施万细胞对共培养的神经干细胞增殖与分化的影响

目的：探讨施万细胞诱导神经干细胞增殖与分化的影响因素。方法：大鼠胚胎神经干细胞单独培养及与新生SD大鼠施万细胞共培养，观察神经干细胞的形态变化，并分别检测特异性标志蛋白S-100、NF和GFAP的表达。结果：相差显微镜下可见共培养组大部分神经干细胞伸出多个细长突起；与单独培养组相比，免疫荧光染色显示共培养组NF表达阳性细胞数多；GFAP表达阳性细胞数少。结论：施万细胞可促进共培养的神经干细胞增殖，并可诱导神经干细胞向神经元方向分化。     

褪黑激素体外定向诱导骨髓间充质干细胞的研究

目的:探讨褪黑激素(melatonin,MT)体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)不同时段向神经细胞分化的情况。方法:采用细胞培养技术分离培养和纯化大鼠MSCs,以MT为诱导剂诱导大鼠MSCs向神经细胞分化。分别在诱导后3,7,10,14 d以免疫荧光法测定神经干细胞特异性标志(nestin)、神经元细胞特异性标志(neurofilament,NF)和星形胶质细胞特异性标志(GFAP)的表达。结果:MT诱导分化3 d,部分细胞胞体收缩成三角形,有些成为简单的双极或多极细胞。诱导3 d细胞开始表达nestin,7~14 d表达nestin和NF,细胞不表达GFAP。结论:MT可诱导大鼠MSCs分化为神经细胞。     

靳三针疗法对窒息脑瘫幼鼠神经干细胞增殖与分化的实验研究

[目的]观察靳三针疗法对脑瘫大鼠神经干细胞(NSCs)增殖与分化的影响.[方法]选用SD新生大鼠,随机分为假手术组、模型组、靳三针疗法治疗组(治疗组,针刺百会、颞Ⅰ针、曲池、内关、足三里、涌泉),模型组与治疗组均采用结扎单侧颈总动脉法复制脑瘫大鼠模型,其中治疗组于手术后24 h开始针刺,共14 d.各组于造模后15 d处死大鼠制备脑组织提取液.另取健康SD新生大鼠,取大脑海马部位,分离、扩增NSCs,采用免疫细胞化学法检测NSCs特征性标记Nestin与Brdu表达,以鉴定培养的细胞及体外分化能力.培养细胞分为正常对照组,低、高浓度组(分别加入100、300μL/mL.的治疗组脑组织提取液),培养1、3、5 d后,采用免疫细胞化学法和免疫荧光法检测各组神经元样细胞和星形胶质样细胞的特征性标志物神经丝蛋白(NF)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,观察各组NSCs分化情况.采用流式细胞术检测各组NF、GFAP阳性细胞数,观察脑组织提取液促进NF、GFAP表达的时效和量效关系.[结果]扩增后的细胞球Nestin与Brdu均呈阳性,证实体外培养的细胞为NSCs,并处于分裂增殖旺盛期.细胞培养1、3、5 d后,NF、GFAP染色均呈阳性,且正常对照组阳性细胞少,低、高浓度组明显增多,呈浓度依赖性,表明NSCs已分化为神经元细胞和星形胶质细胞.同一时间段内低、高浓度组NF、GFAP阳性细胞数均较正常对照组显著增高(P<0.05或P<0.01),高浓度组在培养1、3、5 d后,NF、GFAP阳性细胞数也显著增高(P<0.05或P<0.01),表明治疗组脑组织提取液可促进NF、GFAP表达,且呈一定的量效和时效关系.[结论]靳三针疗法治疗脑瘫可能是通过促进NSCs的增殖和定向分化,从而达到修复脑损伤的目的.     

益气活血化痰中药复方对大鼠胚胎神经干细胞生长分化增殖的影响机制研究?

目的研究益气活血化痰药物血清对体外培养的大鼠胚胎神经干细胞(NSC)生长分化增殖的影响。方法细胞分为空白血清组、含药血清组、阻滞剂组、含药血清+阻滞剂组和培养基对照组5组。采用细胞培养、血清药理学、免疫荧光等技术,观察中药复方血清对大鼠NSC生长分化的影响;相差显微镜进行形态学观察;免疫荧光染色技术,检测各组细胞nestin、神经元特异性烯醇化酶(NES)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,观察神经干细胞的分化。结果益气活血化痰中药对神经干细胞无毒性,并能够促进神经干细胞生长分化。nestin蛋白在诱导分化24 h内表达最强,诱导72 h后nestin表达明显减弱直至消失。益气活血化痰中药组NES和GFAP阳性细胞数明显增加。结论益气活血化痰药物血清有促进NSC生长分化增殖的作用。     

蒺藜皂苷诱导SD新生大鼠海马神经干细胞分化的实验研究

目的 探讨蒺藜皂苷对于诱导SD新生大鼠海马神经干细胞(neural stem cells, NSCs)分化的影响作用以及蒺藜皂苷培养液浓度变化对其的影响.方法 采用无血清和单克隆培养方法,将蒺藜皂苷加入离体的海马NSCs的培养液中,应用Nestin、BrdU、NF200、GFAP免疫荧光染色观察NSCs的形态及分化而来的神经元、神经胶质细胞形态,并检测由海马NSCs分化而来的细胞的数量.结果 海马NSCs在无血清培养下,可形成Nestin阳性细胞球.在诱导分化后,免疫荧光染色可见NF阳性细胞、GFAP阳性细胞,而其中20 mg/kg 蒺藜皂苷干预组海马NSCs向神经元的分化比例最高.结论 在蒺藜皂苷的作用下,海马NSCs向神经元分化的数量增多.     

表皮生长因子促进胚胎神经干细胞生长分化的研究

目的:观察表皮生长因子EGF对胚胎神经干细胞生长分化的影响。方法:从孕11d大鼠胚胎神经管分离神经干细胞,分为EGF组和对照组,进行体外培养。观察神经干细胞的生长,显微测量细胞突起长度,在第3、7天用免疫组化方法检测细胞神经元特异烯醇化酶(NSE)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,并观察神经干细胞分化为神经元及神经胶质细胞的状况。结果:加入EGF后,细胞生长旺盛,细胞突起长度明显高于对照组;免疫组化染色结果显示,培养3、7d时,NSE、GFAP阳性细胞数均明显多于对照组。结论:EGF既能促进胚胎神经干细胞的生长,也可促其分化为神经元及神经胶质细胞。     

大鼠视网膜共培养诱导神经干细胞分化为视网膜神经节细胞

目的:研究新生大鼠视网膜组织与胚胎上丘源神经干细胞共培养对干细胞分化的影响.方法:采用机械分离、无血清培养基选择培养的方法从孕14 d的胚鼠上丘中获取神经干细胞并传代培养.使用组织-细胞共培养系统将出生4 d的乳鼠视网膜组织与上丘源神经干细胞共培养,观察干细胞分化过程,对分化细胞进行鉴定,并与干细胞的自然分化过程进行比较.结果:从胚鼠上丘中获得的细胞在无血清培养条件下聚集呈球形悬浮生长,可以持续传代培养,具有多向分化能力,经免疫荧光鉴定证实为神经干细胞.新生大鼠视网膜组织与胚胎上丘源神经干细胞共培养促进干细胞的分化,并诱导分化出Thy1.1阳性细胞.结论:从胚胎大鼠上丘可以分离培养神经干细胞,与新生鼠视网膜组织共培养可以诱导上丘源神经干细胞分化出视网膜神经节细胞.     

丙泊酚对大鼠胚胎神经干细胞增殖及分化的影响

目的探讨丙泊酚对体外培养大鼠胚胎神经干细胞(NSCs)增殖及分化的影响。方法采用孕14～16 d Wistar大鼠,进行NSCs原代培养并用Nestin鉴定,按以下给药分成六组:空白对照组(control)、脂肪乳对照组(introlipid)、丙泊酚不同浓度组[5、25、50、100μmol/l],用5-溴脱氧尿(Brdu)掺入法观察丙泊酚对胚胎神经干细胞增殖的影响。胚胎神经干细胞诱导分化过程中加入50μmol/l丙泊酚,采用NeuN、GFAP免疫组化法观察丙泊酚对胚胎神经干细胞分化的影响。结果分离培养的神经干细胞95%以上呈Nestin阳性,不同浓度丙泊酚组Brdu阳性细胞百分数没有差异,丙泊酚NeuN阳性细胞百分数(23.1±0.9%)明显高于对照组(13.4±0.8%)(P<0.05),而GFAP细胞阳性细胞数与对照组相比没有明显差异。结论临床相关剂量丙泊酚对体外培养大鼠神经干细胞增殖没有影响,但能诱导神经干细胞向神经元细胞分化。     

成人骨髓间质干细胞诱导分化为神经元样细胞及其与细胞分裂的关系

目的探讨成人骨髓间质干细胞(hMSC)向神经元样细胞分化过程中分化与细胞分裂的关系。方法从成人骨髓中分离骨髓间质干细胞(MSC),培养扩增。用参芪液诱导MSC分化为神经元样细胞,经免疫组化鉴定其神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。诱导后进行神经元样细胞计数,掺入Brdu测定,计算标记系数。采用双标记间接免疫荧光法检测神经元样细胞特异性表面标记(NSE、NF)与细胞分裂的标记Brdu的关系。抑制DNA合成,计算Brdu、NSE和NF阳性细胞数。结果MSC经参芪液诱导后,可见神经元样细胞。免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF阳性,GFAP阴性。MSC诱导分化后的细胞总数增加,诱导分化后12h内细胞增殖较快。30%以上分化的神经元样细胞在表达NSE和NF的同时可见Brdu标记,而另一部分分化的神经元则无Brdu标记。抑制DNA合成,并不会阻止神经元的分化,仍有70%的分化神经元表达神经元特异性标记蛋白NSE。结论MSC诱导分化的部分神经元样细胞可进行细胞分裂,但抑制细胞分裂不影响神经元分化。     

维甲酸对MESPU35胚胎干细胞系神经定向分化的影响

目的 了解维甲酸(Retinoic acid,RA)对MESPU35胚胎干细胞系诱导分化的影响。方法小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层，培养MESPU35细胞系，4—/4 法诱导其神经定向分化。结果 相差显微镜观察RA诱导MESPU35细胞系出现神经样细胞拟胚体百分率随分化时相点和RA浓度升高而升高，免疫细胞化学观察分化的NF200和GFAP阳性细胞随分化时相点和RA浓度升高而增加，NF200阳性细胞由无突起变为多极细胞，GFAP阳性细胞突起由短变长，最后联结成网状。流式细胞仪检测分化的GFAP、NF200阳性细胞比例变化与免疫细胞化学结果相符。结论 RA诱导MESPU35细胞系神经定向分化的调节以浓度和时间依赖模式进行，提示其神经定向分化产生的高比例神经细胞可以用于移植治疗。     

体外共培养诱导骨髓间充质干细胞向雪旺细胞分化

目的:观察体外雪旺细胞环境对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的诱导分化作用。方法:分离和体外培养新生大鼠MSCs和雪旺细胞;实验组MSCs经DAPI标记后与雪旺细胞按1∶2比例共培养,观察细胞的形态变化,在第1,3,6天时使用免疫细胞化学染色检测MSCs中Nestin,GFAP及S-100表达。对照组MSCs单独培养,其余处理与实验组相同。结果:共培养1 d后部分MSCs出现雪旺细胞样形态,Nestin表达率为(83.4±3.5)%,随时间增加而降低。GFAP及S-100表达率随时间而增加。对照组细胞形态无变化,不同时间点均有少量MSCs表达Nestin,而GFAP和S-100未见表达。结论:MSCs可通过体外共培养向雪旺细胞分化。     

补阳还五汤对神经干细胞生长分化的影响

目的 :观察补阳还五汤对神经干细胞生长分化的影响。方法 :取孕 12d大鼠胚胎神经管上皮细胞 ,分别接种在灌服补阳还五汤的鼠血清和对照鼠血清的培养基内。不同培养时间内观察细胞的生长状况 ;用MTT法检测细胞活性 ;用免疫组化染色法检测神经元特异烯醇化酶 (NSE)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果 :药物血清组神经干细胞的生长明显好于对照组 ,OD值高于对照组 ;免疫组化染色显示 ,NSE、GFAP免疫阳性细胞药物血清组均多于对照组。结论 :补阳还五汤药物血清可促进神经干细胞的生长、存活和向神经元及神经胶质细胞的分化。     

Differentiation of rat neural stem cells and its relationship with environment

Objective To explore the differentiation fates of rat neural stem cells (NSCs) in different environmental conditions. Methods NSCs derived from 16-day-old rat embryo were proliferated in vitro and implanted into the brain of rats with intra-cerebral hemorrhage. At the same time some NSCs were co-cultured in vitro with Schwann cells derived from newborn rats. MAP-2, GFAP and GalC (which are the specific markers of neural cells, astrocytes and oligodendrocytes respectively),BrdU and β-tubulin were detected by immunohistochemical and immunofluorescent methods.Results BrdU positive cells that were implanted into the brain distributed around the hemorrhagic area.The majority of them were GFAP positive astrocytes while a few of them were β-tubulin positive neural cells or GalC positive oligodendrocytes. After being co-cultured with Schwann cells in vitro,NSCs are predominately shown β-tubulin and MAP-2 positive,and only a minority of them were GFAP or GalC positive.Condusions The hemorrhagic environment in vivo induces NSCs to differentiate mainly into astrocytes while co-culture with Schwann cells in vitro induce the majority of NSCs to differentiate into neural cells.     

大鼠背根神经节源干细胞分离培养和鉴定

目的：探讨大鼠背根节（DRG）内是否存在神经干细胞。方法：取胚胎大鼠DRG进行原代细胞培养,观察其增殖与分化情况,并行P75BrdU/Nestin,GFAP,NF200免疫荧光组织化学鉴定。结果：细胞培养获得大量能够分裂增殖且呈巢状悬浮生长的干细胞团,呈P75BrdU/Nestin免疫荧光组织化学阳性反应;培养第三代细胞加入胎牛血清10d后,相差显微镜下可见部分细胞伸出多个细长突起,且免疫组化呈NF200阳性;部分细胞具有扁平多突起的或双极细胞形态,免疫组化呈GFAP染色阳性。细胞球经NGF培养诱导1d左右有些神经元样的细胞开始迁出,随着时间增长迁出的细胞越来越多,并且细胞和细胞之间发生联系,形成交错的复杂网络,迁出的细胞经免疫组化鉴定几乎都是呈NF200免疫染色阳性。结论：大鼠DRG内存在有神经干细胞,这些细胞可以分化为神经元和神经胶质细胞。     

Study on the adoption of Schwann cell phenotype by bone marrow stromal cells in vitro and in vivo

To explore the possibilities of bone marrow stromal cells （MSCs） to adopt Schwann cell phenotype in vitro and in vivo in SD rats. Methods MSCs were obtained from tibia and femur bone marrow and cultured in culture flasks. Beta-mercaptoethanol followed by retinoic acid, forskolin, basic-FGF, PDGF and heregulin were added to induce differentiation of MSCs＇. Schwann cell markers, p75, S-100 and GFAP were used to discriminate induced properties of MSCs＇ by immunofluorescent staining. PKH-67-1abelled MSCs were transplanted into the mechanically injured rat sciatic nerve, and laser confocal microscopy was performed to localize the PKH67 labelled MSCs in the injured sciatic nerve two weeks after the operation. Fluorescence PKH67 attenuation rule was evaluated by flow cytometry in vitro. Results MSCs changed morphologically into cells resembling primary cultured Schwann cells after their induction in vitro. In vivo, a large number of MSCs were cumulated within the layer of epineurium around the injured nerve and expressed Schwann cell markers, p75, S- 100, and GFAP. Conclusion MSCs are able to support nerve fiber regeneration and re-myelination by taking on Schwann cell function, and can be potentially used as possible substitutable cells for artificial nerve conduits to promote nerve regeneration.     

大鼠脂肪源性干细胞来源的施万样细胞的增殖能力

目的：通过检测大鼠脂肪源性干细胞（ADSCs）来源的施万样细胞的增殖能力,探讨其在神经修复再生领域的应用及其意义。方法：取大鼠附睾旁脂肪组织进行ADSCs的分离与培养;将第4代ADSCs在β-巯基乙醇（β-ME）、反式维甲酸（ATRA）、血小板衍生因子AA（PDGF-AA）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、腺苷酸环化酶激活剂（Forskolin）和Heregulin-β的联合作用下诱导分化为施万样细胞。采用免疫荧光法、Western blotting法和Real-time PCR法检测施万细胞（SCs）标记物S-100β、P75和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达水平;采用MTT法检测施万样细胞的增殖能力,观察其有丝分裂增殖现象。结果：诱导分化后的施万样细胞呈梭形、栅栏样排列。S-100β、P75和GFAP蛋白免疫荧光为Cy3/FITC标记,阳性产物位于细胞浆及其突起。Western blotting和Real-time PCR法检测,施万样细胞中S-100β、P75和GFAP蛋白和mRNA表达水平明显高于ADSCs（P<0.01）。MTT法检测,施万样细胞有较强的有丝分裂增殖能力。结论：ADSCs能够成功被诱导分化为施万样细胞,并表达SCs标记物;施万样细胞有较强的有丝分裂增殖能力,可作为神经组织工程理想的种子细胞。     

吡咯喹啉醌对大鼠雪旺细胞形态及增殖细胞核抗原表达的影响

目的:观察吡咯喹啉醌(PQQ)对体外培养雪旺细胞的形态、细胞数量及雪旺细胞内增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响。方法:从出生3-5dSD大鼠坐骨神经分离培养雪旺细胞,纯化并经S-100免疫荧光标记鉴定;设立对照组和实验组,分别加入100nmol/LPQQ和等量PBS培养48h后倒置显微镜下观察细胞形态并进行细胞计数;将不同浓度的PQQ(0,10,50,100,500nmol/L)加入雪旺细胞培养基中,培养48h后提取总mRNA及总蛋白进行PCNA的RT-PCR和Western blotting检测。结果:100nmol/LPQQ干预雪旺细胞48h可以使细胞的形态发生变化并使细胞数量增加,细胞数量较对照组增加13.6%;RT-PCR及Western blotting检测结果表明:PQQ浓度在10-500nmol/L浓度范围内可增加雪旺细胞内PCNA的表达,且当PQQ浓度为100nmol/L时该上调效应最明显,分别是对照组的2.0倍和3.4倍。结论:PQQ可增加体外培养雪旺细胞的数量;并可使体外培养雪旺细胞内PCNA表达上调。     

大鼠脂肪干细胞源性神经球分化为雪旺细胞样细胞

目的:体外诱导大鼠脂肪干细胞为雪旺细胞样细胞?方法:分离?培养和鉴定大鼠脂肪干细胞;表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)诱导大鼠脂肪干细胞为神经球,并对神经球进行鉴定;视黄酸?forskolin?血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)及heregulin等诱导神经球为雪旺细胞样细胞,并对雪旺细胞样细胞的形态和表面标志物进行鉴定?结果:大鼠脂肪干细胞为成纤维细胞样单层贴壁细胞,表达间质细胞标志物fibronectin,不表达神经干细胞标志物nestin,并能进行成脂和成骨分化?大鼠脂肪干细胞能被诱导为悬浮生长的神经球;神经球表达nestin,不表达fibronectin,并能进一步分化为雪旺细胞样细胞?雪旺细胞样细胞呈双极或三极,并表达雪旺细胞经典标志物胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)?S100和p75?结论:大鼠脂肪干细胞能在体外分化为雪旺细胞样细胞?这种雪旺细胞样细胞对于治疗神经系统疾病具有重要意义?