可以重     

多药耐药基因在骨髓移植模型中的表达

目的 探讨多药耐药基因（mdrl)在骨髓移植小鼠模型中表达情况，及转染mdrl的骨髓细胞对化疗中骨髓保护的可行性。方法 以小鼠骨髓细胞为靶细胞，通过逆转录病毒介导，将mdrl转入骨髓细胞，通过将转染基因的骨髓细胞回输同种小鼠体内的骨髓移植动物模型，观察不同时期移植小鼠骨髓细胞中mdrl的表达及功能，结果 （1）成功地将mdrl导入小鼠骨髓细胞中，转染率达到35%；（2）采用程序性移植方法成功建立了mdrl转基因鼠骨髓移植模型；（3）mdrl在移植小鼠细胞内稳定，有效地表达，观察1-5个月mdrl转染的细胞在受体鼠骨髓单个核细胞中所占比例分别为8.0%，8.0%,7.5%,4.0%,3.0%;(4)mdrl转染的骨髓细胞在化疗中有明显的骨髓保护作用。结论 从一个侧面证实了通过mdrl转染骨髓细胞在化疗中进行骨髓保护是一种长期，稳定，有效的方法。     

p27基因下调对人骨髓和脐血造血祖细胞体外活性的影响

目的比较干扰p27基因表达对骨髓和脐血来源造血祖细胞增殖和造血潜能的影响,并探讨其相关机制。方法以含p27全长反义cDNA逆转录病毒感染经流式细胞仪分选的人骨髓与磁珠分离获得的人脐血来源的CD34+细胞,在含混合生长因子条件下体外培养不同时间,分别观察细胞生长曲线,检测细胞周期,确定细胞增殖能力;半固体培养计数集落形成,确定其造血能力;Westernblot检测p27与CDK2蛋白表达,明确基因转染效果并探讨p27反义cDNA促进细胞扩增的作用途径。以含p27全长正义cDNA和仅含绿色荧光蛋白(GFP)基因的病毒感染细胞为对照。结果与GFP和p27正义cDNA比较,p27反义cDNA对脐血造血祖细胞生长有明显促进作用(P<0.01),至培养第9天p27反义cDNA、p27正义cDNA和GFP组细胞数分别增加了(197.3±47.7)倍、(12.7±8.1)倍和(41.8±30.6)倍;骨髓造血祖细胞数增加不明显,至培养第9天3组细胞数分别增加了(36.0±22.3)倍、(8.7±6.8)倍和(14.1±10.4)倍。p27反义cDNA主要促进脐血和骨髓造血祖细胞S期增加,p27反义cDNA、p27正义cDNA和GFP组脐血造血祖细胞S期细胞百分比为(17.0±4.8)%,(2.0±0.8)%和(4.1±1.8)%;骨髓造血祖细胞则为(8.4±4.4)%,(1.0±0.7)%和(3.8±1.4)%。p27反义cDNA对骨髓和脐血的集落形成能力促进作用高于GFP组(P<0.0     

外周血涂片与骨髓细胞形态、骨髓活检用于骨髓增殖性疾病患者诊断中的临床效果

目的：探究骨髓增殖性疾病患者应用骨髓细胞形态、外周血涂片和骨髓活检诊断的临床效果。方法从本院2011年6月至2016年2月接收并进行诊断的骨髓增殖性疾病患者中随机性抽取100例,分为对照组和研究组,每组各50例,并进行回顾性而分析和探究,采用骨髓细胞形态、外周血涂片和骨髓活检技术联合进行检查诊断,对照组单纯采用骨髓涂片诊断,分析两组患者采用不同方式诊断的效果与特点。结果从抽取的100例骨髓增殖性疾病患者分别采用骨髓细胞形态、外周血涂片和骨髓活检技术联合诊断和单一骨髓涂片诊断,结果显示,研究组应用联合诊断法效果较好,检出率明显高于对照组（P＜0．05）,差异性较大,具有统计学研究价值。结论针对骨髓增殖性疾病采用骨髓细胞形态、外周血涂片和骨髓活检联合诊断效果较好,检出率更高,值得在临床诊断中应用和推荐。     

Carlecortemcel-l: an ex vivo expanded umbilical cord blood cell graft for allogeneic transplantation

Background: Success of umbilical cord blood transplantation (UCBT) is mostly affected by the cell dose infused and its application is limited by the size of the recipient. For most adults and older children it is not possible to find a single UCB unit large enough for reliable engraftment. One strategy to increase the number of progenitor cells available is ex vivo expansion of the unit. The main challenge of ex vivo expansion systems is how not to deplete the self-renewing cell population by driving them into differentiation into committed progenitors. Objective: Copper modulates basic cell functions, such as survival, proliferation, and differentiation. Reduction of cellular copper in ex vivo culture conditions enabled preferential proliferation of early progenitors and increased engraftment capabilities. The result of a Phase I study of carlecortemcel-l, a product derived from ex vivo expansion of UCB progenitors in the presence of a copper chelator and early-acting cytokines, and the study design for the current pivotal study are presented. Methods: A literature review using PubMed and the investigator's brochure from the manufacturer. Conclusions: Early results suggest that carlecortemcel-l infusion is safe and may be associated with favorable non-relapse mortality rates. A pivotal global study is currently being conducted to evaluate safety and efficacy of this product from centralized manufacturing facilities.     

异基因骨髓移植小鼠供体骨髓细胞在受体内的分布及淋巴细胞供受体来源比例分析

目的观察小鼠异基因骨髓移植(alloBMT)后供体骨髓细胞在受体内的分布以及嵌合体内T、B淋巴细胞增殖分化规律。方法以绿色荧光蛋白(GFP)转基因C57BL/6J(H2b)小鼠为供体,以137Cs5.5Gy×2照射的BALB/c(H2d)小鼠为受体,分别于移植后3天(+3天)、+7天、+21天、+35天和+70天取外周血、骨髓、胸腺、脾脏、肠集合淋巴结及肝脏,用流式细胞仪和荧光显微镜观察供体来源的骨髓细胞分布。用藻红蛋白标记的抗CD4、抗CD8、抗B220抗体检测+21天小鼠体内骨髓、外周血及其他免疫器官中T、B淋巴细胞的构成比例。结果①+3天、+7天供体骨髓细胞在受体脾脏中分布最多,分别为(1.06±0.02)%、(76.60±1.80)%;骨髓中分别为(0.37±0.06)%、(39.70±5.38)%。②+21天受体骨髓、脾脏、淋巴结、胸腺及外周血中供体细胞达60%～90%。③+3天受体肠集合淋巴结中供体骨髓细胞达(0.36±0.04)%,与受体骨髓中供体骨髓细胞的比例相当。结论①alloBMT后早期供体骨髓细胞可分布到受体的骨髓、脾脏、肠集合淋巴结中,脾脏中最多。②+21天受体内骨髓及其他免疫器官以供体细胞为主。③受体肠道集合淋巴结也是移植后供体骨髓细胞的早期寄居点和B淋巴细胞增殖后的迁移部位。     

非血缘脐血移植与非血缘骨髓/外周血干细胞移植治疗恶性血液病临床疗效的研究现状

异基因造血于细胞移植(allo-HSCT)是有望治愈恶性血液病的重要治疗手段.由于人类白细胞抗原(HLA)相合的相关供者(MRD)来源有限,非血缘脐血移植(UCBT)与非血缘骨髓移植(UBMT)/非血缘外周血干细胞移植(UPBSCT)均为重要的allo-HSCT方式.目前,国内外均无随机对照研究比较三者的疗效与安全性,为了指导恶性血液病患者移植方案的选择,本文将国内外UCBT与UPBSCT/UBMT疗效比较的回顾性临床研究结果进行总结.