应用含内参的多重实时荧光RT-PCR方法快速检测登革病毒和基孔肯雅病毒

目的 建立一种登革病毒、基孔肯雅病毒并含人类基因内参检测的多重实时荧光RT-PCR方法,能在同一反应管内同时检测目前发现的所有来源的登革病毒或基孔肯雅病毒。方法 针对登革病毒3′端非编码区和基孔肯雅病毒结构蛋白E2-6K-E1区以及人体各类组织细胞中均能稳定表达的RNAse P基因,设计了3套特异性引物和探针,建立了1套能同时检测登革病毒、基孔肯雅病毒及含有人类基因检测内参的多重实时荧光RT-PCR方法,对其灵敏性和特异性进行了验证,并对临床发热病人标本进行了应用评估。结果 该方法对检测体外转录合成的登革病毒和基孔肯雅病毒RNA的灵敏性可达最低每个反应10～100拷贝,对检测登革1型病毒和基孔肯雅病毒的灵敏性分别可达最低每个反应0.1 TCID₅₀/mL和1 TCID₅₀/mL。用20株登革病毒、4株基孔肯雅病毒和日本脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、盖塔病毒、辛德毕斯病毒各1株进行检测,方法的特异性均为100%。方法应用于189份发热病人血清标本检测,可准确地鉴定出其中登革病毒或基孔肯雅病毒核酸阳性的标本,且所有血清标本均能被内参引物和探针有效地扩增和杂交。结论 本研究建立了一种高灵敏性、高特异性且含人类基因内参检测的登革病毒和基孔肯雅病毒多重实时荧光RT-PCR检测方法,可作为登革热或基孔肯雅热病人早期快速鉴别诊断的有效工具,也可用于蚊媒携带登革病毒或基孔肯雅病毒的高通量快速筛查。     

登革病毒IgM抗体快速检测试纸条检测效果的初步研究

目的 初步评价登革病毒IgM抗体免疫层析试剂条的检测效果。方法 应用4种血清型登革病毒重组外膜抗原,组装登革病毒IgM抗体通用型和分型免疫层析试纸条,检测登革病毒IgM抗体,结果与捕获法ELISA比较。同时观察分型试纸条的血清学分型效果。结果 以4型抗原混合组装的通用型试纸条检测结果与捕获法ELISA检测结果比较,二者的总体符合率为93％,两种检测结果无显著差异（p>0.05）。与捕获法ELISA比较,通用型检测试剂可能具有更低的假阳性。分型结果表明,除登革I型外,其它型别试纸条均能检出非对应型别的IgM抗体。结果 利用登革病毒重组抗原组装的通用型IgM抗体免疫层析试纸条与捕获法ELISA检测效果相当,具有实际应用的潜力,但需要进一步做大样本的评估。而分型试纸条分型效果不佳,需要进一步的改进。     

快速免疫色谱测试法与免疫荧光法检测登革病毒IgG抗体的比较

目的：应用登革热快速免疫色谱测试法（Dengue Fever Rapid Immunochromatographic Test,DRIT)与间接免疫荧光法(Indirect Immunofluorescent Assay,IIF）检测登革病毒IgG抗体进行比较。方法：DRIT按说明操作,在Control线区出现紫红色线的前提下在IgG线区出现紫红色线表明IgG抗体阳性;IIF抗原片系应用本室分离的登革II型病毒感染C6／36细胞制备,操作按常规进行。结果：检查临床疑似登革热病人血清56份,IIF检测阳性30份,阳性率53.6％。DRIT检查阳性26份,阳性率46.4％,两法符合率91.07％,X^2=1.50,P＞0.05。检测无症状人血清68份,IIF检查阳性37份,阳性率为54.4％。DRIT检查阳性23份,阳性率为33.8％,两法符合率73.53％,X^2=9.39,P＜0.01。结论：检测病人血清两法无显著性差别,具有操作简单,时间较短,结果易观察等优点。IIF成本较低,检测病人或无症状人群IgG抗体均较敏感,仍不失为理想的常规方法。     

登革病毒的检测技术研究进展

登革热病毒 (denguevirus,DV)属于黄病毒科黄病毒属 ,是有包膜的单股正链RNA病毒 ,基因组长约 11kb ,整个基因的编码顺序为 :5’Ⅰ型帽子结构、非编码区、AUC蛋白 (核衣壳蛋白 )基因、M蛋白 (膜蛋白 )基因、E蛋白 (包膜蛋白 )基因、NS1- 2a- 2b - 3- 4a - 4b - 5基因、非编码区 3’〔1〕。DV分为 4个血清型 (1～ 4 ) ,可引起隐性感染、登革热 (denguefever,DF)和登革出血热 (denguehemorrhagicfever,DHF) ,严重的还可导致登革休克综合征 (dengueshocksyndrome,DSS)。随着全球气候变暖和城市化进程的加快 ,登革热病例正在迅速增加 ,…     

基于微流控核酸等温扩增的登革病毒现场快速检测技术研究

[摘要]?目的?结合环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）和微流控芯片技术,建立一种适合现场快速检测登革病毒的方法。方法?利用RT-LAMP,针对登革病毒基因组中3’非编码区中特异性序列进行扩增,建立基于微流控芯片技术的LAMP检测方法,优化检测体系,并对该方法的灵敏性和特异性进行评估。结果?基于LAMP 和微流控芯片技术的登革病毒检测方法,通过对病毒模板进行扩增,发现与其他病毒无交叉反应,特异性良好;同时,结果显示该方法对登革病毒检测灵敏性可达61.2 pg/μl,与实时荧光定量PCR仪所达到的检测灵敏性一致。结论?基于LAMP和微流控芯片技术的登革病毒检测方法具有操作简单、快速、对设备要求低等优势,并且灵敏性、特异性均较好,是一种便于开展现场快速检测的方法。     

寡核苷酸芯片技术在甲型流感及登革病毒检测分型中的初步应用

目的 建立寡核苷酸芯片检测技术,对甲型流感病毒及登革病毒进行早期检测及分型.方法 根据Genebank中病毒基因组序列的保守区域,设计病毒的特异性检测探针,制备病毒检测芯片;利用限制性显示技术标记样品中的病毒靶序列,将标记产物与芯片杂交、清洗、扫描及结果分析.结果 该方法可以正确检测到细胞培养所获得的甲型(H1N1,H3N2)流感病毒和登革四型病毒.结论 寡核苷酸芯片技术可应用于多种病毒及其亚型的早期检测.     

登革病毒在白纹伊蚊体内的扩散和分布

研究登革病毒在蚊体内的扩散途径及分布对分析蚊体内的屏障、决定政体对病毒的敏感器官及评价经卵传递病毒在流行病学上的作用具有一定的意义。国内作者对蚊虫感染及传播登革病毒、病毒在蚊体内的繁殖动态进行过报道。本文对登革病毒在白纹伊蚊体内的扩散和分布进行观察。     

猪乙脑病毒IgG抗体间接免疫荧光检测方法的建立与初步应用

目的建立检测猪血清中流行性乙型脑炎病毒(JEV)IgG抗体的间接免疫荧光试验(IFA)。方法用乙脑病毒感染C6/36白蚊伊蚊细胞制备抗原片,建立检测猪血清中JEV-IgG抗体的IFA方法,并用于猪乙脑血清流行病学调查。结果成功建立特异的猪JEV-IgG的IFA检测方法,并对50份母猪、55份仔猪和65份屠宰猪的血清进行检测。乙脑血清抗体效价≥1:200的分别为88.00%,10.91%和24.62%。结论建立的IFA方法能较好的用于猪血清乙脑流行病学调查。     

快速检测技术在奶牛结核病检测中的应用研究

目的 评价快速检测技术在奶牛结核病检测中的应用,为改进奶牛结核病检疫工作提供实验室数据支持.方法 2010-2012年对上海市5家奶牛场9355头奶牛采用牛分枝杆菌提纯结核菌素皮内超敏反应方法（PPD试验）进行牛结核病筛查,筛查出223头阳性牛,5家奶牛场分别采用随机数字表法抽取PPD阳性牛,共抽取PPD阳性牛49头;无菌采集肺部淋巴结组织样本,采用MGIT 960液体培养法对奶牛组织中分枝杆菌进行快速分离培养,采用免疫色谱法和基因测序进行快速基因分型及菌种鉴定.结果 49头PPD试验阳性牛的组织样本,经MGIT 960液体培养、免疫色谱法初筛、基因分型和基因序列分析,最终病原学检测证实受分枝杆菌感染的奶牛有8头,其中受牛分枝杆菌感染的奶牛1头,受非结核分枝杆菌感染的奶牛7头,分别为鸟分枝杆菌感染6头,不产色分枝杆菌感染1头.结论 建议将分枝杆菌快速分离培养及菌种鉴定检测技术引入到对PPD阳性牛的实验室诊断中,进一步提高牛结核病检测的特异度.     

HIV抗体快速检测在自愿咨询检测中的应用

目的在AIDS自愿咨询检测(voluntary counselling and testing,VCT)中应用快速检测,并与免疫印迹试验(western blotting,WB)结果比较,探讨进一步缩短确证时间及提高HIV感染者CD4+T淋巴细胞检测率的措施。方法用2种快速试剂进行筛查,对一阴一阳或双阳性样本进行WB确证检测,并比较和评价检测结果,同时采集患者血样行CD4+T淋巴细胞检测。结果 1435份样本中,1种或2种快速试剂检测结果为阳性有398份,经WB检测确证377份阳性,符合率94.7%;2种快速试剂检测结果均为阳性的有379份,WB检测确证376份阳性,符合率99.2%;2种快速试剂检测结果为阴性的有1037份,经PCR检测未发现HIV RNA阳性样本。结论在VCT及各种应急检测时,可用快速试剂进行筛查,然后WB确证,以缩短等待时间,提高CD4+T淋巴细胞检测率。同时为保证检测质量,以防漏检,推荐使用2种质量优良的快速试剂同时筛查。     

RT-PCR-RFLP技术在登革病毒感染早期诊断中的应用

目的建立疑似登革病毒感染的病原快速鉴定分型方法,并对2004年我院收治的一例疑似登革感染患者进行确诊。方法用免疫层析法(ICT)检测DV-IgM抗体、免疫斑点法(DIBA)检测DV-IgG抗体对疑似登革病毒感染患者进行动态监测;用登革病毒通用引物通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增患者血清中的登革病毒核酸,用限制性内切酶BstnⅠ酶切,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析鉴定分型。结果发病第5天患者DV-IgM抗体开始呈弱阳性,第9天DV-IgM抗体滴度达到1∶8,第13天DV-IgM抗体滴度开始下降;发病第9天患者DV-IgG抗体呈弱阳性,第12天DV-IgG抗体滴度达到1∶8。用RT-PCR-RFLP检测疑似登革病毒感染患者早期血标本,确定2004年我院收治的一例患者为登革Ⅰ型病毒感染所致。结论利用RT-PCR-RFLP技术对登革病毒进行分型鉴定具有敏感、特异、快速的优点,与登革热抗体检测结合起来应用可缩短疑似登革感染的确诊时间、降低检测成本,具有很好的社会效益和经济效益。     

乙脑病毒嵌套式RT-PCR检测方法的建立及初步应用

目的　建立适用于检测人用猪源性生物制品中外源性乙脑病毒(JEV)的嵌套式RT- PCR方法。方法　根据已公布的JEV序列(GenBank登录号为M5 5 5 0 6 ) ,设计合成两对引物,对JEV感染的乳鼠脑组织和培养JEV的BHK 2 1细胞抽提RNA进行RT PCR和RT nestedPCR ,将PCR产物进行了克隆测序;同时对猪细小病毒(PPV)、猴空泡病毒4 0 (SV4 0 )及正常乳鼠脑组织、正常BHK 2 1细胞、PK15细胞、BSC 1细胞提取核酸进行PCR ,并对2 10份临床样品进行了检测。结果　PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测,JEV感染的乳鼠脑组织和培养JEV的BHK 2 1细胞均扩增出10 15bp和6 2 2bp目的基因片段,而PPV、SV4 0及未感染JEV的乳鼠脑组织、正常BHK 2 1细胞、PK15细胞、BSC 1细胞均未见特异性扩增条带,2 10份猪组织样品中未检出阳性样品。RT nestedPCR检测的最低限度为10PFU病毒。从样品核酸的提取到PCR扩增及检测结果的报告可在8小时内完成。结论　本研究建立的RT NestedPCR方法具有快速、特异、敏感、可靠的特点,可用于人用猪源性生物制品中外源性JEV的污染检测。     

PCR技术在弓形虫检测上的应用

弓形虫是重要的人兽共患寄生虫,该虫能寄生于包括人在内的100多种脊椎类动物的有核细胞内,引起疾病和死亡。在人类,它的危害包括孕妇感染弓形虫后胚胎的先天性危害和后天性危害,可能造成胚胎的死亡、畸形和流产。免疫力正常的成年人感染弓形虫后,虫体多处于隐性状态,少数人可引     

登革病毒与登革热的起源研究

登革病毒为黄病毒科黄病毒属的成员,有4种抗原性相差较大的血清型（1-4型）,在血清型内存在较大的基因变异,按系统发生称之为“基因型”。基因组为单股正链RNA,长约11kb。     

互联网上销售的HIV抗体快速检测试剂物理性能和灵敏度调查

目的了解互联网上销售艾滋病病毒(HIV)抗体快速检测试剂的现状,评价试剂的物理性能和分析灵敏度,分析用于自我检测时可能存在的问题。方法通过比较互联网上购买HIV抗体快速检测试剂的包装、预期用途、样本类型等,评价其物理性能;通过检测最低检出限样本,评价其分析灵敏度。结果 32种互联网上销售的HIV抗体快速检测试剂包装中9种有图片式说明材料(9/32),31种有样本采集装置(31/32)。说明书中2种的预期用途为无偿献血现场初筛(2/32),5种为自愿咨询检测(5/32),1种为消费者自检(1/32);25种结果解释中没有后续处理方法(25/32);13种互联网销售的HIV抗体血液快速检测剂没有指尖血采集步骤(13/18),1种只能检测血清和血浆(1/18)。29种互联网上销售HIV抗体快速检测试剂检测最低检出限样本均为反应性结果(29/29)。结论专业实验室使用的试剂用于自我检测时存在的问题:HIV血液抗体快速检测试剂没有配备采血针、没有指尖血采集步骤;没有图片式说明材料;结果解释中没有介绍后续处理方法等。     

免疫荧光技术检测室内感染蚊虫体内登革病毒的研究

目的　探讨检测媒介蚊虫体内登革病毒的方法。　方法　以埃及伊蚊和白纹伊蚊两种有效媒介为研究对象 ,在人工经口感染大剂量登革 2型病毒 (DEN- 2 )的基础上 ,通过蚊细胞培养病毒分离和蚊头部压片免疫荧光技术进行病毒抗原检测。　结果　埃及伊蚊感染 DEN- 2病毒 1d后 ,接种 C6 / 36细胞 ,盲传一代后第 5 d出现空斑现象 ,确证细胞发病。白纹伊蚊经口感染登革病毒后 ,取吸血雌蚊每日进行头部压片免疫荧光检测 ,结果显示 ,从蚊虫感染后第 1d～第 2 0d内均能检测到病毒抗原。　结论　用免疫荧光技术 ,可直接检测出感染蚊体内是否携带登革病毒 ,是较为简便、省时、敏感的方法     

多重PCR快速检测鉴别牛布鲁氏菌和牛分枝杆菌的研究与应用

目的利用多重PCR方法建立一种同时快速检测鉴别牛布鲁氏菌和牛分枝杆菌的方法。方法根据牛布鲁氏菌具有种特异性的BCSP-31K基因和牛分枝杆菌23SrRNA，设计并合成了两对分别扩增牛布鲁氏菌和牛分枝杆菌的特异性引物，建立了多重PCR同时快速检测鉴别以上两种病原体的方法。其扩增片段大小牛布鲁氏菌为311bp、牛分枝杆菌为838bp。对所建立的多重PCR方法进行特异性试验和敏感性试验。并应用所建立的方法对临床样品进行检测。结果该多重PCR方法对所有供试的牛布鲁氏菌都能扩增出311bp，结核分枝杆菌都能扩增出838bp目的片段，对其它参试牛的菌株则无311bp和838bp条带，该多重PCR方法对牛布鲁氏菌和牛分枝杆菌的DNA最低检出量为10pg。305份临床样品中10份牛奶样品为牛布鲁氏菌阳性，41份包括36份PPD阳性鼻粘液样品、3份PPD可疑鼻粘液样品和2份PPD阳性牛奶样品为牛分枝杆菌阳性，其余样品均为阴性。     

鼠疫菌快速检测和疾病快速诊断的研究进展

鼠疫是由鼠疫耶尔氏菌引起的一种致死性和传播性均很强的细菌性疾病，可引起啮齿动物（如大鼠、小鼠、野生动物）间的传染病，自然情况下，人间鼠疫流行是由寄生于感染鼠疫的啮齿动物的蚤类通过叮咬而将鼠疫菌传染给人，使人发生腺鼠疫。世界上有70多个国家每年都有发生鼠疫局部暴发流行的报道。尽管鼠疫发现已经有一个多世纪了，临床疑似患者的实验室诊断仍然存在不少困难，尤其是适合基层快速筛查的方法不多。不能对该病进行早期诊断治疗，是贫困及边远地区人群传播和死于该病的主要原因。     

免疫荧光技术检测室内感染蚊虫体内登革病毒的研究

目的 探讨检测媒介蚊虫体内登革病毒的方法。方法 以埃及伊蚊和白纹伊蚊两种有效媒介为研究对象，在人工经口感染大剂量登革2型病毒（DEN-2）的基础上，通过蚊细胞培养病毒分离和蚊头部压片免疫荧光技术进行病毒抗原检测。结果 埃及伊蚊感染DEN-2病毒1d后，接种C6/36细胞，盲传一代后第5d出现空斑现象，确证细胞发病，白纹伊蚊经口感染登革病毒后，取吸血雌蚊每日进行头部压片免疫荧光检测，结果显示，从蚊虫感染后第1d-第20d内均能检测到病毒抗原。结论 用免疫荧光技术，可直接检测出感染蚊体内是否携带登革病毒，是较为简便，省时，敏感的方法。