缺氧诱导因子-1α信号通路在髁突软骨生长和改建中的作用机制

髁突软骨在正常机体内处于一个低氧环境中,软骨细胞却对此表现出较好地适应能力,然而在体外细胞的研究中发现,髁突软骨细胞在传代培养中很难保持稳定性,这为髁突软骨的研究带来了较大困难。同时也考虑培养髁突软骨细胞时是否应尽可能模拟体内低氧环境。缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）是细胞对低氧环境适应性反应的重要转录因子,对维持软骨细胞的稳态和功能具有重要意义。本文就HIF-1α的生物活性结构、相关信号通路及在髁突软骨修复中的作用作一综述。     

低氧诱导因子-2α在不同应力加载髁突软骨细胞中的表达及意义

目的研究低氧诱导因子-2α(HIF-2α)及其下游分解代谢因子(MMP3,MMP13,ADAMTs-4)在不同应力加载髁突软骨细胞中的表达变化情况。方法对培养到第3代的新生SD大鼠髁突软骨细胞采用5%的低氧培养箱培养。0.5 Hz下分别加载0,1 000,2 000,4 000单位压力,2 h后立即收集样本,台盼蓝染色,光镜下观察细胞形态并计数细胞数,计算死细胞率。采用westernblot及RT-PCR技术检测HIF-2α及其下游分解代谢因子(MMP3,MMP13,ADAMTs-4)的蛋白及基因表达。结果随着压力的增加,髁突软骨细胞死亡率显著上升(P<0.05)。HIF-2α及其下游分解代谢因子(MMP3,MMP13,ADAMTs-4)的表达相应增加(P<0.05)。结论超负荷压力激活HIF-2α,继而激活下游分解代谢因子可能是导致髁突软骨损伤的一个机制。     

血管内皮生长因子及其受体在大鼠下颌骨髁突软骨细胞中的表达和意义

目的：研究VEGF及其受体(Fh—1和Flk—1)在大鼠下颌骨髁突软骨细胞中的表达，探讨其对大鼠下颌骨髁突软骨生长发育的影响。方法：用免疫组化方法，对VEGF及其受体(Fh—1和Flk—1)在大鼠下颌骨髁突软骨细胞中的表达进行检测。结果：大鼠下颌骨髁突软骨的增殖层、肥大层、矿化和钙化层均有表达，而纤维层没有表达。结论：大鼠下颌骨髁突软骨的增殖层、肥大层及矿化和钙化层软骨细胞可产生并分泌VEGF及其受体(Fh—1和Flk—1)，VEGF可能在大鼠下颌骨髁突软骨生长发育中发挥作用。     

乏氧对人牙周膜细胞HIF-1α及VEGF表达的影响

目的:检测人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,hPDLCs)在乏氧环境下乏氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)和血管内皮生长因子(vascular endothelia1 growth factor,VEGF)的表达情况.方法:组织块法培养人牙周膜细胞,第3代细胞用于实验,分2组分别在20%O2,5%CO2,75%N2(对照组)和1%O2,5%CO2、94%N2(乏氧组)的37℃培养箱中培养24h和48h.采用RT-PCR技术和免疫组化技术检测HIF-1α和VEGF的表达情况.应用SPSS13.0软件包进行t检验、单因素方差分析及LSD检验.结果:乏氧组HIF-1αmRNA的表达与对照组相比,差别无统计学意义.乏氧24h与48h VEGF mRNA的表达显著高于对照组(P＜0.05).免疫细胞化学细胞爬片结果显示,乏氧组HIF-1α染色阳性,大量HIF-1α蛋白在胞核积聚,且表达量随乏氧时间增加而增加,而常氧组未观察到HIF-1α的表达;VEGF的表达呈时间依赖性增加,乏氧组VEGF的表达明显强于对照组.常氧48h后,VEGF呈微弱阳性表达.结论:乏氧可以改变人牙周膜细胞的代谢途径,上调HIF-1α及相关因子的表达.     

低氧对大鼠颏舌肌成肌细胞分化的影响

目的:通过观测低氧环境对体外培养大鼠颏舌肌成肌细胞分化及低氧诱导因子1α(HIF-1α)表达的影响,探讨低氧引起颏舌肌损伤的机制以及HIF-1α在其中的作用。方法:根据环境氧浓度不同,将体外培养的原代大鼠颏舌肌成肌细胞分为正常氧浓度组(NC)(21%)和低氧组(HG)(1%),分别诱导分化0 d、1 d、3 d、6 d。采用RT-PCR及Western blotting检测生肌调节因子(MyoD)、肌源性决定因子(myogenin)、肌球蛋白重链(MHC)以及HIF-1α的mRNA及蛋白表达;倒置显微镜下观察成肌细胞分化的形态变化。结果:在颏舌肌成肌细胞分化过程中,两种氧状态下HIF-1αmRNA表达均没有显著变化(P>0.05),但蛋白表达逐渐上调;低氧对MyoD、myogenin、MHC的mRNA(P<0.05)和蛋白表达有显著的抑制作用,致肌管形成延迟;低氧使HIF-1αmRNA(P<0.05)和蛋白显著上调。结论:低氧环境可能是通过上调HIF-1α表达抑制大鼠颏舌肌成肌细胞的分化,从而抑制颏舌肌损伤的修复。     

rhIL-1α/rhTGF-β1诱导下大鼠髁突软骨细胞PRG4的表达

目的:观察rhTGF-β1对rhIL-1α作用下大鼠髁突软骨细胞蛋白多糖4(PRG4)表达的影响.方法:酶消化法获取髁突软骨细胞,甲苯胺蓝染色鉴定.细胞上清液中加入10 ng/ml的rhIL-1α,48 h后加入10 ng/ml的rhTGF-β1.不同时间点应用RT-PCR检测PRG4 mRNA的表达情况,ELISA法检测PRG4蛋白的分泌变化.结果:加入rhIL-1α 24、48、72 h组的PRG4表达量与对照组均有统计学差异(P<0.05),且逐渐降低.48 h组再加入rh TGF-β1 24h后PRG4表达量与对照组无统计学差异(P>0.05),而48 h后与各组均有统计学差异(P<0.05),且最高.结论:rhTGF-β1可以上调髁突软骨细胞PRG4的表达,且可逆转IL-1α的下调作用.     

低氧诱导下舌鳞癌SCC-6细胞中HIF-1α、VEGF的表达及TSA对其表达的抑制

目的:观察低氧与人舌鳞状细胞癌SCC-6细胞中HIF-1α、VEGF表达的相关性,曲古抑菌素A(TSA)对其表达的抑制作用,初步探讨其作用机制。方法:体外培养的舌鳞状细胞癌SCC-6细胞,经不同作用时间去铁胺处理,模拟低氧条件培养后,RT-PCR检测HIF-1α、VEGF的mRNA表达,Western Blot检测其蛋白表达;模拟低氧条件下,不同浓度、时间梯度TSA处理SCC-6细胞后,分别检测HIF-1α、VEGF的mRNA及蛋白表达。结果:①低氧下SCC-6细胞HIF-1α蛋白表达增加,但其mRNA的表达不受影响;作为HIF-1α下游基因的VEGF的mRNA和蛋白表达,随HIF-1α蛋白表达增加而增加;②低氧下,TSA可抑制HIF-1α的蛋白表达及VEGF的mRNA和蛋白表达,并呈量效和时效关系,但HIF-1α的mRNA表达不受影响;③HIF-1α的调节在蛋白水平。结论:体外条件下,模拟低氧可诱导舌鳞状细胞癌SCC-6细胞中HIF-1α蛋白、其下游基因VEGF的mRNA和蛋白的表达增加。TSA可抑制HIF-1α的蛋白表达,进而抑制其下游基因VEGF的表达,从而发挥抗肿瘤血管生成的作用,并且呈量效和时效关系。     

IGF-1信号通路相关蛋白在大鼠髁突软骨细胞增殖分化中的表达

目的:研究胰岛素样生长因子-1(IGF-1)信号转导通路在大鼠髁突软骨细胞增殖分化调控过程中相关基因的表达。方法:体外单层培养并鉴定出生后1、7、14、28 d共4组SD大鼠髁突软骨细胞。免疫组织化学方法检测细胞内IGF-1表达情况,Real-time PCR及Western印迹法检测细胞内IGF-1R、Bcl-2、Bax mRNA及蛋白表达。饥饿培养24 h后,实验组加入质量浓度为100 ng/mL的重组大鼠IGF-1细胞因子(rrIGF-1)继续培养24、48 h,CCK-8检测细胞增殖情况,Real-time PCR技术检测各组髁突软骨细胞内IGF-1R、IGF-2R、Raf1、GSK-3、IGFBP3、NF-κB、Bcl-2、Bax、integrin、TGF-βmRNA表达情况;对照组培养液不加rrIGF-1。结果:各鼠龄组SD大鼠髁突软骨细胞内IGF-1表达均阳性,IGF-1R mRNA及蛋白表达相对平稳,Bcl-2、Bax mRNA及蛋白表达逐渐增强,在出生14 d后表达下降(P<0.05)。加入100 ng/mL rrIGF-1后,髁突软骨细胞增殖速度显著增加,细胞凋亡减少,Real-time PCR结果显示实验组IGF-1R、GSK-3、Bax、integrin mRNA表达整体呈下降趋势;IGF-2R、Raf1、IGFBP3、NF-κB、Bcl-2、TGF-βmRNA表达水平总体呈上调趋势,差异有统计学意义。结论 :IGF-1介导的信号转导途径参与了髁突软骨细胞的增殖、分化以及软骨形成早期的调控,并可能与integrin、TGF-β等其他蛋白相互作用,共同参与髁突发育过程。     

缺氧条件下缺氧诱导因子-1α对人舌鳞癌细胞血管内皮生长因子表达的影响

目的探讨缺氧条件下缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）对人舌鳞癌细胞株Tca8113细胞血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表达的影响。方法采用RT—PCR技术半定量检测人Tca8113细胞常氧和缺氧培养0．5、1、3、6、12和24h HIF-1α、VEGF基因的表达。结果缺氧条件下HIF—1α基因的表达呈先升后降的趋势，在缺氧6、12h表达显著高于常氧组（P〈0．05）；VEGF的表达在缺氧培养0．5、1、3、12及24h均高于常氧组（P〈0．05）；VEGF基因的表达在缺氧初始阶段随HIF—1α基因表达的增强而升高，但Spearman相关分析显示两者在缺氧24h内相关性不明显（rs=0．5750，P〉0．05）。结论缺氧条件下Tca8113细胞中VEGF的高表达受HIF—1α的调控和影响，是多种因素作用的结果。     

下颌前伸对大鼠髁突软骨VEGF表达影响的研究

目的：探讨引导大鼠下颌前伸后,髁突软骨中血管内皮细胞生长因子（VEGF）表达水平的变化。方法：50只35d龄雌性SD大鼠随机分为5组,每组随机分为实验组（5只）和对照组（5只）;实验组大鼠24h佩戴自制功能性矫治器引导下颌前伸;实验后3d、7d、14d、21d和30d分别处死各组大鼠;免疫组化方法检测髁突软骨中VEGF的表达。结果：对照组髁突软骨VEGF表达随时间延长而减弱,后部区域VEGF表达强于前部和中部：实验后第14d,21d和30d实验组VEGF表达强于相应对照组（P〈0．05）,其中14d时软骨后部VEGF表达较对照组增强幅度最大。结论：下颌前伸后大鼠髁突软骨细胞VEGF表达增强,说明其参与了软骨内骨化过程。     

低氧调控大鼠骨髓间充质干细胞OPG/RANKL mRNA的表达

目的:探讨低氧处理对大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone marrow derived mesenchymal stem cells,rBMSCs)骨保护素(osteoprotegerin,OPG)和核因子κb受体活化因子配体(receptor activator of NF-κb ligand,RANKL)mRNA表达的影响.方法:采用全骨髓细胞贴壁法分离、培养rBMSCs,应用化学低氧剂氯化钴(CoCl2)建立低氧模型,分别以0、50、100、200、400μmol/L浓度的CoCl2孵育细胞,首先采用MTT法检测CoCl2对细胞增殖的影响;利用实时荧光定量PCR及Western免疫印迹检测低氧诱导因子1 α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)的表达情况.rBMSCs经低氧处理0、12、24、48、72、96 h,实时荧光定量PCR检测OPG、RANKL mRNA的表达.采用SPSS18.0软件包对数据进行统计学分析.结果:与对照组相比,200、400 μmol/L的CoGl2抑制rBMSCs增殖(P＜0.05),而50、100 μmol/L CoCl2实验组的增殖并未产生显著影响(P＞0.05).在50、100 μmol/L CoCl2实验组,rBMSCs表达HIF-1α的mRNA和蛋白水平均高于对照组,100 μmol/L CoCl2组较50 μmol/L CoCl2组高.100 μmol/L CoCl2孵育12h时,低氧组和对照组rBMSCs的OPG、RANKL mRNA的表达无变化(P＞0.05);24、48、72、96 h时,与常氧组相比,低氧组OPG mRNA表达水平升高,RANKL mRNA表达水平下降,OPG/RANKL的比值显著升高(P＜0.05).结论:100 μmol/L CoCl2低氧处理可通过调控rBMSCs OPG、RANKL mRNA的表达,从而促进成骨分化.     

间断性低氧环境下成骨细胞低氧诱导因子-1α表达变化的观察

目的观察间断性低氧环境下成骨细胞低氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor,HIF-1α）表达变化,试探讨睡眠呼吸暂停低通气综合征患者骨代谢特点。方法将SD大鼠（Sprague-Dawley rat,SD rat）成骨细胞分为3组进行培养：①常氧组：常氧条件（21％O2,5％CO2）培养25h提取总RNA;②持续性低氧组：低氧条件（2％O2,5％CO2）下培养,分别在第3h、25h提取总RNA;③间断性低氧组：交替在低氧条件（2％O2,5％CO2）和常氧条件（21％O2,5％CO2）培养,每隔1h交替,第1h为低氧培养,分别在第1h、3h、5h、9h、13h、25h提取总RNA。反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测以上样本HIF-1α的表达。结果在持续性低氧条件下,HIF-1α表达随时间增加而增加。间断性低氧下,成骨细胞在各观察点均有HIF-1α表达,但第1h、5h表达明显低于第3h、9h、13h、25h。结论与常氧培养相比,间断性低氧可引起成骨细胞HIF-1α表达增高,可能会对睡眠呼吸暂停低通气综合征患者骨代谢产生影响。     

间歇性完全鼻阻塞诱导幼年大鼠颏舌肌低氧诱导因子1α的表达

目的: 研究幼鼠在双侧间歇性鼻阻塞时低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor, HIF-1α)的表达变化, 探讨双侧鼻阻塞对生长发育期大鼠颏舌肌的影响。方法: 将30只4周龄SD大鼠(Sprague-Dawley rat, SD rat)分为3组。A组为双侧鼻阻塞组, 常氧条件下鼻孔双侧阻塞4 h(8:00 am-12:00 am), 分别阻塞21 d和55 d;B组为单侧鼻阻塞组, 常氧条件下鼻孔单侧阻塞4 h/d(8:00 am-12:00 am), 分别阻塞21 d和55 d;C组为对照组, 常氧条件下饲养。取出颏舌肌, 分别进行H-E染色和免疫组织化学染色, 检测颏舌肌中HIF-1α的表达, 采用SPSS13.0软件包对数据进行统计学分析。结果: 在双侧鼻阻塞组, 颏舌肌HIF-1α的表达随鼻阻塞时间的延长而增加, 单侧鼻阻塞组以及对照组中颏舌肌均无HIF-1α表达。结论: 在双侧鼻阻塞的未成年大鼠中, 颏舌肌表达HIF-1α, 并且随着鼻阻塞时间的延长, HIF-1α的表达不断增加。     

TNF-α刺激髁突软骨细胞产生白细胞介素-34的研究

目的通过观察TNF-α对髁突软骨细胞分泌白细胞介素-34(IL-34)及表达IL-34 mRNA基因的影响,探讨IL-34在颞下颌关节紊乱病中的致病机制。方法取第三代髁突软骨细胞,培养过程于培养液中加入不同浓度(0、1、10、20、50 ng/m L)的TNF-α培养24 h以及同一浓度(10 ng/m L)TNF-α分别培养1、3、6、10、24 h后,收集培养上清液及细胞,分别用ELISA和RT-PCR方法测定IL-34浓度以及IL-34 mRNA的表达情况。结果 1实验组和对照组髁突软骨细胞上清液中均能检测到IL-34。2TNF-α刺激髁突软骨细胞IL-34mRNA基因表达,并呈正相关关系。结论 TNF-α能刺激髁突软骨细胞产生IL-34。     

缺氧对口腔扁平苔藓角质形成细胞增殖及缺氧诱导因子1α、血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶9表达的影响

目的 探讨缺氧对人口腔扁平苔藓(oral lichen planus,OLP)角质形成细胞增殖及缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1 α)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)表达的影响,以期为OLP发病机制的研究提供新思路.方法 体外分离培养OLP角质形成细胞;使用密闭培养箱模拟缺氧环境,分为常氧组和缺氧组,两组细胞分别培养12、24、36及48 h,采用细胞计数试剂盒8的方法监测缺氧各时点细胞增殖状况,并确定进一步实验干预时间点,每组实验均重复3次;SYBR Green Ⅰ荧光染料实时定量PCR法和蛋白质印迹法分别检测各组细胞HIF-1α、VEGF、MMP-9 mRNA和蛋白表达水平,并采用相关性分析研究VEGF、MMP-9与HIF-1α的相关性.结果 24、36、48 h缺氧组OLP角质形成细胞增殖力(A值)(分别为0.340±0.002、0.415±0.006、0.546±0.006)均显著低于同时间点常氧组(分别为0.431 ±0.001、0.620±0.004、1.022±0.005),P＜0.01; 24、36、48 h缺氧组VEGF(2.087±0.291、3.189±0.573、5.402±0.563)及MMP-9(2.936±0.500、4.083±0.300、6.374±0.858)的mRNA表达量均显著高于常氧组(P＜0.05),HIF-1α (0.414±0.093、0.751±0.056、0.875±0.040)、VEGF (0.393±0.046、0.557±0.078、0.767±0.045)及MMP-9 (0.250±0.053、0.384±0.038、0.611 ±0.092)的蛋白表达量均显著高于常氧组(P＜0.05).HIF-1α与VEGF(r =0.905,P=0.000)及MMP-9(r =0.881,P=0.000)的蛋白表达水平均呈显著正相关.结论 缺氧在一定时间内可抑制OLP角质形成细胞增殖,上调细胞中HIF-1α蛋白、VEGF及MMP-9 mRNA和蛋白的表达;缺氧环境下HIF-1α可能通过调控下游靶基因参与OLP的病情进展.     

牵张力作用下人牙髓细胞HIF-1α和VEGF的表达

目的:研究牵张力作用下人牙髓细胞HIF-1α和VEGF基因的表达变化,探讨 HIF-1α和VEGF与正畸牙髓组织维持内环境稳定的关系.方法:通过细胞牵张应力加载系统,对细胞施加频率为1.0 Hz、大小为15％形变率的牵张应力,分别加力6h、12h、24h、48 h和72 h实时定量PCR检测不同时间点HIF-1α和VEGF mRNA的表达变化采用SPSS 12.0软件包对数据进行统计学分析 结果:未加力前,HIF-1 αmRNA表达极其微弱;加力6 h时,表达开始升高(P＜0.05);持续增加至24 h时,表达最显著(P＜0.05);加力48 h时,表达缓慢下降(P＜0.01);至加力72 h时,表达下降至未加力前(P＞ 0.05).未加力前,VEGFmRNA表达微弱,加力6h表达开始升高,但无显著差异(P＞0.05);加力12 h 时,VEGF mRNA表达开始明显增强(P＜0.05),持续增加至72 h加力结束时(P＜0.05).结论:牵张力可诱导人牙髓细胞HIF-1α和VEGF mRNA的表达变化,两者可能在维持正畸受力后牙髓内环境稳定中发挥重要作用.     

功能矫治后大鼠下颌髁突软骨中骨钙素基因表达的规律

目的　探讨生长发育期大鼠下颌髁突软骨中有无骨钙素mRNA的表达及其昼夜变化的规律。方法　采用SD大鼠 ,应用原位杂交技术检测大鼠下颌髁突软骨中骨钙素mRNA的表达 ,以图像分析半定量研究骨钙素mRNA表达的昼夜变化规律。应用宏观、微观分析法进行统计分析。结果髁突软骨内有骨钙素mRNA的表达 ,峰值相位约在上午 6时左右。戴用功能矫治器后骨钙素mRNA表达增强 ,其中 2 4h组升高幅度较 12h组明显。结论　生长发育期大鼠下颌髁突软骨中骨钙素mRNA的表达呈现昼夜节律性。功能矫治后髁突软骨中骨钙素mRNA含量增加 ,2 4h加力组增高的幅度均高于 12h组 ,说明戴用功能矫治器时间越长 ,效果越明显     

低氧对人牙周膜细胞骨向分化能力的影响

目的 研究低氧对人牙周膜细胞（PDLC）的碱性磷酸酶（ALP）活性及成骨相关基因表达的影响.方法 采用组织块法体外分离培养人PDLC;取第3 ～ 5 代细胞分别在常氧和低氧条件下培养后检测其ALP 活性;并通过荧光定量聚合酶链反应（PCR）观察低氧处理后人PDLC 中成骨相关基因的表达变化.结果 低氧12、24、36、48 h 组ALP 活性均比常氧组高;其中低氧48 h 组与常氧组相比明显升高,差异有统计学意义（P ＜ 0.05）;低氧48 h 组ALP mRNA 表达比常氧组高,差异具有统计学意义（P ＜ 0.05）;4 个时间点低氧组骨钙蛋白（OCN）mRNA 表达均比常氧组高,且差异有统计学意义（12、36 h：P ＜ 0.05;24、48 h：P ＜ 0.01）.结论 低氧增强人PDLC 的ALP 活性,上调ALP mRNA 和OCN mRNA 的表达,促进人PDLC 向成骨细胞分化,同时促进成骨细胞的矿化,提示低氧环境对人PDLC 的骨向分化功能产生一定的影响.     

电磁脉冲暴露对大鼠下颌髁突软骨细胞程序性坏死的生物学效应研究

目的:研究不同强度电磁脉冲(electromagnetic pulse,EMP)照射对下颌髁突软骨的生物学效应及软骨细胞程序性坏死(necroptosis)在其中的作用,为今后电磁辐射的应用及治疗提供新思路.方法:SD大鼠随机分为对照组(Sham组)、辐照组(EMP1组和EMP2组),于辐照后3、12、24 h处死取材.苏木精-伊红(HE)、番红O-固绿、Ⅱ型胶原染色评价软骨退变程度;免疫及Western blot检测髁突软骨中Necroptosis关键分子RIPK3、p-MLKL的表达.结果:与Sham组相比,EMP1组3 h时髁突肥大层大量软骨细胞出现胞核异常深染、增大,12 h、24 h时胞核异常深染现象基本消失;EMP2组细胞形态未见明显改变.与Sham组相比,EMP1组髁突软骨中的Ⅱ型胶原阳性面积百分比显著降低(P<0.05);但EMP2组Ⅱ型胶原阳性面积百分比未见明显差异(P>0.05).EMP1组和EMP2组软骨厚度、蛋白多糖阳性面积百分比与Sham组未见明显差异(P>0.05).与Sham相比,EMP1组髁突软骨中的RIPK3、p-MLKL阳性细胞率及蛋白表达在3 h和24 h显著升高(P<0.01),在12 h与Sham组无明显差异;EMP2组中RIPK3阳性细胞率及蛋白表达显著降低(P<0.01),p-MLKL阳性细胞率及蛋白表达在辐照后3 h显著升高(P<0.05)、12 h无明显差异、24 h显著降低(P<0.05).结论:一定剂量的EMP照射可引起髁突软骨的一过性损伤,Necroptosis参与了EMP照射对髁突软骨的瞬时损伤效应.