转化生长因子-α及表皮生长因子受体在肝内胆管癌形成过程中的表达

2000～2001年，我们通过免疫组织化学的方法，动态观察转化生长因子α(TGF-α)和表皮生长因子受体(EGFR)在叙利亚地鼠肝内胆管癌(ICC)形成过程中的表达情况，探讨上述因子在ICC形成过程中的作用。     

肝内胆管癌形成过程中表皮生长因子及其受体与转化生长因子-α的表达意义

通过免疫组织化学的方法，动态观察表皮生长因子(EGF)及其受体(EGFR)和转化生长因子-α(TGF-α)在叙利亚地鼠肝内胆管癌(ICC)形成过程中的表达情况，探讨上述因子在ICC形成过程中的作用。     

人肝再生增强因子小干扰RNA表达质粒的构建和鉴定

目的 检测人肝癌细胞株HepG2细胞有无人肝再生增强因子(hALR)的表达，构建针对人肝再生增强因子基因编码区的小干扰RNA(siRNA)表达质粒pSIALR-A及其阴性对照质粒pSIALR-B，观察其对人肝再生增强因子表达的影响。方法 用免疫细胞化学法观察HePG2细胞表达hALR的情况。将构建成功的pSIALR-A和pSIALR-B分别转染HepG2细胞，转染后48h，用免疫细胞化学法及逆转录聚合酶链反应法观察人肝再生增强因子蛋白及mRNA的表达。结果 HePG2细胞有人肝再生增强因子的表达。成功构建了针对人肝再生增强因子基因编码区的siRNA表达质粒pSIALR-A，并发现它能明显抑制人肝再生增强因子的表达，而随机序列的siRNA却无此作用。结论 人肝再生增强因子的siRNA具有明显和特异性的抑制人肝再生增强因子的表达作用。     

胃癌组织中转化生长因子α、表皮生长因子受体和增殖细胞核抗原的表达

目的:观察TGF-α,EGFR,PCNA在胃癌组织中的表达,研究三者对胃黏膜上皮细胞增殖的作用及与癌变的关系.方法:采用免疫组织化学SP法分别检测TGF-α,EGFR,PCNA在正常胃黏膜34例、胃癌62例中的表达,分析不同病理组织学分型的TGF-α,EGFR,PCNA表达差异.结果:TGF-α,EGFR,PCNA在正常胃组织阳性表达率均明显低于胃癌组织的阳性表达率(χ2=10.090,P<0.05;χ2=4.373,P<0.05;χ2=31.230,P<0.05).TGF-α,EGFR,PCNA在胃低分化腺癌阳性表达均明显高于高中分化腺癌(χ2=15.290,P<0.05;χ2=7.779,P<0.05;χ2=10.895,P<0.05),低分化腺癌与黏液癌之间阳性表达无显著性差异(P>0.05).胃癌组织中TGF-α与PCNA表达呈正相关(χ2=5.158,P<0.05).胃癌组织中EGFR与PCNA表达呈正相关(χ2=5.322,P<0.05).结论:TGF-α,EGFR和PCNA与胃癌发生相关,可能与胃癌的恶性程度有关,对判断预后有帮助.     

老年胃癌组织中表皮生长因子受体、人类表皮生长因子受体2及基质金属蛋白酶7的表达及其相关性

目的探讨老年胃癌组织中表皮生长因子受体(EGFR)、人类表皮生长因子受体(HER)2及基质金属蛋白酶(MMP)7的表达及相关性。方法选择行手术治疗的100例胃癌患者的胃癌组织蜡块标本,从100例胃癌组织蜡块标本上随机抽取50例,提取其癌旁组织作为癌旁对照组。比较EGFR、HER2、MMP7在胃癌组和癌旁组织的关系,并记录其和常见临床病理参数之间的关系。结果在胃癌组织中EGFR、HER2、MMP7的阳性表达率明显比癌旁组织高(P<0.05);EGFR、HER2、MMP7在胃癌组织中的表达和淋巴结转移、不同浸润程度、不同分化程度之间具有显著差异(P<0.05);在胃癌组织中,EGFR、HER2、MMP7的表达均呈现正相关(P<0.05)。结论 EGFR、HER2、MMP7和老年胃癌中许多临床病理特征之间存在着密切的关系,且三者呈协同作用,可作为对病情的诊断、治疗、预后提供参考依据。     

转化生长因子α对小鼠气道平滑肌细胞的促增殖作用

目的 探讨转化生长因子α(transforming growth factog alphg,TGF-α)对小鼠气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells,ASMC)促增殖作用及其机制.方法 用四唑盐(MTT)比色法和3H-TdR掺人法测定加入TGF-α后小鼠ASMC的增殖情况.本实验采用3H-TdR掺入法和MTT比色法观察选择性表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(AG1478)、EGFR中和抗体225(225mAb)、MEK抑制剂(U0126)、PI-3K抑制剂(Wonmannin)对加入TGF-α后促ASMC增殖的影响.通过Western Blot方法测定加入TGF-α及加用AG1478、225mAb后ASMC磷酸化EGFR蛋白表达.结果 用MTT比色法和3H-TdR掺入法测定ASMC培养液中加入TGF-α后ASMC增殖情况比对照组明显增加.加入AG1478、225mAb、U0126、Wortmannin可抑制TGF-α促ASMC增殖作用(P＜0.01).经Western Blot检测,TGF-α引起ASMC磷酸化EGFR蛋白表达增高.AG1478、225mAb抑制TGF-α所致ASMC磷酸化EGFR蛋白表达的增加(P＜0.01).结论 TGF-α激活EGFR为磷酸化EGFR,从而通过:①ras-raf-MEK-erk/MAPK途径;②PI3K-PKC-IKK途径;促进体外培养的小鼠ASMC的增殖.     

肝再生增强因子在肝癌细胞中的表达及意义

目的研究肝再生增强因子(ALR)对肝癌细胞和原代大鼠肝细胞增殖作用的影响及在肝细胞癌(HCC)中的表达。方法将不同种属的ALR分别与原代大鼠肝细胞和人肝癌细胞株QGY和HepG2共同培养后，用^3H-胸腺嘧啶核苷掺入法测定这些细胞的增殖情况。并应用免疫组织化学法对9例正常肝组织和21例HCC组织中ALR的表达进行了研究。结果不同种属的ALR在体外均能刺激人肝癌细胞株QGY和HepG2增殖，并呈剂量依赖关系，但对原代大鼠肝细胞均无刺激增殖作用。在正常肝组织中ALR不表达，但在HCC肝组织中ALR均表达，且ALR的表达程度与HCC分化程度和大小均无关。结论ALR可能在HCC的发生发展中起着重要作用。     

表皮生长因子对人肝癌细胞生长的影响及生长抑素对其受体的调节…

采用放射受体分析法确定，人肝癌细胞和正常肝细胞膜存在的特异的亲合力不同的二类ＥＧＦ受体，进一步用化学交联鉴定其受体分子量为１６８ｋＤａ，以＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入和细胞计数为指标，无血清培养下，ＥＧＦ能明显地促进肝癌细胞的生长；ＥＧＦ抗体，ＥＧＦ受体单克隆抗体，生长抑素（ＳＳ）能抑制肝癌细胞的生长并拮抗ＥＧＦ的促生长作用，肝癌细胞在含ＳＳ的无血清培养基中培养后，其ＥＧＦ受体结合率降低，说明ＳＳ对ＥＧＦ受     

RNA干扰技术抑制非小细胞肺癌表皮生长因子受体的表达

目的　观察RNA干扰技术是否能有效抑制非小细胞肺癌 (NSCLC)细胞株SPC A 1细胞表皮生长因子受体 (EGFR)的表达。方法　体外化学合成EGFR序列特异性双链RNA(dsRNA) ,与Lipofectamine 2 0 0 0结合后转染细胞 (分 4个组 ,A组 :加入无血清DMEM 5 0 0 μl;B组 :加入Lipofectamine2 0 0 0稀释液 2 5 0 μl及无血清DMEM 2 5 0 μl;C组 :加入非特异性dsRNA/Lipofectamine复合物 5 0 0 μl;D组 :加入dsRNA EGFR/Lipofectamine复合物 5 0 0 μl) ,用Westernblot和流式细胞仪检测EGFR表达。流式细胞仪测细胞周期 ,结合集落形成、化疗敏感性分析观察SPC A 1细胞生物学特性的改变。结果　与A组比较 ,D组EGFR数量减少了 71 31% (P <0 0 0 1) ,B组和C组分别降低了 9 0 %和 16 2 % (P >0 0 5 )。与A组比较 ,D组细胞生长抑制了 78 3% ,集落形成抑制了 6 6 8%。D组G0 G1期细胞百分数较A组增加了 17 4 8% ,D组进入S期的细胞百分数较A组减少了 19 2 0 %。据Origin 6 0计算的IC50 ,dsRNA EGFR可将细胞对顺铂的敏感性提高约 7倍。结论　dsRNA EGFR可有效抑制SPC A 1细胞EGFR表达 ,将更多的细胞阻滞在G0 G1期 ,抑制细胞增生 ,提高细胞对顺铂的敏感性 ,RNA干扰技术为NSCLC基因治疗提供了新策略。     

表皮生长因子及其受体表达与原发性肝癌的相关性探讨

目的探讨表皮生长因子（EGF）及其受体（EGFR）在肝癌发生、发展中的作用。方法采用免疫组化S-P法检测40例肝癌（肝癌组）、30例乙肝肝硬化（肝硬化组）及20例健康人（对照组）肝组织中EGF和EGFR表达情况。结果肝癌组EGF和EGFR阳性率显著高于肝硬化组和对照组（P〈0．01）;I期、Ⅱ期、Ⅲ期肝癌EGF和EGFR阳性率逐渐增高;Ⅱ期和Ⅲ期显著高于I期（P〈0．05）。结论EGF和EGFR在肝癌呈过表达,是肝癌发生、发展和转移的重要促进因素。     

α-亚麻酸对转化生长因子β1诱导的肝星状细胞的影响

目的:探讨α-亚麻酸(α-linolenic acid,ALA)对转化生长因子1(transforming growth factor-β,TGF-β1)诱导的肝星状细胞(hepatic satellite cell,HSC)增殖及分泌功能的影响.方法:采用活化的HSC作为研究模型,将传代的细胞分为5组,以MTT比色法观察ALA对HSC的增殖效应,以ELASA检测细胞培养上清液中Ⅰ型及Ⅲ型胶原的含量,以Westernblot法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达.结果:TGF-β1能诱导HSC增殖并促进胶原的分泌,ALA可不同程度抑制TGF-β1所诱导的HSC增殖及Ⅰ、Ⅲ型胶原和α-SMA的表达(P<0.01),且呈剂量依赖性(P<0.05).结论:ALA在高浓度时对TGF-β1能诱导的HSC起抑制作用,可能对脂肪性肝纤维化及其引起的肝硬化有治疗作用.     

表皮生长因子对人肝癌细胞生长的影响及生长抑素对其受体的调节作用

采用放射受体分析法确定，人肝癌细胞和正常肝细胞膜存在特异的亲合力不同的二类ＥＧＦ受体。进一步用化学交联法鉴定其受体分子量为１６８ｋＤａ。以３Ｈ－ＴｄＲ掺人和细胞计数为指标，无血清培养下，ＥＧＦ能明显地促进肝癌细胞的生长；ＥＧＦ抗体、ＥＧＦ受体单克隆抗体、生长抑素（ＳＳ）能抑制肝癌细胞的生长并拮抗ＥＧＦ的促生长作用。肝癌细胞在含ＳＳ的无血清培养基中培养后，其ＥＧＦ受体结合率降低。说明ＳＳ对ＥＧＦ受体有下调节作用。这可能是ＳＳ抑制肝癌细胞生长的机制之一。     

大肠癌组织人表皮生长因子受体2表达对患者预后的影响

目的探讨大肠癌组织人表皮生长因子受体2(HER-2/neu)表达对患者预后的影响。方法大肠癌患者140例,均行根治性手术。采用免疫组织化学或荧光原位杂交法(FISH)检测大肠癌组织HER-2/neu。比较HER-2/neu阳性组、阴性者的临床病理资料、5年生存率,分析术后生存的危险因素。结果 HER-2/neu阳性、阴性者性别、年龄、分化程度、肿瘤部位、T分期比较P均>0.05;N分期、TNM临床分期比较,P均<0.05。HER-2/neu阳性者5年生存率为54.7%,阴性者为74.8%,P=0.03。HER-2/neu是影响大肠癌患者术后5年生存率的独立危险因素(RR=1.068,95%CI:1.009~1.129,P=0.02)。结论 HER-2/neu可作为结肠癌预后评估的指标之一。     

过氧化物酶体增殖活化受体-α激活对HepG2细胞脂肪变性及血红素加氧酶-1表达的影响

目的 研究过氧化物酶体增殖活化受体-α(PPAR-α)激活对油酸诱导的HepG2细胞脂肪变性及血红素加氧酶-1 (HO-1)表达的影响.方法 以油酸(OA)诱导人肝癌HepG2细胞脂肪变性为模型组,采用不同浓度的PPAR-α激动剂非诺贝特(FF)处理HepG2细胞24h,油红O染色观察细胞内脂滴数量,甘油-3-磷酸氧化酶法检测细胞内甘油三酯(TG)含量,采用实时荧光定量PCR检测各组HepG2细胞PPAR-α、HO-1 mRNA水平,采用免疫细胞化学法检测PPAR-α与HO-1蛋白表达.采用SPSS13.0软件,采用单因素方差分析及Pearaon直线相关进行相关分析.结果 (1)模型组HepG2细胞内TG含量为(379.98±23.19) mg/g,对照组为(185.03±12.68) mg/g,模型组HepG2细胞内TG含量明显增加,t=24.385,P＜0.01.PPAR-α的mRNA及蛋白相对表达水平模型组分别为0.42±0.38和0.47±0.14,对照组分别为1.00±0.00和1.85±0.12,模型组明显降低,t=0.583和1.382P值均＜0.01.HO-1的mRNA及蛋白相对表达水平模型组分别为0.36±0.66和0.26±0.10,对照组分别为1.00±0.00和1.22±0.12,模型组明显降低,t=0.637和t=0.967,P值均＜0.01;(2)FF浓度在5、10、50μmol/L时,HepG2细胞内TG值分别为(294.00±19.80) mg/g、(250.33±9.96)mg/g和(196.99±9.14) mg/g,t值分别为10.747、16.200和22.873, F=148.555;P值均＜0.01 ;PPAR-α的mRNA相对表达量分别为0.55±0.65,0.85±0.61,1.31±0.36,t值分别为0.137、0.430和0.893,F=177.637,P值均＜0.01;PPAR-α蛋白累积光密度值分别为0.82±0.11、1.31±0.16和1.75±0.13,t值分别为0.352,0.840,1.280,F=120.764,P值均＜0.01;HO-1的mRNA相对表达量分别为0.62±0.05、0.84±0.07和1.30±0.11,t值分别为0.257,0.480,0.937,F=74.768,P值均＜0.01;HO-1蛋白累积光密度值分别为0.44±0.08、0.81±0.08和1.20±0.10,t值分别为0.180,0.553,0.943,F=119.903,P值均＜0.01.结论 PPAR-α的激活可以抑制HepG2细胞脂肪变性,HO-1可能是其重要下游因子.     

四甲基吡嗪对大鼠肝星状细胞肌细胞增强因子2A及α-平滑肌肌动蛋白表达的影响

[目的]观察肌细胞增强因子2A (Myocyte enhancer factor 2A、MEF2A)在肝星状细胞(Hepatic Stellate Cell、HSC)活化过程中的可能作用及四甲基吡嗪对其影响,进一步探讨四甲基吡嗪抗肝纤维化的作用机制.[方法]采用SD大鼠肝脏原位灌流消化法获得HSC,并原代及传代培养,分离的HSC在塑料细胞培养皿中培养后逐步活化,分别收集新分离(0 d)和经培养(1、2、3、4、5、6、7、8 d)的HSC,观察MEF2A与HSC活化指标α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle action、α-SMA)表达的关系;取传2～4代HSC,加四甲基吡嗪至终浓度50、100、150、200mg/L,分组培养48 h,观察四甲基吡嗪对HSC增殖抑制作用的同时,对MEF2A基因及蛋白表达的影响.[结果]①随着HSC培养逐步活化,细胞内MEF2A及α-SMA逐步增加,二者呈正相关(r=0.90,P＜0.05),且MEF2ADNA结合活性同步增强.②随着四甲基吡嗪浓度增加,对HSC增殖的抑制作用增强,同时对MEF2A表达抑制作用逐渐增强.[结论]MEF2A可能参与了HSC活化过程,四甲基吡嗪抑制HSC增殖作用可能与有效抑制MEF2A表达有关.     

介导EGFR siRNA转染肝癌HepG2细胞的试剂筛选及条件优化

目的筛选介导表皮生长因子受体（EGFR）小干扰RNA（siRNA）转染肝癌HepG2细胞的试剂,并优化转染条件。方法设计靶向EGFR的特异性siRNA,分别用Lipofectamine 2000、siPORT Amine、ICAFectin 442、N-TER nanoparticle、X-tremeGENE、polyMagnetofection、combiMAGnetofection介导转染肝癌HepG2细胞48、72 h。实时定量RT-PCR检测HepG2细胞的EGFR mRNA,计算敲除EGFR mRNA率,据此筛选出最佳转染试剂,继续进行不同试剂用量、不同siRNA浓度、正反向转染的对比。测算转染后细胞存活率及转染率。结果 Lipofectamine2000、siPORTAmine及combiMAGnetofection介导转染72 h后,HepG2细胞的EGFR mRNA敲除率均超过65%。2μl的combiMAGnetofection及200 nM的EGFR siRNA组合、72 h时HepG2细胞的EGFR mRNA沉默效率最高（90%±1%）,其细胞存活率为94%±8%,转染率超过95%。结论介导EGFR siRNA转染HepG2细胞的最佳试剂是combiMAGnetofection,优化转染条件为2μl的combiMAGnetofection、200 nM的EGFR siRNA、转染72 h。     

人类表皮生长因子受体2和拓扑异构酶Ⅱα在结肠癌中的表达及意义

目的探讨人类表皮生长因子受体(HER)2和拓扑异构酶(TOPO)Ⅱα在结肠癌中的表达及意义。方法联合免疫组化技术和酶联免疫吸附试验(ELISA)分别对结肠癌患者(结肠癌组)和健康对照组1(组织)和健康对照组2(血清)中的HER2和TOPOⅡα进行定性与定量检测,并分析两者之间的相关性。结果 HER2和TOPOⅡα在结肠癌患者组织中的阳性率分别为37.8%和57.8%;结肠癌患者血清中HER2和TOPOⅡα含量分别为(4.878 2±0.629 3)ng/ml和(3.585 6±0.688 2)ng/ml,显著高于健康对照组2血清含量(2.056 4±0.623 5)ng/ml和(2.014 7±0.476 9)ng/ml,且结肠癌组组织和血清中二者的表达均呈正相关(r=0.480,r=0.610,均P0.05)。结论结肠癌患者组织和血清HER2和TOPOⅡα表达与结肠癌发生具有一定相关性,两者联合检测可为结肠癌患者早期诊断提供一定实验依据。     

Cdc42基因在表皮生长因子促进HepG2细胞丝状伪足形成中的作用

目的:探讨表皮生长因子(EGF)对HepG2细胞丝状伪足形成和细胞体外侵袭能力的影响以及细胞分裂周期蛋白42(Cdc42)在其中的作用.方法:将Cdc42 siRNA转染HepG2细胞株,RT-PCR和Western blot检测EGF组、EGF+siRNA干扰组、siRNA干扰组及空白对照组细胞Cdc42 mRNA转录以及蛋白的表达水平,微丝绿色荧光探针(actin-tracker green)染色检测HepG2细胞丝状伪足形成,侵袭小室检测细胞体外侵袭能力.结果:经EGF处理后HepG2细胞可见明显丝状伪足形成,EGF组细胞Cdc42 mRNA及总蛋白(Total-Cdc42)表达量无显著变化,但活性Cdc42(Active-Cdc42)显著增高(0.713±0.021vs0.423±0.015,P<0.05),siRNA干扰细Cdc42表达及活性受到明显抑制(0.118±0.017 vs 1.128±0.024;0.351±0.021 vs 0.936±0.024,均P<0.05),并抑制EGF诱导的细胞丝状伪足形成,EGF组细胞体外侵袭能力显著高于其余各组(98.43+3.11vs61,09±3.58,50.53±2.34,62.73±2.64,均P<0.05).结论:EGF通过激活Cdc42诱导HepG2细胞丝状伪足形成并增强其体外侵袭能力.