Visfatin通过线粒体途径抑制胰岛β细胞凋亡

目的 探讨内脏脂肪素(visfatin)对棕榈酸诱导胰岛β细胞凋亡的影响.方法 小鼠胰岛β细胞株MIN6体外传代培养,进入对数生长期后进行实验.MTT法检测不同浓度visfatin(0～10-7 mol/L)作用24～72 h后MIN6细胞活力变化.流式细胞术检测0.5 mmol/L棕榈酸和(或)10-8 mol/L visfatin处理24 h后MIN6细胞凋亡率的变化;Western blotting检测MIN6抗凋亡蛋白bcl-2、bax、激活型caspase-3和胞质细胞色素C表达的变化.结果 Visfatin作用24～48 h,MIN6细胞活力呈剂量依赖性增加(P<0.05).流式细胞仪检测发现,10-8 mol/L visfatin处理24 h可明显降低棕榈酸诱导的细胞凋亡率(P<0.05);Western blotting结果 表明,10-8 mol/L visfatin可显著抑制棕榈酸引起的细胞内源性bcl-2表达的下调及激活型caspase-3和胞质细胞色素C表达的上调(P<0.05).结论 Visfatin可促进胰岛β细胞增殖,并通过细胞内线粒体途径抑制由棕榈酸诱导的胰岛β细胞凋亡.     

地塞米松对小鼠MIN6细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨地塞米松对小鼠胰岛β细胞株MIN6细胞增殖和凋亡的影响.方法实验分对照组和不同浓度地塞米松(50,100,200,400,800 nmol/L)组诱导刺激MIN6细胞1～4 d,MTT法观察地塞米松作用后细胞的存活率;hochest/PI染色荧光显微镜观测细胞凋亡率.结果地塞米松作用1～4 d可明显抑制MIN6细胞的生长;>100 nmol/L组的地塞米松处理48 h后,细胞凋亡明显,凋亡率高达(30.44±4.52)%,与对照组比较差别有统计学意义(P<0.01),800 nmol/L组地塞米松使细胞由凋亡转向坏死.结论地塞米松对小鼠MIN6细胞增殖有明显影响,并能够引起MIN6细胞凋亡.     

血脂康对氧化型胆固醇致胰岛细胞损害的保护作用研究

目的探讨血脂康对氧化型胆固醇（Ch-Ox）中25-羟胆固醇（25-OH）、3β,5α,6β-三羟胆固醇（3-Triol）导致体外培养胰岛素细胞活性损害的保护及抗凋亡作用,并观察其量效关系。方法体外培养小鼠胰岛素细胞株MIN6细胞,待细胞生长融合后,加入50μmol／L浓度的Ch-Ox（3-Triol与25-OH）和不同浓度的血脂康,共同孵育24h。采用MTT法检测细胞的存活情况,并用TUNEL法检测胰岛细胞凋亡率。结果Ch-Ox可降低MIN6胰岛细胞活性,增加MIN6胰岛细胞凋亡率;加入血脂康液后,对Ch-Ox导致的MIN6胰岛细胞活性降低起保护作用,且呈剂量依赖性,有明显统计学差异;另外,血脂康液剂量依赖性减少MIN6胰岛细胞凋亡率。结论血脂康对Ch-Ox导致体外培养胰岛素细胞活性的损害具有保护作用及抗凋亡作用,并存在剂量依赖效应。     

胰高血糖素样肽-1抑制软脂酸诱导的MIN6细胞凋亡

目的 探讨胰高血糖素样肽-1(GLP-1)对软脂酸(PA)诱导的MIN6细胞凋亡及分泌胰岛素功能的影响.方法 传代培养处于对数生长期的胰岛β细胞MIN6细胞株分为三组.PA组:加入0.5 mmol/L PA孵育36 h;GLP-1+PA组:加入10 nmol/LGLP-1,12 h后再加入0.5 mmol/L PA继续孵育36 h,期间每12 h加1次相同浓度的GLP-1;对照组:未加GLP-1或PA,其他培养条件相同.MTT比色法检测细胞活力;Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡百分率;放射免疫分析法测定MIN6细胞胰岛素分泌量.结果 PA组MIN6细胞凋亡率为(39.41±10.16)%,细胞活力较对照组减少25.8%(P＜0.05);GLP-1+PA组MIN6细胞凋亡率为(32.80±8.06)%,细胞活力较PA组增强13.88%(P＜0.05),其高糖和低糖状态下胰岛素分泌均明显高于PA组(P＜0.01).结论 GLP-1可以抑制PA诱导的MIN6细胞凋亡,同时改善细胞胰岛素分泌功能.     

胰高血糖素样肽-1抑制软脂酸诱导的MIN6细胞凋亡

目的探讨胰高血糖素样肽-1(GLP-1)对软脂酸(PA)诱导的MIN6细胞凋亡及分泌胰岛素功能的影响。方法传代培养处于对数生长期的胰岛β细胞MIN6细胞株分为三组。PA组:加入0.5 mmol/L PA孵育36 h;GLP-1 PA组:加入10 nmol/LGLP-1,12 h后再加入0.5 mmol/L PA继续孵育36 h,期间每12 h加1次相同浓度的GLP-1;对照组:未加GLP-1或PA,其他培养条件相同。MTT比色法检测细胞活力;Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡百分率;放射免疫分析法测定MIN6细胞胰岛素分泌量。结果PA组MIN6细胞凋亡率为(39.41±10.16)%,细胞活力较对照组减少25.8%(P<0.05);GLP-1 PA组MIN6细胞凋亡率为(32.80±8.06)%,细胞活力较PA组增强13.88%(P<0.05),其高糖和低糖状态下胰岛素分泌均明显高于PA组(P<0.05)。结论GLP-1可以抑制PA诱导的MIN6细胞凋亡,同时改善细胞胰岛素分泌功能。     

Exendin-4对抵抗素介导的βTC6细胞PDX-1表达损害及细胞凋亡的干预作用

目的 研究Exendin-4是否能拮抗抵抗素对胰岛βTC6细胞的毒性作用。 方法 βTC6细胞分为对照组、抵抗素(200 ng/mL)干预组和Exendin-4干预组(浓度5、10、50 nmol/L+抵抗素200 ng/mL),分别干预6、12、24 h。CCK-8法测定细胞增殖能力,DNA Ladder检测细胞凋亡,RT-PCR检测PDX-1基因表达,放射免疫法测定胰岛素分泌。 结果(1)与抵抗素干预组比较,Exendin-4低浓度(5 nmol/L)和短时间(6 h)未改善βTC6细胞的胰岛素分泌能力和增殖能力(P>0.05),且未减轻细胞凋亡; 适宜浓度(10～50 nmol/L)及干预时间的延长(12、24 h)均明显改善βTC6细胞的胰岛素分泌能力和增殖能力(P<0.05),10 nmol/L和50 nmol/L浓度组间差别无统计学意义(P>0.05),延长至24 h时2种浓度组均可明显减少细胞凋亡;(2)Exendin-4预干预6 h,各组βTC6细胞的PDX-1表达未见明显改变; 当干预时间延长,各浓度组的PDX-1表达逐渐增加,10 nmol/L和50 nmol/L浓度组间差别无统计学意义(P>0.05)。 结论 在一定干预时间和浓度范围内,Exendin-4可增加抵抗素作用下βTC6细胞PDX-1 mRNA的表达,增加胰岛素分泌和增殖能力,减轻细胞凋亡。     

氧化型胆固醇对胰岛细胞活性的损害及诱导凋亡作用

目的 探讨氧化型胆固醇(Ch-Ox)中25-羟胆固醇(25-OH)、3β,5α,6β一三羟胆固醇(3-Triol)对体外培养胰岛素细胞活性的损害及诱导凋亡作用,并观察其时效与量效关系.方法 体外培养小鼠胰岛素细胞株MIN6细胞,待细胞生长融合后,分别加入不同浓度的Ch-Ox(3-Triol与25-OH)作用2Ah,或用同一浓度的两种不同Ch-Ox作用不同时间.采用MTT法检测细胞的存活情况,并用TUNEL法检测胰岛细胞的凋亡率.结果 Ch-Ox可降低MIN6胰岛细胞活性.并呈时间和剂量依赖性,3-Triol对MIN6胰岛细胞活性影响较25-OH明显;Ch-Ox剂量依赖性影响MIN6胰岛细胞凋亡率,3-Triol诱导凋亡作用较25-OH明显.结论 Ch-Ox可剂量依赖性和时间依赖性地降低胰岛素细胞的活性,并剂量依赖性诱导MIN6胰岛细胞凋亡率,提示血液中Ch-Ox浓度升高在胰岛β细胞功能损害中具有一定的作用.     

虫草菌丝对IL-1β诱导MIN6细胞凋亡的保护作用与机制的实验研究

目的:观察虫草菌丝(cordyceps sinensis,CS)对IL-1β诱导的小鼠胰岛β细胞瘤MIN6细胞凋亡的影响以及与活性氧和UCP-2的关系,探讨其对胰岛细胞的保护作用及机制。方法:实验分为正常对照组,IL-1β组,IL-1β+CS低浓度组,IL-1β+CS高浓度组。CCK8检测细胞活性,Elisa方法检测MIN6细胞基础胰岛素和葡萄糖刺激的胰岛素分泌量,Hochest染色以及流式细胞术检测细胞凋亡,化学荧光法检测细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)活性,Western Blot检测胰岛细胞解偶联蛋白2(uncoupling protein 2,UCP-2)的表达。结果:与正常对照组相比,IL-1β组细胞活性降低,基础和葡萄糖刺激胰岛素分泌量显著减少,细胞凋亡明显增加,同时测得ROS活性增加,UCP-2的表达降低;给予低浓度和高浓度CS作用后,与IL-1β组相比,细胞活性明显提高,基础和葡萄糖刺激胰岛素分泌量增加,细胞凋亡率显著减少,ROS活性降低,同时UCP-2的表达增加。结论:CS可显著提高细胞活性和胰岛素分泌功能,降低IL-1β诱导的MIN6细胞凋亡,其机制可能与增加胰岛细胞UCP-2表达,降低ROS活性有关。     

GLP-1受体激动剂Exendin4对胰岛β细胞胰岛素和IAPP分泌模式的影响

目的：探讨GLP-1受体激动剂（GLP-1RA）Exendin4作用下胰岛β细胞的胰岛素及胰淀粉样多肽（IAPP）的分泌模式。方法：观察小鼠胰岛瘤细胞系MIN6细胞在不同浓度Exendin4作用不同时间后的细胞形态的变化;利用MTT实验检测MIN6细胞在不同干预后的细胞活性的变化;采用葡萄糖刺激胰岛素分泌实验,检测MIN6细胞在不同干预后培养液上清中的胰岛素和IAPP分泌量的变化;采用荧光定量PCR（RT-PCR）检测各组MIN6细胞的胰岛素和IAPP mRNA表达水平的变化。结果：与正常对照组比较,Exendin4组的细胞数量增加,贴壁牢固,形态正常;细胞活性随Exendin4作用浓度以及作用时间的增加而显著增加,具有一定的浓度及时间依赖性;胰岛素和IAPP的分泌水平随Exendin4作用浓度以及作用时间的增加而显著增加,具有一定的浓度及时间依赖性,而IAPP/胰岛素的比值随作用浓度以及作用时间的增加而减小;胰岛素和IAPP mRNA水平均随Exendin4作用浓度以及作用时间的增加而上调,具有一定的浓度及时间依赖性,IAPP/胰岛素mRNA比值随作用浓度以及作用时间的增加而减小。结论：Exendin4作用于MIN6细胞可增加细胞数量和细胞活性,改善细胞状态,保护胰岛细胞功能;并且可引起胰岛素以及IAPP分泌水平增加,胰岛素和IAPP mRNA表达水平增加,而IAPP/胰岛素比值下降。     

第三丁基过氧化氢诱导MIN6细胞损伤

目的 通过第三丁基过氧化氢(t-BHP)诱导小鼠胰腺β细胞,模拟体外氧化应激的细胞模型,观察氧化损伤对β细胞生长的影响.方法 体外培养小鼠β细胞株MIN6,MTT法测定细胞存活率,AO-EB荧光显微镜观测,Annexin-Ⅴ-PI染色流式细胞技术定量定性分析细胞凋亡率及坏死率. 结果 MTT显示,t-BHP(12.5～200 μmol/L)作用不同时间后可明显抑制MIN6细胞的生长,并呈现一定的时效和量效关系;AO-EB荧光显微镜及Annexin-Ⅴ-PI流式细胞检测证实,25μmol/L浓度的t-BHP诱导β细胞的损伤作用以凋亡为主,而更高浓度的t-BHP使细胞由凋亡转向坏死.结论 t-BHP可用于体外模拟β细胞氧化应激损伤的模型.     

Visfatin通过线粒体途径抑制胰岛β细胞凋亡

目的 探讨内脏脂肪素（visfatin）对棕榈酸诱导胰岛β细胞凋亡的影响。 方法 小鼠胰岛β细胞株MIN6体外传代培养,进入对数生长期后进行实验。MTT法检测不同浓度visfatin（0~10-7 mol/L）作用24~72 h后MIN6细胞活力变化。流式细胞术检测0.5 mmol/L棕榈酸和(或)10-8 mol/L visfatin处理24 h后MIN6细胞凋亡率的变化;Western blotting检测MIN6抗凋亡蛋白bcl-2、bax、激活型caspase-3和胞质细胞色素C表达的变化。 结果 Visfatin作用24~48 h,MIN6细胞活力呈剂量依赖性增加（P<0.05）。流式细胞仪检测发现,10-8 mol/L visfatin处理24 h可明显降低棕榈酸诱导的细胞凋亡率（P<0.05）;Western blotting结果表明,10-8 mol/L visfatin可显著抑制棕榈酸引起的细胞内源性bcl-2表达的下调及激活型caspase-3和胞质细胞色素C表达的上调（P<0.05）。 结论 Visfatin可促进胰岛β细胞增殖,并通过细胞内线粒体途径抑制由棕榈酸诱导的胰岛β细胞凋亡。     

转化生长因子-β1诱导小鼠足细胞凋亡实验研究

目的探讨转化生长因子-β1（TGF-β1）是否能诱导小鼠足细胞株凋亡以及诱导凋亡的途径。方法（1）体外培养小鼠足细胞株;（2）应用不同浓度（10^-1～104ng／L）TGF-β1诱导小鼠足细胞凋亡;（3）10^3ng／LTGF-β1诱导不同时间（12、24、48h）后观察足细胞凋亡情况;（4）采用流式细胞仪检测AnnexinV、Caspase3;（5）实时定量PCR及Western印迹法检测p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）、Smad2、Smad3、Smad7mRNA及蛋白质的表达情况。结果（1）小鼠足细胞在不同浓度（10^-1～10^4ng／L）TGF-β1刺激下,细胞凋亡率明显高于正常对照组（均P〈0.05）;（2）随着TGF-β1浓度增加、凋亡时间增加,足细胞凋亡率增高（P〈0．05）;p38MAPK、Smad2、Smad3、Smad7mRNA表达增加;TGF-β1 103ng／L为最佳诱导小鼠足细胞凋亡浓度,24h为最佳诱导凋亡时间;（3）与正常对照组比较,10^3ng／LTGF-β1诱导后Caspase3阳性细胞比率显著增加（P〈001）．p38MAPK、Smad2、Smad3、Smad7蛋白质表达亦显著增加（P〈0．01）。结论TGF-β1能诱导小鼠足细胞凋亡,呈浓度及时间依赖性。TGF-β1通过Smad通路、p38MAPK通路以及线粒体通路诱导小鼠足细胞凋亡。     

Exendin-4减轻衣霉素诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡

目的探讨Exendin-4对衣霉素诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡的影响。方法原代培养HUVECs,不同浓度衣霉素(0～20μg/mL)处理HUVECs 16～24h,或用衣霉素(10μg/mL)干预18h后加用不同浓度Exendin-4(5～150nmol/L)预处理24h,MTT比色法检测细胞存活率,Hoechst/PI双染色荧光显微镜观察细胞凋亡率。结果随着衣霉素作用浓度的增加和时间的延长,HUVECs的存活率逐渐下降,呈现一定的量效和时效关系;Hoechst/PI双染色荧光显微镜观察也证实衣霉素能够诱导HUVECs凋亡;加用不同浓度Exendin-4预处理,内皮细胞存活率较单独衣霉素处理组逐渐升高;Hoechst/PI双染色荧光显微镜观察结果显示,100nmol/L的Exendin-4预处理HUVECs后,细胞凋亡率较衣霉素单独处理组减少40%(P<0.01)。结论衣霉素能诱导HUVECs凋亡,而Exendin-4可减少衣霉素诱导的HUVECs凋亡。     

红景天苷对胰岛β细胞保护作用研究及机制探讨

目的?考察红景天苷的降糖功效及其对胰岛β细胞的保护作用。方法?采用C57BL/6小鼠一次性注射链脲佐菌素（STZ）150mg/kg建立小鼠糖尿病模型,红景天苷剂量为100mg/kg,每日1次灌胃给药,每5日检测小鼠空腹血糖, 30d后检测小鼠胰岛素水平并进行口服糖耐量实验（OGTT）。同时分离正常小鼠胰岛培养3d后,通过Ki67免疫荧光染色及TUNEL染色方法考察红景天苷（50μmol/L）对胰岛β细胞增殖与凋亡的作用。通过RT-PCR方法检测β细胞增殖相关基因insulin、Pdx-1、GLP-1R、IL-1β转录水平变化。结果?与STZ组相比较,红景天苷组（STZ/Sal）能够有效降低小鼠空腹血糖,并表现出胰岛素水平增加的趋势,其OGTT实验也得到显著改善。而小鼠胰岛染色实验表明,红景天苷可以明显促进β细胞增殖,减少高糖诱导的β细胞凋亡。并且红景天苷促进insulin、Pdx-1、GLP-1R 等基因的mRNA水平升高,降低炎症因子IL-1β的mRNA水平。结论?本研究证实红景天苷有效保护胰岛β细胞,促进β细胞增殖并抑制其凋亡,从而实现降低血糖的作用。      

胰岛β细胞株INS-1和MIN6有关糖毒性的比较研究

目的 探讨INS-1和MIN6细胞株在有关糖毒性研究的不同表型.方法 胰岛素瘤细胞株INS-1和MIN-6分别在含5和25mM糖浓度的无血浆培养基中孵育24 h.MTT法测定细胞活性,细胞凋亡通过annexinV-PI双染,流式细胞仪检测分析.结果 INS-1细胞在高糖条件下细胞活性明显降低,细胞凋亡率、死亡率明显增加,而MIN6细胞在高糖环境下细胞活性增加,凋亡率下降,死亡率无明显变化.结论 MIN6细胞比INS-1细胞能耐受更高的糖毒性.     

iNOS激活在过氧化氢诱导胰岛β细胞凋亡中的作用

目的 研究过氧化氢诱导的胰岛β细胞株(RINm5F细胞株)凋亡中iNOS的活性变化趋势.方法 过氧化氢诱导胰岛β细胞凋亡,采用MTT(细胞活性检测)、SRB(活细胞蛋白染色)鉴定细胞凋亡,对凋亡细胞iNOS的活性测定来反应iNOS的激活程度.结果 过氧化氢在0.1mmol/L, 1h能明显诱导胰岛β细胞的凋亡,其细胞活性和活细胞染色均较对照组明显下降,过氧化氢诱导后iNOS活性提高约42%.结论 iNOS的激活可能是过氧化氢诱导的胰岛β细胞凋亡的机制之一.     

人GLP-1(7-36)酰胺对非肥胖型糖尿病小鼠胰岛β细胞凋亡的影响

目的探讨人胰高糖素样肽1(GLP-1)对非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠胰岛β细胞凋亡的影响。方法 GLP-1治疗组小鼠用微型渗透泵皮下持续泵入人GLP-1,对照组小鼠泵入生理盐水,4周后将其胰腺组织做HE染色、TUNEL/胰岛素双重免疫荧光染色,显微镜下观察小鼠胰岛炎的变化及胰岛β细胞的凋亡情况。结果与对照组相比,GLP-1治疗组小鼠胰岛单核细胞浸润明显减轻,胰岛炎评分明显下降(P<0.001)。在对照组小鼠胰腺组织切片中观察到较多凋亡β细胞,而在GLP-1治疗组却很少见到。GLP-1治疗组小鼠胰岛β细胞凋亡率与对照组小鼠相比明显下降(0.07±0.01%vs0.26±0.02%,P<0.001)。结论人GLP-1持续刺激NOD小鼠后,可使1型糖尿病小鼠胰岛炎减轻并抑制β细胞凋亡。     

Exendin-4改善氧化应激减轻t-BHP诱导的HUVECs凋亡

目的 探讨Exendin-4对第三丁基过氧化氢(t-BHP)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡的影响.方法 在原代培养的HUVECs中,采用t-BHP(100 μmol/L)干预4 h,加用或不加用Exendin-4(100 nmol/L)预处理细胞24 h,分为:对照组(A组)、t-BHP处理组(B组)、Exendin-4处理组(C组)及Exendin-4+t-BHP组(D组).应用MTT比色法检测细胞存活率,DAPI染色荧光显微镜观察细胞凋亡率,活性氧(ROS)检测试剂盒检测ROS的产生.结果 与A组比较,100 μmol/L t-BHP作用4 h,B组的HUVECs存活率下降40%(P<0.001);DAPI染色荧光显微镜观察证实,t-BHP可以诱导HUVECs凋亡;加用Exendin-4预处理细胞24 h,D组的HUVECs存活率较B组增高(P<0.01).DAPI染色荧光显微镜观察细胞凋亡率提示,与B组比较,Exendin-4预处理可使D组的细胞凋亡率减少44%(P<0.05),并减少ROS的产生(P<0.05).结论 t-BHP能够诱导HUVECs凋亡,Exendin-4可减少t-BHP诱导的HUVECs凋亡.     

RIG-I上调抑制胰腺β细胞增殖机制研究

目的:探讨维甲酸诱导基因I(retinoic acid inducible gene-I,RIG-I)在小鼠胰岛β细胞株NIT-1生长中的作用及其相关分子机制?方法:应用不同浓度(1?5?10?20?50和100 μmol/L)的RIG-I特异性激动剂维甲酸(retinoic acid,RA)分别刺激NIT-1细胞6?12?24 h,上调RIG-I?MTT法检测细胞生长活力;real-time PCR测定RIG-I的 mRNA水平;免疫印迹法检测RIG-I和细胞周期蛋白P27蛋白水平;EdU和流式细胞术检测β细胞的增殖和分裂周期?结果:维甲酸处理能刺激NIT-1细胞RIG-I蛋白水平增加(P < 0.05),能剂量依赖地抑制NIT-1细胞生长活力(P < 0.05),且诱导NIT-1细胞G1期阻滞和周期抑制蛋白P27蛋白水平增加(P < 0.05)?结论:RIG-I的功能增强能诱导小鼠胰岛β细胞P27蛋白水平上调,一定条件下抑制β细胞增殖和诱导细胞周期G1期阻滞,从而导致机体胰岛β细胞整体功能的失代偿,可能是2 型糖尿病发生发展的重要诱因?