大鼠脂肪源性干细胞的分离培养及鉴定

背景：脂肪源性干细胞在体外易于培养,增殖快,具有多向分化潜能。 目的：构建一种体外分离培养SD大鼠脂肪源性干细胞的方法,并对其部分生物学特性与表型进行分析。 方法：切取SD大鼠腹股沟脂肪垫,应用胶原酶Ⅰ消化,分离大鼠脂肪源性干细胞,进行体外培养、传代,倒置显微镜观察细胞的生长增殖及形态变化,诱导成骨、成脂,分别行碱性磷酸酶、茜素红、von Kossa染色及油红O染色,绘制生长曲线及用流式细胞仪检测细胞表面标记。 结果与结论：体外培养的脂肪源性干细胞呈梭形,增殖活跃,传代后形态均一,多次传代后细胞仍保持较强增殖能力,生长曲线呈“S”型。成骨诱导实验组碱性磷酸酶、茜素红、von Kossa染色阳性;成脂诱导实验组油红O染色阳性;对照组均为阴性。细胞CD29,CD44,CD105表达阳性,CD31,CD45表达阴性。提示SD大鼠腹股沟脂肪垫分离的脂肪源性干细胞在体外易于分离培养和传代扩增,特定条件下可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞,并表达间充质干细胞相关的表型。     

人脂肪源干细胞分离培养及向成骨细胞的诱导分化

背景：脂肪源干细胞可分泌众多的免疫调节因子,不引起T细胞的细胞毒作用,并可通过调整T淋巴细胞的种类和数量。 目的：探讨人脂肪源干细胞在体外分离培养扩增的方法及向成骨细胞诱导分化的能力。 方法：以0.1%的Ⅰ型胶原酶通过组织消化的方法分离人脂肪组织中的干细胞,体外扩增培养至第2代后检测其表面抗原的表达,并在成骨诱导液中促进其向成骨细胞的分化,通过碱性磷酸酶染色、茜素红染色及对碱性磷酸酶的RT-PCR检测来明确其分化能力。 结果与结论：体外分离培养的脂肪源干细胞生长稳定,扩增速度快。流式细胞仪检测结果显示其高表达干细胞相关抗原。向成骨细胞诱导后经免疫组化染色可见矿化结节形成,RT-PCR检测发现碱性磷酸酶表达阳性。提示脂肪源干细胞在体外分离培养方法简单,扩增速度快,并具有定向分化的能力,是可靠的组织修复和细胞治疗的种子细胞来源。     

猪脂肪干细胞与脱细胞真皮基质的生物相容性

背景：脱细胞真皮基质已广泛应用于器官或组织缺损的修补。 目的：观察猪脂肪源性干细胞与脱细胞真皮基质的相容性。 方法：酶消化法原代培养猪脂肪源性干细胞,利用流式细胞仪和多向诱导分化方法鉴定脂肪干细胞,将其与脱细胞真皮基质共培养。 结果与结论：实验成功培养出猪脂肪源性干细胞,流式细胞仪检测结果显示阳性表达CD44和CD105,不表达CD34和CD45;在诱导培养基条件下,可向脂肪细胞、成骨细胞分化。苏木精-伊红染色及扫描电镜发现干细胞能在脱细胞真皮基质表面黏附生长。脂肪源性干细胞与脱细胞真皮基质具有良好的相容性,将两者体外复合培养后,有望将复合物植入体内进行缺损组织、器官的修复。     

永生化人骨髓基质细胞的表面抗原及多向分化研究

目的研究本所转入人端粒酶逆转录酶基因的人骨髓基质细胞（hMSC—TERT细胞）的生物学特性。方法复苏hMSC—TERT细胞第30代，扩增，流式细胞仪检测细胞表面抗原；进行体外脂肪细胞、成骨细胞定向诱导，并分别进行油红O染色、碱性磷酸酶染色及von Kossa染色。结果hMSC—TERT细胞表面抗原检测CD34、CD5、CD44、CD106、CD166均为阴性；脂肪细胞定向诱导后油红O染色见胞浆内有红色脂肪颗粒，成骨细胞定向诱导后见胞浆内有碱性磷酸酶染色阳性黑褐色颗粒，von Kossa染色见有钙结节形成。结论hMSC—TERT细胞依然保留骨髓基质干细胞的自我更新特性及多向分化潜能。     

流动优化骨髓间充质干细胞的分化状况

背景：间充质干细胞在成体动物骨髓中含量极低。 目的：观察成年大鼠骨髓间充质干细胞经生理范围流动切应力作用后,其体外生长规律、增殖及定向分化为成骨细胞及脂肪细胞的能力。 方法：在体外取得SD大鼠骨髓原代间充质干细胞,利用平板流室系统加载1 Pa切应力,对其进行培养及扩增,并分别向成骨细胞及脂肪细胞定向诱导。 结果与结论：原代间充质干细胞为长梭形或多角形,集落样生长;经流动加载并传代后细胞生长速度加快,不以集落方式生长,而是均匀分布。细胞体积明显增大,多数为长梭形或多角形;生长曲线显示各代细胞有类似的生长规律;激光共聚焦显微镜显示CD44和CD90阳性,CD31及CD45阴性;向成骨细胞及脂肪细胞诱导14 d后,Von Kossa染色及油红O染色均为阳性,流动优化后骨髓间充质干细胞保持了体外大量增殖及多向分化潜能。     

脐血间充质干细胞分离扩增及向成骨与脂肪细胞的分化

背景：和骨髓间充质干细胞相比，脐血间充质干细胞取材方便，其免疫原性较低，能耐受更大程度上的HLA配型不符，分离出的间充质干细胞纯度更高。 目的：分析新生儿脐血间充质干细胞体外分离、纯化、扩增，以及向成骨及脂肪细胞定向诱导分化的方法与条件。 设计、时间及地点：观察性实验，于2004-09/2005-11在四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室，干细胞与组织工程研究室完成。 材料：胎龄37~40周的新生儿脐血。 方法：以Ficoll-HyPaque 淋巴细胞分离液密度梯度法、沉降红细胞后密度梯度法及CD34+免疫磁珠负选法分离脐血单个核细胞。将分离获得的单个核细胞采用L-DMEM培养基+体积分数0.1胎牛血清或MesencultTM培养基+体积分数0.1胎牛血清进行间充质干细胞培养传代，获得的第3代集落生长细胞进行流式细胞仪表面抗原测定，并诱导其向成骨、脂肪细胞分化。 主要观察指标：①脐血间充质干细胞的鉴定。②经茜素红染色及油红染色证实其诱导分化。 结果：经沉降红细胞后密度梯度离心分离的单个核细胞，使用MesencultTM培养基+体积分数0.1胎牛血清培养成功率高，第3代可出现明显的集落生长，而另两种方法分离培养的细胞则难以形成集落；集落细胞表面抗原测定表达CD29，CD59，D71，不表达CD34，CD45及HLA-DR等分子。成骨定向诱导分化的集落细胞经茜素红染色胞浆中出现有大量的钙沉积，成脂肪定向诱导分化的集落细胞油红染色示胞浆充满油滴空泡。 结论：使用MesencultTM培养基+体积分数0.1胎牛血清培养由甲基纤维素沉降脐血红细胞后密度梯度离心分离的单个核细胞培养成功率高，第3代可出现明显的集落生长。经诱导后可分化为成骨细胞和脂肪细胞。     

脐血间充质干细胞生物学特性及其成骨成脂分化潜能

背景：对于脐血来源间充质干细胞的研究是干细胞研究领域的重点和热点,但目前国内外研究对其报道尚较少,许多方面存在争议。 目的：观察人脐血间充质干细胞的生物学特性,并探讨其向成骨、成脂肪细胞诱导分化的能力。 方法：从不同胎龄脐血中分离培养间充质干细胞;通过倒置相差显微镜及透射电镜观察细胞的形态、生长增殖情况及其超微结构;并描绘细胞生长曲线;用流式细胞仪对细胞表面标志物进行检测。分别用成骨及成脂诱导液对脐血间充质干细胞进行诱导,通过茜素红染色检测脐血间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的能力;通过油红O染色检测其向脂肪细胞诱导分化的能力。 结果与结论：倒置相差显微镜下观察脐血间充质干细胞贴壁生长,呈成纤维细胞样外观,细胞呈螺旋状排列;透射电镜观察脐血间充质干细胞细胞核大,胞核比例大,细胞器少,为低分化细胞;原代及传代培养的脐血间充质干细胞生长曲线均呈S型,第3,5代细胞增殖能力最强。流式细胞仪检测结果显示,脐血间充质干细胞均稳定表达与间充质干细胞相关的表面抗原标志物CD29,CD44和CD90等,不表达造血标志CD34和CD45。脐血间充质干细胞成骨诱导后3周时茜素红染色可检测到大量钙化基质的形成;成脂诱导3周时油红O染色可检测到胞质中脂滴的形成。提示脐血间充质干细胞的形态特征、生长增殖特点及细胞表面标志物等生物学特性与骨髓间充质干细胞相似,具有强大的生长增殖与自我更新能力。脐血间充质干细胞在体外诱导条件下可以向成骨细胞及脂肪细胞等间质组织细胞定向分化。     

c/000脐带组织间充质干细胞分离及生物学特性

背景：脐带组织依赖于母体免疫系统的保护,且胚胎自身免疫系统相对不发育、MHC表达低下,故来源于脐带的间充质干细胞的生物学特性已成为目前研究热点。 目的：拟在体外分离培养人脐带组织间充质干细胞,并观察其多向分化能力。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2006-10/2007-05在四川大学组织工程重建实验室完成。 材料：脐带来源于胎龄37~40周的健康新生儿,由四川大学华西第二医院产房提供。 方法：取脐带沿血管长轴切开,去掉血管,再将脐带重新缝合形成环状,灌入胶原酶悬液,6~8 h后灌洗离心,获取细胞后贴壁法分离培养、扩增,细胞呈集落生长后传代。取传至第5代细胞,分别加入成骨、成脂诱导分化培养基。 主要观察指标：脐带间充质干细胞的形态、生长状况、表面抗原分子的表达、多向分化潜能。 结果：去除血管后获取脐带组织细胞的方法可获得贴壁生长的细胞,呈短棒状或梭形样细胞,易扩增和形成集落;高表达基质细胞抗原CD29,CD51,CD71,而不表达CD34,CD45及HLA-DR等造血干细胞抗原分子;成骨诱导后茜素红染色胞浆中有大量的钙沉积,碱性磷酸酶钙钴法染色胞质呈灰黑色,阳性细胞率>85%;成脂诱导后油红O染色示胞浆充满油滴空泡。 结论：脐带组织存在具有分化能力的间充质干细胞,并可在体外进行培养扩增形成集落细胞传代,传代细胞表达基质细胞表面抗原,能够向成骨细胞、成脂肪细胞方向分化。     

大鼠附睾脂肪垫脂肪源性干细胞的分离培养及分化潜能

背景：相对于骨髓基质干细胞,脂肪源性干细胞来源丰富,取材方便,干细胞丰度高,极易培养,具有多向分化潜能,有望成为组织工程、细胞治疗以及基因转染良好的源细胞,但目前对脂肪源性干细胞的研究尚处于初级阶段。 目的：拟在体外分离培养大鼠脂肪源性干细胞,并探讨其分化潜能。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-06/2009-01在南方医科大学组胚教研室和南方医院临床医学实验中心完成。 材料：SPF级成年雄性SD大鼠1只,由南方医科大学实验动物中心提供。 方法：无菌条件下切取大鼠双侧附睾尾脂肪垫,胶原酶消化法分离培养脂肪源性干细胞,胰蛋白酶消化法传代扩增。取第4代脂肪源性干细胞接种到96孔板,5×104个细胞/皿,待细胞贴壁后分成3组：成骨诱导组加入成骨培养基,成脂诱导组加入成脂培养基,对照组仍用基础培养基,培养14 d。 主要观察指标：脂肪源性干细胞的形态变化、体外增殖能力、细胞免疫化学鉴定结果。脂肪源性干细胞成骨和成脂分化能力。 结果：体外培养的脂肪源性干细胞易扩增,传代后以长梭形细胞为主,呈旋涡状排列,克隆样生长;经多次传代仍能保持较强的增殖能力,细胞生长曲线呈“S”形;细胞表面标志CD44和CD49d呈阳性表达,CD106呈阴性表达。脂肪源性干细胞经成骨诱导7 d后,碱性磷酸酶染色呈阳性;成脂诱导3 d后,油红O染色示胞浆内有脂滴出现;对照组细胞碱性磷酸酶染色呈阴性,无脂滴存在。 结论：从大鼠附睾脂肪垫内分离的脂肪源性干细胞易于培养和传代扩增,在特殊条件下可分化为成骨细胞和脂肪细胞。     

成人骨髓间充质干细胞培养条件优化及多向分化的能力

背景：成人骨髓中间充质干细胞数量少,要使其能够更好地应用于组织工程和细胞治疗,就必须建立成熟、简便、有效的分离培养扩增体系。 目的：建立成人骨髓间充质干细胞最佳培养方法,并观察诱导其向成脂肪、成骨及软骨细胞分化结果。 方法：分别采用密度梯度离心法和全骨髓培养法,分离培养成人骨髓间充质干细胞,通过光镜观察细胞形态,绘制生长曲线比较不同培养方法对骨髓间充质干细胞的影响;免疫荧光法鉴定表面抗原CD34、CD44和CD105的表达。不同诱导培养基诱导成人骨髓间充质干细胞,采用油红O、茜素红染色以及阿利新蓝染色检测成脂、成骨和成软骨诱导情况。 结果与结论：全骨髓培获得的骨髓间充质干细胞,其增殖能力和生长特性明显优于密度梯度离心法;细胞表面抗原CD44、CD105强阳性,CD34阴性;经过诱导培养,油红O、茜素红染色以及阿利新蓝染色均为阳性,证明全骨髓培养法获得细胞具有更强的生长增殖能力,并具有向脂肪,骨和软骨等组织多向分化的潜能。     

不同供者来源及不同传代次数人脂肪间充质干细胞端粒酶的活性检测

背景：目前对于脂肪间充质干细胞端粒酶的表达尚无统一定论。 目的：探讨不同供者来源和不同传代次数的成人脂肪间充质干细胞是否表达端粒酶活性。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2009-08在中国医学科学院血液学研究所泰达生命科学技术研究中心完成。 材料：成人脂肪组织来源于天津怡丽医学美容整形门诊接受抽脂术的5例健康供者,Hela细胞由中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心提供。 方法：分别从每例健康供者抽取20 mL脂肪组织,胶原酶消化法体外分离培养人脂肪间充质干细胞,待细胞生长至80%融合时胰酶消化传代。以Hela细胞作为对照,加入含体积分数为10%胎牛血清的1640培养基,待细胞生长至80%融合时胰酶消化传代。 主要观察指标：人脂肪间充质干细胞的形态、表型、分化潜能,RT-PCR法检测人脂肪间充质干细胞端粒酶基因的表达,TRAP-ELISA法检测人脂肪间充质干细胞的端粒酶活性。 结果：实验分离得到的人脂肪间充质干细胞呈贴壁生长,显微镜下呈梭形,当细胞密度较大时表现出漩涡状生长;CD19,CD34,CD11b,CD45,HLA-DR呈阴性表达,CD73,CD90,CD105呈阳性表达;成脂诱导后油红O染色可见明显红色油滴,成骨诱导后Von Kossa染色可见黑色颗粒,提示有钙沉积。P1,P4,P7代人脂肪间充质干细胞均不表达端粒酶反转录酶基因,5例不同供者来源的脂肪间充质干细胞亦均不表达端粒酶反转录酶基因。Hela细胞具有端粒酶活性,人脂肪间充质干细胞不表达端粒酶活性。 结论：不同供者来源和不同传代次数的人脂肪间充质干细胞均不表达端粒酶mRNA,也无端粒酶活性。     

人脂肪组织源性干细胞分化为神经元样细胞的能力及可塑性*☆

目的：脂肪组织源性干细胞分化为神经元样细胞并表达神经元信号已有报道。实验拟观察人脂肪组织源性干细胞定向诱导分化为神经元样细胞的可能性。 方法：实验于2003-09/2005-06在沈阳脑科医院试验中心完成。腹部脂肪由沈阳市第一医院普外科提供，患者对实验知情同意，并经医院伦理委员会批准。提取人脂肪组织分离、原代培养、扩增脂肪组织源性干细胞，以免疫荧光化学染色方法鉴定细胞CD44,CD114,CD34的表达。取第二、三代细胞以PBS缓冲液冲洗后，用含有丁酸酯羟基茴香醚、KCL、丙戊酸、地塞米松、胰岛素的培养液诱导向神经细胞分化，采用免疫荧光化学染色方法鉴定神经元特异性烯醇化酶。 结果：原代培养的脂肪组织源性干细胞为梭形散在细胞，培养至7 d左右细胞接近融合。荧光倒置显微镜下观察经免疫荧光染色，96.7%细胞呈CD44阳性， CD114抗体、CD34抗体呈阴性。神经元特异性烯醇化酶免疫荧光鉴定可见诱导后细胞出现类似轴突和树突样结构，有类神经元间网络形成，表达神经元特异性标志物神经元特异性烯醇化酶。 结论：人脂肪组织源性干细胞可在体外扩增，在一定培养条件下，有分化为神经元样细胞的能力。     

富血小板血浆促进脂肪间充质干细胞的体内外成骨****☆

背景：添加富血小板血浆可促进细胞体外成骨表型的快速转化,从而有效成骨。 目的：观察富血小板血浆对脂肪间充质干细胞体内和体外成骨能力的影响。 方法：第3代兔脂肪间充质干细胞进行成骨诱导培养,分为对照组和富血小板血浆组。细胞接种到钙磷陶瓷支架上后,体内外观察细胞/载体复合物的成骨情况。 结果与结论：两组细胞随着诱导时间的延长碱性磷酸酶活性增高,达到高峰值后随后逐渐下降,诱导后14 d时,富血小板血浆组即达到高峰值,对照组18 d达到高峰值。细胞/载体复合体切片Von Kossa染色显示两组载体的孔隙内衬面呈多层黑染状,有大量钙盐沉积。甲苯胺蓝染色显示载体的孔隙中可见成熟的骨质存在,周边区域较中心多。体外钙盐沉积对照组多,体内成骨面积富血小板血浆组多(P < 0.05)。说明,富血小板血浆可有效诱导脂肪间充质干细胞体内和体外成骨。     

人脂肪间充质干细胞的分离培养及其鉴定**

背景：人脂肪间充质干细胞在不同的条件下被成功诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞、肝脏细胞等中胚层细胞,同时也可以向其他胚层分化,证明脂肪间充质干细胞是多分化潜能干细胞。 目的：探讨人脂肪间充质干细胞的分离、鉴定方法。 方法：整形外科吸脂术获得腹部皮下脂肪,0.075%Ⅰ型胶原酶消化,贴壁培养获得人脂肪间充质干细胞,绘制细胞增殖曲线,进行流式细胞、细胞周期、免疫荧光等检测,并验证其是否具有多功能分化潜能。 结果与结论：获得形态较均一的长梭形的人脂肪间充质干细胞,细胞增殖良好,有明显的指数生长期,体外能长期培养存活,并保持不分化状态;流式检测细胞高表达CD105、CD90,低表达CD34、CD45;多数细胞周期检测G0/G1期占80%以上。能向成脂、成骨诱导分化。结果表明,实验分离获得的细胞是具有脂肪间充质干细胞特性的细胞,为深入研究人脂肪间充质干细胞打下基础。     

CM-Dil体外标记人脐带间充质干细胞传代示踪的可行性

背景：掌握人脐带间充质干细胞的移植示踪方法是研究其生物学特性的关键。 目的：观察用CM-Dil标记人脐带间充质干细胞及在体外传代示踪的可行性。 方法：采用酶消化法体外分离培养人脐带间充质干细胞,通过流式细胞仪检测细胞免疫表型和细胞周期、体外成脂成骨诱导鉴定该细胞。将第5代细胞用CM-Dil标记,并将细胞传代,荧光显微镜观察体外标记情况。 结果与结论：第3代人脐带间充质干细胞强表达CD44,CD29,低表达CD106,不表达CD34、CD40;有80%以上的细胞处在G0/G1期,成脂成骨诱导后,油红O染色和碱性磷酸酶染色分别阳性。CM-Dil标记人脐带间充质干细胞细胞标记率达90%以上,体外传代后荧光强度逐渐减退,传8代后,荧光基本消失。说明人脐带间充质干细胞增殖、分化能力强,CM-Dil标记细胞示踪方法简单易行。     

人脐带间充质干细胞分离培养及向脂肪与成骨细胞的分化**△○

背景：研究报道显示人脐带间充质干细胞体外分离方法及效率、培养条件各不相同,并且尚未有统一的鉴定标准。因此建立高效、经济的培养体系十分必要。 目的：本研究旨在建立从人脐带组织分离培养间充质干细胞的方法,并进行向脂肪细胞和成骨细胞的诱导分化。 方法：首先采用组织块贴壁法或酶消化法分离纯化得到脐带间充质干细胞(Umbilical cord mesenchymal stem cells,UCMSCs),分析其细胞形态、增殖方式和某些免疫表型,并在体外诱导其向脂肪细胞和成骨细胞分化。 结果和结论:结果发现,hUCMSCs在适当的诱导条件下能向脂肪和成骨细胞分化,体外能连续传代40次以上,且形态和表型保持稳定。这证实了人脐带组织存在间充质干细胞,且具有向脂肪和成骨细胞分化的潜能,该细胞可用于后续的应用研究。     

脐带间充质干细胞向成骨细胞分化的潜能

背景：人脐带间充质干细胞含量丰富,较为原始,分化能力强,免疫原性低,是细胞治疗的理想靶细胞。 目的：体外分离培养脐带间充质干细胞并将其定向诱导为成骨细胞。 方法：无菌条件下培养脐带间充质干细胞,分为诱导组和对照组,诱导组用成骨诱导液处理、对照组为干细胞培养液处理。倒置光显微镜观察细胞形态,MTT法测细胞增殖,荧光双染法检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞周期与细胞表面标记。诱导后：检测碱性磷酸酶,Von Kossa染色分析钙盐沉积,RT-PCR检测骨桥蛋白基因、碱性磷酸酶、骨唾液蛋白mRNA的表达。 结果与结论：传代细胞形态稳定、活力好,高标达CD44。诱导后von Kossa染色表现为阳性。碱性磷酸酶活性诱导组比对照组高(P < 0.05),不同时间点比较21 d最高(P < 0.05)。RT-PCR显示：诱导组21,28d 碱性磷酸酶mRNA表达均较与对照组增强(P < 0.05)。诱导组有骨唾液蛋白和骨桥蛋白基因mRNA表达。提示,人脐带间充质干细胞能够定向分化为成骨细胞。