TaqMan探针实时荧光PCR方法检测粪便中微小隐孢子虫卵囊

以微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)特异性DnaJ-like蛋白基因的保守序列为模板,设计和合成特异性引物和荧光标记探针,通过检测微小隐孢子虫卵囊DNA和加标模拟样品进行敏感性分析,建立标准曲线,并对其特异性和干扰性进行评价。结果显示,该方法只对微小隐孢子虫卵囊进行特异性扩增,其他常见的肠道原虫和肠道病原菌均不能扩增;微小隐孢子虫纯卵囊基因组DNA检测的灵敏度为26个/ml;对加标粪样可检测至2 600个/ml卵囊。提示本研究建立的实时荧光PCR检测微小隐孢子虫卵囊方法具有快速、特异性和敏感性高等优点。     

蓝氏贾第鞭毛虫和微小隐孢子虫双重荧光定量PCR两步法检测技术的建立

目的 建立同时检测蓝氏贾第鞭毛虫和微小隐孢子虫的双重荧光定量PCR两步检测方法。方法 针对蓝氏贾第鞭毛虫的gdh基因和微小隐孢子虫的cowp基因分别设计特异性引物和TaqMan探针。优化引物和探针浓度后,确定反应体系和反应条件,对其灵敏度、特异性、稳定性和重复性进行评价。通过与金标层析法进行医源性腹泻样本检测的比较评估该方法的实际应用价值。结果 该方法能特异地检测蓝氏贾第鞭毛虫和微小隐孢子虫,对其它非目标虫种均不产生扩增曲线,特异性良好。对阳性质粒pMD^TM19-T-GIA和pMD^TM19-T-CRY同时定量扩增的敏感度分别为45.1 copies/μL和52.8 copies/μL;阳性质粒标准品的标准曲线在10⁹ copies/μL10¹ copies/μL之间线性关系良好(R²=0.99),批内和批间重复实验的变异系数均小于5%。该方法与金标层析法具有较好的一致性。结论 建立的双重荧光定量PCR两步法可快速、灵敏、特异地同时检测蓝氏贾第鞭毛虫和微小隐孢子虫,具有较好的实际应用价值。     

犬库布病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用北大核心CSCD

目的建立可检测狐狸物种中犬库布病毒(CaKoV)的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。方法利用PCR方法扩增狐狸CaKoV的3D基因504bp,将其克隆到pEASY-Blunt载体,构建重组质粒作为阳性质粒,以其为模板建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,验证其灵敏度、特异性和重复性。结果建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法检测目的基因在6.12×10^(1)~6.12×10^(8)拷贝/μl时呈良好的线性关系,相关系数为0.994,斜率为-4.369,灵敏度6.12×10^(1)拷贝/μl。该方法对于CPV、CDV和CCV未出现特异性扩增。所有标准曲线在溶解温度为86.49℃时出现单一的特异峰。使用本方法检测2021年辽宁、山东地区的253份狐狸临床标本,总阳性率为7.91%。结论建立的CaKoV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法敏感、特异,用于狐狸CaKoV感染的快速检测。     

微小隐孢子虫的基因检测实验研究

目的　探讨聚合酶链反应 (PCR)检测微小隐孢子虫 (Cryptosporidium parvum)感染的特异性和敏感性。　方法用 Sheather's蔗糖梯度离心法从微小隐孢子虫感染者粪便标本中分离纯化卵囊。用酚 -氯仿法抽提卵囊总 DNA。针对本虫 18S r RNA基因片段设计 1对引物 ,对模板 DNA进行 PCR扩增 ,同时以蓝氏贾第鞭毛虫 (Giardia lamblia)、溶组织内阿米巴 (Entamoeba histolytica)、阴道毛滴虫 (Trichomonas vaginalis)、刚地弓形虫 (Toxoplasma gondii)、日本血吸虫(Schistosoma japonicum)和旋毛虫 (Trichinella spiralis) ,以及人体血细胞等 DNA样本为对照。用琼脂糖电泳和溴乙腚染色对 PCR产物进行检测。　结果　仅微小隐孢子虫 DNA被扩增出一 5 0 0 bp的 DNA片段。其它对照 DNA样本均未出现扩增反应。　结论　PCR对隐孢子虫检测的特异性可高达 10 0 % ,敏感性也很强 ,可检测到 2 0 pg微小隐孢子虫卵囊的DNA。表明本实验建立的检测微小隐孢子虫的 PCR方法有效     

微小隐孢子虫的基因检测实验研究

目的 探讨聚合酶链反应（PCR）检测微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum)感染的特异性和敏感性。方法 用Sheather's蔗糖梯度离心法从微小隐孢子虫感染者粪便标本中分离纯化卵囊，用酚-氯仿法抽提卵囊总DNA，针对本虫18SrRNA基因片段设计1对引物，对模板DNA进行PCR扩增，同时以蓝氏贾第鞭毛虫（Giardia lambia)，溶组织内阿米巴（Entamoeba histolytica)。阴道毛滴虫（Trichomonas vaginalis)。刚地弓形虫（Toxoplasma gondii)。日本血吸虫（Schis-tosoma japonicum)和旋毛虫（Trichinella spiralis)，以及人体血细胞等DNA样本为对照，用琼脂糖电泳和溴乙腚染色对PCR产物进行检测。结果 仅微小隐孢子虫DNA被扩增出-500bp的DNA片段，其它对照DNA样本均未出现扩增反应。结论 PCR对隐孢子虫检测的特异性可高达100%，敏感性也很强，可检测到20pg微小隐孢子虫卵囊的DNA，表明本实验建立的检测微小隐孢子虫的PCR方法有效。     

贝类奥尔森派琴虫实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立一种快速、灵敏、特异的用于检测贝类奥尔森派琴虫的实时荧光定量PCR方法。方法根据基因库中奥尔森派琴虫的基因保守序列,设计合成1对引物和1条TaqMan探针,建立荧光定量PCR方法,对采自广西沿海的49份贻贝标本进行检测,并与常规PCR比较。结果建立的荧光定量PCR方法灵敏度可达20个拷贝,比常规PCR灵敏度高100倍。49份贻贝标本的阳性率为16.3%,检测的奥尔森派琴虫基因组DNA含量为2.38×10^6～9.21×10^2拷贝/μl。结论建立的荧光定量PCR方法可以用于贝类奥尔森派琴虫感染的快速检测。     

中东呼吸综合征冠状病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立一种快速、敏感、特异的实时荧光定量PCR(Real-time PCR)方法,用于中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)的检测。方法根据中东呼吸综合征冠状病毒S蛋白基因的保守序列设计并合成一对引物及一条特异性TaqMan探针。通过条件优化,以10倍系列稀释重组质粒为标准品,进行Real-time PCR扩增,绘制标准曲线,并进行重复性、准确性、特异性及敏感性检测。结果建立的Real-time PCR方法检测中东呼吸综合征冠状病毒所绘制标准曲线的相关系数0.99,灵敏度为1.00×101拷贝,高于常规PCR方法(1.00×102拷贝);用该方法检测中东呼吸综合征冠状病毒基因为阳性,其他6种对照呼吸道病原体及冠状病毒基因检测均呈阴性;批内、批间重复试验的变异系数均1%。结论建立的中东呼吸综合征冠状病毒Real-time PCR检测方法灵敏、特异、重复性好,可用于中东呼吸综合征冠状病毒感染的快速诊断和流行病学调查。     

牛隐孢子虫多重PCR方法的建立及应用

摘要：目的 为寻求一种牛源隐孢子虫的快速检测手段。方法 根据牛隐孢子虫COWP基因和ITS-1基因,设计合成两对特异性引物,用以特异性扩增牛微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫,扩增长度分别为1033bp和263bp。通过反应条件的优化,特异性试验及扩增片段的序列测定的验证,建立多重PCR方法。结果 应用该方法对采集自广西不同地区的1613份牛粪样进行牛隐孢子虫检测,安氏隐孢子虫阳性粪样为189份,微小隐孢子虫阳性粪样1份,与常规隐孢子虫分离鉴定结果一致。结论 表明该方法可用于隐孢子虫的流行病学调查及临床诊断。     

实时荧光定量PCR在登革热病毒快速检测中的应用

目的应用实时荧光定量PCR快速检测登革热病毒感染。方法采集疑似登革热患者血清,采用实时荧光定量PCR检测登革热病毒,同时采用ELISA检测血清登革热IgM抗体。结果患者发病第7d血清登革热IgM血清抗体A值为0.236和0.237(临界值0.250),高度疑似阳性,第13d血清IgM抗体阳性。患者发病第2d,通用型核酸检测显示血清登革热病毒核酸含量较多,经过治疗,于第7d病毒拷贝下降。发病第2d,核酸检测确定感染病毒为登革热Ⅲ型;发病第13d血清登革Ⅲ型病毒核酸检测阴性。结论实时荧光定量PCR法具有准确性好、灵敏度高等优点,可用于登革热病毒感染的快速检测。     

猪逆转录病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立及应用北大核心CSCD

目的开发一种能够准确、灵敏、特异检测猪逆转录病毒(PERV)的荧光定量PCR方法。方法根据GenBank数据库中PERV Gag基因的高度保守序列,设计1对特异性引物,建立用于检测PERV的SYBR GreenⅠqPCR检测方法,并验证其灵敏性、重复性和特异性。结果建立的标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数R^(2)=0.998。该方法检测PERV下限为2.04×10^(2)copies/μl,批内批间变异程度较低,变异系数小于2%,且与PCV2、PRRSV、PEDV、TGEV和SVA等均无交叉反应。利用该qPCR方法对采集的49份猪组织样品进行检测,阳性率为81.63%,高于普通PCR阳性检出率的73.47%。结论建立的快速、定量检测PERV的SYBR Green I qPCR方法敏感、特异,具有一定的应用前景。     

检测蚊虫感染黄病毒属病毒Real-time PCR方法的建立

目的 建立SYBR Green Real-time PCR检测和筛选黄病毒属病毒方法. 方法 参照文献报道的通用引物,以JEV cDNA 和DEN cDNA为模板,建立RT-PCR和SYBR Green Real-time PCR,检测和筛选黄病毒属病毒,并比较两者的敏感性. 结果 此黄病毒属引物适合两种反应体系,SYBR Green Real-time PCR方法的敏感性是RT-PCR方法的100倍,最低检出病毒浓度为0.5×10-2 PFU/ml. 结论 建立的两种方法均可用于黄病毒属病毒检测,以SYBR Green Real-time PCR方法具有更高的敏感性,对于黄病毒属病毒初筛检测具有应用价值.     

A SYBR green-based real-time PCR method for detection of haemopoietic chimerism in allogeneic haemopoietic stem cell transplant recipients

OBJECTIVE: To develop a reliable and rapid real-time quantitative polymerase chain reaction (Q-PCR) method using SYBR green to quantify chimerism in allogeneic haemopoietic stem cell transplant recipients. METHODS: Twelve specific nucleotide polymorphisms (NPs) were selected to identify informative markers for detecting chimerism in transplant donor/recipient pairs. One informative marker was then used in SYBR green Q-PCR to detect chimerism post-transplantation in each patient. The percentage of donor cells was calculated using a standard curve, constructed using artificially mixed donor/recipient chimeric DNA in 12 serial dilutions (0.01-100%). RESULTS: DNA from 37 donor/recipient pairs was screened for informative markers and 18 post-transplant samples were monitored for chimerism with SYBR green Q-PCR method. The Q-PCR was able to discriminate between recipient and donor genetic profiles in all 18 samples, and quantify the chimerism. These results were confirmed by at least one independent method, such as TaqMan Q-PCR, microsatellite and fluorescent in situ hybridisation (FISH) methods. The detection limit of this method was 0.1%, which was more sensitive than the two currently used microsatellite and FISH methods. CONCLUSION: The new single platform SYBR green Q-PCR method is capable of detecting all haemopoietic chimerism with high accuracy; hence, it may be used to replace the current detection methods.     

嗜水气单胞菌双重荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

目的建立快速准确检测致病性嗜水气单胞菌的双重荧光定量PCR方法。方法针对嗜水气单胞菌的16S rDNA和气溶素基因aerA的序列设计特异性引物及TaqMan探针,优化双重荧光定量PCR反应条件,并结合常规PCR方法及分离培养鉴定对临床样品进行检测和对比验证。结果荧光定量PCR反应体系对质粒标准品的敏感性为10拷贝/反应,是常规PCR检测方法的100倍;该方法检测12种其他种属细菌时未出现假阳性;对实际样品的检测结果其敏感性同样高于普通PCR,定量检测目的基因的拷贝数与样品中目的菌的分离率成正比。结论本方法敏感性高,特异性好,可用于致病性嗜水气单胞菌感染的诊断、疾病防控及流行病学研究。     

人类SUZ12基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的:建立SYBR Green I实时荧光PCR定量检测人类SUZ12基因的方法.方法:将SUZ12 RT-PCR扩增片段克隆入载体pGEM-T后,经测序鉴定正确后,进行纯化和定量及系列稀释,应用SYBR Green I实时荧光定量PCR检测SUZ12,建立标准曲线,熔解曲线分析产物的特异性.结果:该法检测的最低拷贝数为14.2,线性范围为1.42×10~1-1.42×10~8拷贝,相关系数r为-1.00,1.42×10~7拷贝/L标本的批内变异系数(CV)和日间CV分别为1.8%和2.8%.熔解曲线分析显示单一的峰,熔解温度(melting temperature,Tm)为(81.37±0.16)℃.结论:实时荧光定量PCR方法检测SUZ12基因,快速有效、灵敏度高、特异性好.     

荧光定量聚合酶链反应检测输血传播病毒方法的建立及应用

[目的]建立输血传播病毒(transfusion transmitted virus,TTV)荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测方法,为快速、准确地定量检测TTV奠定基础.[方法]根据TTV ORF2区基因序列,设计并合成引物和荧光标记探针.将PCR扩增的TTV的ORF2区基因片段克隆入载体,重组质粒经筛选、鉴定后,作为阳性模板,用于标准曲线的制定和样品检测.[结果]应用重组质粒制作的定量曲线循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系.与定量对照曲线比较计算,10例TTV标本中TTV拷贝数为3.8×105～8.9×1O8拷贝/μl.[结论]检测TTV的FQ-PCR方法较常规PCR技术更为简便、快速、准确,有很好的应用前景和研究价值.     

流产衣原体荧光定量PCR方法的建立及小鼠感染菌体载量测定

目的 建立荧光定量PCR (qPCR)对流产衣原体的检测方法。在流产衣原体灭活疫苗的生产中,代替具有主观判断影响的涂片染色疫苗效价检测方法。方法 根据流产衣原体富含半胱氨酸的胞质蛋白(envB)基因保守序列设计特异性引物,利用EnvB-PMD19T阳性质粒为参考标准品,优化了反应条件,进行了敏感性、特异性及重复性试验,检测了感染流产衣原体小鼠的菌体载量。结果 以重组质粒为标准品建立的标准曲线在1×10² copies/μL~1×10⁶ copies/μL内呈现良好的线性关系,扩增效率为97%。灵敏度试验表明,该检测方法的最低检出限低至10 copies/μL。组内、组间重复性试验的变异系数均小于2%,具有良好的重复性和稳定性。消化道检测到的菌体载量高于腹腔注射的菌体载量。结论 本研究建立的方法能够有效的检测小鼠相应脏器的菌体含量,为流产衣原体灭活疫苗的效检提供可靠的检测方法。     

空肠弯曲菌实时荧光定量PCR检测方法的研究

目的建立一种快速廉价的检测空肠弯曲菌的实时荧光定量PCR方法。方法根据空肠弯曲菌flaA、gyrA基因设计引物,建立空肠弯曲菌实时荧光定量PCR检测方法。结果以flaA基因引物对空肠弯曲菌DNA进行实时荧光定量PCR,扩增曲线呈S形指数增长,大肠埃希菌等对照菌扩增阴性。方法的灵敏度为10CFU/ml菌悬液。结论建立的空肠弯曲菌荧光定量PCR检测方法具有快速、简便、准确等特点,具有一定的使用价值。     

夹心ELISA检测微小隐孢子虫抗原方法的建立及初步应用

目的 建立检测隐孢子虫的夹心ELISA方法。方法 本试验以纯化的抗隐孢子虫IgG、IgY分别作为包被抗体和捕获抗体,棋盘滴定法确定夹心ELISA的最适工作条件。用基于18SrRNA的PCR方法评估饱和蔗糖溶液、饱和食盐水漂浮和PBST洗涤剂洗涤3种方法预处理样品对夹心ELISA检测效果的影响。结果 建立的夹心ELISA捕获抗体、抗原、检测抗体、酶标二抗最佳工作浓度分别是1∶800、2.5 μg/mL、1∶100和1∶5 000,最适捕获抗体包被、抗原抗体反应、酶标二抗反应条件分别为37 ℃作用1 h后4 ℃过夜、37 ℃作用30 min、45 min;最适终止条件是2 mol/L H₂SO₄,50 μL/孔;TMB室温显色10 min;特异性试验结果显示仅可以检出隐孢子虫抗原,而与常见肠道寄生的球虫卵囊、圆线虫和蛔虫虫卵无交叉反应。批间和批内变异系数均小于10%。3种方法前处理粪便用于ELISA检测与nested-PCR检测结果总符合率分别为95.83%、91.67%和83.33%,以饱和蔗糖溶液漂浮法处理检测样品的效果最佳。与爱德士的隐孢子虫检测试剂盒比较,结果显示,本方法敏感性低于爱德士试剂盒的最低检出量(6×10³个/mL),整个试验过程比试剂盒多用15 min,但特异性和重复性均一致,且本试验方法更加经济实用。结论 该方法简便,快速,灵敏,可用于临床粪样中隐孢子虫病原检测或隐孢子虫流行病学调查研究。     

香港海鸥形菌多重PCR及嵌合荧光PCR检测方法的建立与应用

目的 建立香港海鸥形菌(Laribacer hongkongensis, LH)的多重PCR(multi-PCR)及嵌合荧光法(SYBR Green I)PCR检测方法,并对其在临床及环境微生物方面的应用前景进行评价。方法 通过对62株香港海鸥形菌16S RNA 基因和16S-23S rRNA基因间隔区(16-23S rRNA intergenic spacer region, ISR)进行PCR扩增和多序列比对,设计两对特异性引物,建立多重PCR体系,用15种细菌性腹泻标准菌株及临床菌株进行PCR特异性和敏感性检验;并在此基础上针对两对引物分别用嵌合荧光PCR法进行浓度梯度检测,以确定最低检测限。结果 香港海鸥形菌多重PCR法特异性为100%,最低检出限为5×10³ CFU/mL菌液;而嵌合荧光PCR法两对引物的最低检出限均达到5×10² CFU/mL菌液。结论 该法的建立为临床及环境微生物学提供了一种快速和灵敏的香港海鸥形菌检测手段。