铁皮石斛DoMAPK5基因的克隆及表达特征分析

目的克隆及分析铁皮石斛DoMAPK5基因的表达特征。方法利用cDNA末端快速克隆技术(RACE),首次从铁皮石斛接菌共生萌发种子中分离得到1个新的MAPK基因,对其编码蛋白的理化性质、保守结构域等特征及进行了分析。并应用荧光定量PCR对DoMAPK5基因在石斛不同组织中表达模式分析。结果 DoMAPK5基因(Gen Bank注册号KJ472788),全长为2184bp、编码一条597个氨基酸的肽链,预测分子量为67.39KDa,等电点为9.28,编码的蛋白均不含信号肽,在210-232位具有23个氨基酸的跨膜域,具有MAPK蛋白家族保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的结构域及MAPK位点。序列比对及系统发育树分析结果表明DoMAPK5基因与葡萄MAPK基因均具有很高的相似性(82%),与水稻MAPK10亲缘关系最近。应用荧光定量PCR对DoMAPK5基因在石斛不同组织中表达模式分析显示,该基因在未接菌的植物组织中属组成型表达,在接菌共生萌发的植物组织中显著上调,为未萌发种子的10.49倍。结论 DoMAPK5在植物组织中属于组成型表达,具有受菌根真菌诱导表达的特征。     

铁皮石斛赤霉素3-氧化酶基因的克隆及表达分析

目的克隆珍稀濒危药用植物铁皮石斛Dendrobium officinale赤霉素3-氧化酶(gibberellin 3-oxidases,GA3ox)基因(Do GA3ox),并进行生物信息学和表达分析。方法采用RACE和RT-PCR技术获得Do GA3ox基因c DNA全长;利用生物信息学软件预测其编码蛋白的理化性质、结构域及亚细胞定位等分子特性;用DNASTAR 7.0和MEGA 6.0软件分别对其进行氨基酸多序列比对和进化关系分析;借助实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测基因表达模式。结果克隆到Do GA3ox基因(Gen Bank注册号KT597694),c DNA全长1 318 bp,编码一条由353个氨基酸组成的多肽,相对分子质量为39 052.5,等电点6.21;Do GA3ox蛋白不含跨膜域和信号肽,具有GA3ox的保守结构域DIOX_N(40~130)和2OG-Fe II_Oxy(197~299);Do GA3ox与大葱、油棕、海枣、野茶树及蓝猪耳GA3ox蛋白一致性分别为55%、56%、54%、51%、50%,与单子叶植物大葱、油棕和海枣的亲缘关系较近。q RT-PCR实验结果显示Do GA3ox基因在铁皮石斛种子共生(非共生)萌发1~3级时,其相对表达量呈现出先升高后降低再升高的趋势,分别为未萌发种子的13.44(5.21)、7.28(2.32)和9.40(6.21)倍,由此可知,该基因在共生萌发种子中的表达量高于非共生萌发种子。结论首次克隆得到1个Do GA3ox基因的全长c DNA,其转录本在共生和非共生不同萌发级别种子中的表达特性说明该基因在铁皮石斛种子萌发中起着重要调控作用。     

铁皮石斛及金钗石斛菌根真菌的分离及其生物活性测定

目的 :对我国云南、四川等地采集的野生铁皮石斛Dendrobiumcandidum和金钗石斛D .nobile根中的内生真菌进行分离并测定其生物活性。方法 :采用平板分离法分离内生真菌 ;所获得真菌分别与铁皮石斛种子、铁皮石斛及金钗石斛无菌苗共培养测定其生物活性。结果 :分离获得内生真菌 2 5种 ,主要属于担子菌Basidiomy cotina和半知菌Deuteromycotina;生物活性测定结果表明 ,其中 5种真菌可促进铁皮石斛种子萌发 ;7种真菌可与铁皮石斛和金钗石斛幼苗形成共生关系 ,但仅有 3种真菌对幼菌有促生作用。结论 :分离和筛选促进石斛生长发育的适宜菌根真菌 ,是菌根技术应用于石斛生产的关键问题之一。     

冷胁迫下铁皮石斛抗寒相关基因的SCoT差异表达分析

为了探讨铁皮石斛在冷胁迫下相关基因表达差异的分子机制,选用抗寒性较强的铁皮石斛种质,分别构建了冷胁迫处理总RNA混合池,利用反转录cDNA进行SCoT PCR进行差异表达分析.通过64条引物筛选了约500个cDNA片段,获得差异片段11个,并进行割胶回收、克隆、测序和序列分析.结果表明,利用SCoT方法可以筛选出冷胁迫下铁皮石斛的抗寒相关基因,获得的基因片段分别与膜相关蛋白、渗透调节蛋白、CBF转录因子、抗逆性蛋白有很高的同源性,还有1个基因片段功能未知,可能与铁皮石斛的抗寒有关.     

不同真菌对2种药用石斛种子共生萌发的效应

兰科石斛属植物兜唇石斛Dendrobium aphyllum和齿瓣石斛D.devonianum均为传统中药材,有着极高的药用价值。研究利用3种从不同兰科植物中分离得到的内生真菌在不同光照条件下与这2种石斛植物种子在树叶、松树皮和椰糠混合基质上进行共生萌发试验。研究结果表明,胶膜菌属Tulasnella FDaI7菌株及瘤菌根菌属Epulorhiza FDd1菌株分别能有效地促进兜唇石斛和齿瓣石斛种子的萌发及幼苗建成,石斛与真菌存在共生专一性。共生培养60 d,接菌FDaI7的兜唇石斛种子,原球茎或幼苗形成率分别为14.46%,12.07%;接菌FDd1的齿瓣石斛种子,二者形成率分别为44.36%,42.91%。在2种光照条件下,已形成的原球茎均能够进一步发育为幼苗,而持续黑暗条件会导致幼苗白化或畸形。研究结果为2种石斛的野外回归奠定了理论基础,也为这2种药用石斛人工仿生态栽培的种苗扩繁提供了新的方法。     

铁皮石斛蔗糖合成酶基因的克隆及表达分析

目的:克隆铁皮石斛Dendrobium officinale蔗糖合成酶基因并对其表达分析,为研究铁皮石斛多糖合成与蔗糖合成酶活性关系及调控表达提供理论依据.方法:基于GenBank上已知的蔗搪合成酶基因SS同源序列,应用RT-PCR和RACE等方法,克隆铁皮石斛蔗糖合成酶基因全长,将目的片段转化大肠杆菌表达菌株BL21中,IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析.结果:成功克隆了铁皮石斛蔗糖合成酶基因,该基因cDNA全长2 424 bp,编码807个氨基酸(命名为DOSS1),登录号HQ856835,该基因氨基酸序列与兰科植物Moluara yellow(AF530568)同源性达到95%,与Oncidium goldiana(AF530567)同源性达到90%,与禾本科植物的SS基因同源性在80%以上.并对其进行大肠杆菌原核表达诱导,诱导的工程菌能明显表达出一条相对分子质量约为92×10(3)左右的蛋白质,与理论相对分子质量基本相符.结论:成功克隆了铁皮石斛蔗糖合成酶基因,并诱导出一条与理论蛋白相对分子质量相符的蛋白条带.     

铁皮石斛产业化关键科学与技术的突破

针对铁皮石斛繁殖难、种植难、产品单一等产业发展重大问题,通过铁皮石斛基因组学研究,明确铁皮石斛为二倍体、有38条染色体、28 910个蛋白编码基因及在转录组水平上的器官基因表达特异性,具有大量种子而种子没有胚乳、广泛生态适应性、多糖合成的基因调控机制,为铁皮石斛遗传工程育种和活性药用成分的开发利用提供了理论基础;攻克了结实难、发芽难等繁育难题,建立了组培快繁体系,实现种苗工厂化生产,奠定了铁皮石斛人工种植基础;建立了铁皮石斛育种体系,明确了重要经济性状的遗传变异规律,育成铁皮石斛系列专用品种(品系),解决了实生后代分离严重问题,支撑铁皮石斛产业升级;揭示了目标化合物动态变化规律、养分吸收机制,突破了栽培基质、光调控、精准采收等关键技术,建立了设施栽培、活树附生、岩壁附生、立体栽培、盆栽等系列栽培模式,实现种出铁皮石斛、种出好的铁皮石斛。     

铁皮石斛尿苷二磷酸糖基转移酶(UGT)基因家族鉴定与表达分析

尿苷二磷酸糖基转移酶(UGT)是一个在植物中高度保守的蛋白，通常在次生代谢途径中起作用。该文利用隐马可列夫模型(HMM)在铁皮石斛Dendrobium officinale全基因组中进行UGT基因家族成员筛选，共得到44个UGT家族成员。利用生物信息学对铁皮石斛基因的结构、系统进化以及启动子区域原件进行分析，结果表明，UGT基因家族可分为4个亚家族，各亚家族中UGT基因具有相对保守的基因结构，拥有9个保守的结构域。UGT基因上游启动子区含有多种植物激素及环境因子相关的顺式作用元件，表明UGT基因的表达可能会受到植物激素和外界环境因素的诱导，比较铁皮石斛不同组织中UGT基因的表达，发现UGT基因在铁皮石斛各个部位中均有表达，可以推测UGT基因在铁皮石斛多个组织的中发挥着重要作用。通过对铁皮石斛菌根共生低温胁迫、缺磷胁迫的转录组分析，该研究发现仅有一个基因在菌根共生和低温、缺磷胁迫下均上调表达。该研究结果有助于了解兰科植物UGT基因家族的功能，为深入研究铁皮石斛多糖代谢途径的分子调控机制提供理论基础。     

四川野生铁皮石斛株丛时空格局的动态演化

目的：阐释自然环境下野生铁皮石斛株丛时空格局及生活史特征,为铁皮石斛原地保护、回归保育和仿野生栽培提供参考。方法：以四川省石棉县收集的114丛野生株丛为研究材料,比较不同等级株丛生长情况差异,并对可明确辨别丛龄的74个实生小株丛合轴生长及花序柄（或花序柄痕）残留情况进行观察,探讨野生铁皮石斛株丛时空格局及生活史特征。结果：野生铁皮石斛假鳞茎茎节数、茎长、株丛根数、根长和根粗随假鳞茎数量增加而增加,但茎粗无明显变化规律;实生小株丛的第一年茎（种子萌发茎）和第二年茎（分蘖茎）生长缓慢、短小,完成由种子到种子的生活史周期约需4年或更长;高位腋芽较少,高芽繁殖并非该野生铁皮石斛居群的主要繁殖方式,其通过合轴生长的分蘖繁殖扩大株丛并实施有性繁殖,株丛生长到一定阶段开始衰退。结论：四川省石棉县有野生铁皮石斛分布。株丛调查表明,野生铁皮石斛主要通过种子萌发的实生苗及分蘖繁殖实现种群更新。建议利用铁皮石斛果实里种子数量大的优势积极开展原生境播种和回归保育,对川产石斛资源发掘（含文化挖掘）、保护及可持续利用进行了探讨。     

铁皮石斛人工种子制作及影响因素研究

目的建立铁皮石斛人工种子制作方法,并考察相关影响因素,为铁皮石斛的繁育提供一条新途径。方法以铁皮石斛原球茎为包埋体制作人工种子,考察胚乳、种皮组分对人工种子萌发和成苗的影响。结果以MS+0.5 mg/L BA+0.5 mg/L NAA+3 g/L AC+30 g/L海藻酸钠+3 g/L百菌清为基本胚乳,在2%CaCl2中反应15 min是铁皮石斛人工种子制作的较佳条件,胚乳中分别添加15 g/L木薯淀粉和10 g/L保水剂能明显提高人工种子的萌发率和成苗率,种皮中添加10 g/L纳米SiO2和10 g/L纳米TiO2均能明显提高萌发率,但添加10 g/L纳米SiO2成苗率最高。结论建立了铁皮石斛人工种子制作方法,获得了较高的萌发率和成苗率。     

大黄种子质量分级标准研究

目的 为控制大黄种子质量,制定大黄种子质量分级标准.方法 测定优良品种的药用大黄种子发芽率、千粒重、水分、净度等指标,制定分级标准.结果 大黄种子质量等级分为3个等级.结论 此方法制定的质量分级标准,可作为大黄种子的质量控制参考标准.     

铁皮石斛原球茎的诱导与增殖影响因素研究

目的:研究铁皮石斛原球茎诱导与增殖的最适培养基配方。方法:以铁皮石斛种胚为材料,以MS培养基为基本培养基,研究不同植物激素6-苄基腺嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)、2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)和激动素(KT)或其组合及马铃薯提取液(PE)、香蕉提取液(BE)、苹果提取液(AE)和椰乳(CM)等有机添加物对铁皮石斛原球茎诱导和增殖的影响。结果:6-BA与NAA配比不利于种胚萌发,萌发度均低于MS培养基;添加10%的PE、CM有利于原球茎诱导;2,4-D对原球茎的生长和增殖不利,一定浓度的BA、KT和NAA有利于原球茎的增殖;KT浓度为1.0 mg/L时,原球茎40 d增殖倍数最高,达9.0;PE、CM、AE都能不同程度的促进原球茎的增殖,以10%的CM效果最好。结论:适宜铁皮石斛原球茎的诱导培养基为MS+10%CM+1.0 g/L AC;适宜铁皮石斛原球茎增殖的培养基为MS+1.0mg/L KT+0.2mg/L NAA+10%CM。     

野生铁皮石斛rDNA ITS序列分析

目的:测定和分析不同产地野生铁皮石斛样品的rDNA ITS序列,探讨利用ITS序列推测铁皮石斛样品产地来源的可行性。方法:提取总基因组DNA,使用通用引物ITS5F/ITS4R进行PCR扩增,产物经电泳检测、纯化和测序后用Sequin 11.0提交GenBank。用Bioedit 7.0中的Clustal W对GenBank中包括本研究提交的11条在内的所有33条铁皮石斛的ITS序列进行多重序列比对,随后以金钗石斛和密花石豆兰为外群,用邻接法构建NJ系统发育树。结果:从所有测定的ITS序列中选择11条提交GenBank,获得登录号JF803235-JF803245。所有铁皮石斛经比对后共发现645个同源位点,9个信息位点(ITS1区3个,5.8 S区4个,ITS2区2个)。系统发育分析发现,金钗石斛和密花石豆兰位于树的基部,另外32条铁皮石斛共同形成单个大的分支,未发现产地来源与系统树的拓扑结构之间存在对应关系。结论:由于缺乏完善的铁皮石斛标准品及其DNA参考序列的提交标准,同时单个ITS序列仅能提供有限的系统发育信息位点,因此通过ITS序列分析的方法推测铁皮石斛样品的产地来源目前尚不具有可行性。     

种子成熟度对泽泻种子萌发与植株生长的影响

目的研究种子成熟度对泽泻种子萌发与植株生长的影响。方法取不同成熟度泽泻种子分别在光照培养箱中做发芽试验和田间植株生长观察。结果泽泻花茎不同部位的花序发育时期差异较大,种子成熟度不同,其形态特征和萌发率及植株生长情况明显不同。生产上收获的种子成熟度参差不齐。结论种子成熟度是影响泽泻种子萌发和植株生长的重要因素,花茎中部花序的种子成熟度适中,适宜用于大田生产。     

铁皮石斛产业发展现状与对策

目的：20世纪90年代初,浙江率先实现了铁皮石斛产业化,铁皮石斛产业已在10多个省区蓬勃发展,将成为中药大产业。本文对铁皮石斛试管苗生产、人工栽培、保健品研发,以及市场开拓中出现的问题进行分析,并提出建议和对策,以促进铁皮石斛产业的健康发展。     

“永生源”铁皮石斛中多糖含量测定方法的比较研究

目的：筛选铁皮石斛中多糖含量测定的最佳方法。方法：分别采用苯酚-浓硫酸比色法和3,5-二硝基水杨酸比色法（DNS 法）测定铁皮石斛中多糖的含量。结果：苯酚-浓硫酸法测定铁皮石斛中多糖含量偏高。结论：DNS 法较为适合铁皮石斛中多糖含量测定,且所建立的方法操作简便、稳定、可重复,可用于铁皮石斛药材及其多糖类保健品的质量控制。     

GC-MS法检测铁皮石斛茎中挥发性成分△

目的:研究铁皮石斛茎中挥发性化学成分。方法:采用正己烷蒸馏法从铁皮石斛中提取挥发性成分,并用气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术,对铁皮石斛茎中的挥发性成分进行了测定。结果:共鉴定出31种化学成分,其中含量较高的主要有亚油酸甲酯(5.852%)、二十五烷(10.132%)、22,23-二氢豆甾醇(11.093%)和己二酸二辛酯(21.115%)等。结论:铁皮石斛茎的挥发性成分中含有多种化学成分,主要包括烷烃、酸、烯烃、酯、甾醇、二萜、蒽醌等类化学成分。该研究为进一步开发利用铁皮石斛茎资源提供了科学依据。     

大黄果实形态和种子发芽特性的初步研究

目的:初步了解掌叶大黄、唐古特大黄、药用大黄3种大黄果实形态和发芽特性的差异。方法:收集不同产地的3种大黄的栽培和野生种种子,观察其果实外观形态,检测其种子净度、千粒重、含水量、生活力和发芽率,考察不同温度、不同激素对掌叶大黄种子发芽率的影响。结果:3种大黄果实的外观形态和种子的各种物理特性指标都存在差异,其中药用大黄果实和种子均最大,千粒重也最重,甘肃岷县栽培的掌叶大黄的生活力与发芽率均较高,分别为95.7%和94%,其他种大黄的生活力与发芽率基本保持一致;温度对掌叶大黄种子萌发的影响作用较显著;不同质量浓度的GA3,KT,6-BA对掌叶大黄种子萌发均有一定的促进作用,以50×10-6g.L-1的KT促进作用最佳,其发芽率比对照组提高了18%。结论:3种大黄果实形态和发芽率存在很大差异,不同温度、不同激素处理对大黄种子萌发影响不同,为大黄的鉴定、生长发育及栽培生产提供一定的依据。