人源性抗日本血吸虫噬菌体抗体库的构建及初步鉴定

目的利用噬菌体抗体展示技术构建人源性抗日本血吸虫Fab段噬菌体抗体库并进行初步鉴定。方法RT-PCR从对血吸虫感染有一定抗性成年人外周血淋巴细胞中扩增出入IgG轻链和重链Fd段基因片段，将其克隆入PComb3中．构建人源性Fab段噬菌体抗体库。并用限制性内切酶酶切、序列分析、DOT-BLOT以及SDS-PAGE等方法对噬菌体抗体库进行初步鉴定。结果噬菌体抗体库的滴度为6．2×10^11／L。库容量为1．2×10^7。酶切鉴定结果显示噬菌体抗体库轻重链重组率达到66．6％，测序结果表明克隆入PComb3的是人免疫球蛋白轻链和重链基因,DOT-BLOT实验证明该抗体库表达了人源性的抗体，而SDS-PAGE证实了免疫球蛋白Fab段的可溶性表达。结论成功地构建了人源性抗日本血吸虫Fab段噬菌体抗体库，为筛选人源性抗日本血吸虫的抗体、研究这些抗体的特性和功能奠定了基础。     

人源性抗HBsAg噬菌体抗体的筛选及纯化

目的:获得人源性抗HBsAg抗体Fab片段。方法:用预包被HBsAg的ELISA板,从构建的人全套抗体库中筛选出针对HBsAg的噬菌体抗体。并转入大肠杆菌中表达。破裂细胞后,获得可溶性Fab片段。以羊抗人Fab抗体偶联HiTrap柱,用     

人源性促甲状腺激素受体抗体Fab段抗体库的构建

目的 通过噬菌体表面展示技术,构建人源性促甲状腺激素受体抗体(TRAb)Fab片段抗体库.方法 从甲状腺功能亢进症患者外周血单个核细胞抽提总RNA,PCR法扩增免疫球蛋白分子轻链K、λ基因及重链Fd基因.构建轻链文库及组合文库.一个随机的组合文库在噬菌体表面表达.结果 从外周血单个核细胞中抽提得到总RNA,并反转录获得cDNA文库.PCR法扩增了大小约为680 bp的轻链K、λ基因及重链Fd基因,并构建了库容为1.32×105基因抗体库(轻链库)和库容为2.28×105 Fab抗体库(组合文库).Fab组合文库转化到大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞,在辅助噬菌体M13K07的辅助下,扩增得到噬菌体抗体库.结论 噬菌体表面展示技术可成功构建人源性TRAb Fab片段组合文库.     

人天然Fab段噬菌体抗体库的构建

目的通过构建人天然F ab段噬菌体抗体库为恶性肿瘤的免疫治疗提供新方法。方法取4个健康献血员新鲜血液各200m l,分离淋巴细胞,提取总RNA,经逆转录合成cDNA,设计多对引物,以PCR扩增抗体轻链和重链Fd段cDNA。轻链PCR产物和质粒载体pCom b3经SacⅠ和X baⅠ酶切,由T 4 DNA连接酶连接,电穿孔转化感受态大肠杆菌XL 1-B lue,扩增后提取质粒,构建轻链库。轻链库和重链Fd段PCR产物经X hoⅠ和SpeⅠ酶切,同样方法连接转化XL 1-B lue,加入辅助噬菌体VCSM 13产生噬菌体抗体全库。酶切鉴定轻链库和全库有无插入片段。结果提取的淋巴细胞总RNA质量好,部分重链Fd片段、部分κ轻链和λ轻链cDNA得到扩增。F ab全库库容达5.4×106,酶切证实有插入片段。结论本研究构建的人天然F ab段噬菌体抗体库可为进一步筛选特异性抗体及从肿瘤组织中提取肿瘤抗原用于免疫治疗奠定基础。     

A型流感病毒通用型人源化抗体的构建及初步鉴定

目的制备A型流感病毒通用型人源化抗体并进行鉴定。方法通过文献检索、蛋白质序列数据库(Swissprot)、蛋白质结构数据库(PBD)等获得抗流感抗体的序列信息,经计算机分析软件InsightⅡ分析抗体结构,采用分子模拟、分子对接等方法分析抗体的轻、重链可变区基因结构,用昆虫细胞偏嗜密码子优化氨基酸序列,合成抗流感病毒抗体轻、重链可变区基因;对合成氨基酸序列中的轻、重链可变区基因作酶切鉴定,将轻链可变区基因与杆状病毒表达载体PAC-κ-CH3连接,构建PAC-κ-L-CH3,酶切合成的重链可变区基因与PAC-κ-L-CH3连接,构建PAC-κ-L-H-CH3重组表达载体,鉴定正确后,同杆状病毒DNA共转染至昆虫细胞(sf9)中,于27℃用无血清培养基培养,收集上清,应用各亚型流感病毒株灭活后进行血凝抑制试验和ELISA试验,检测制备的抗体对流感病毒的通用性;通过荧光抗体试验检测抗体在细胞中的表达。结果重组杆状病毒表达载体转染sf细胞后,传代上清中检测到抗体;血凝抑制试效价为1︰2;ELISA结果显示有3株制备的抗体对3种流感病毒呈阳性反应,1株对实验用的流感病毒株没有反应;转染后传代细胞的荧光抗体鉴定结果显示有阳性抗体表达。结论成功采用计算机筛选合成抗流感病毒抗体基因,初步获得A型流感病毒通用型抗体。     

室内空调机滤尘网及空气中浮动尘螨变应原的测定

目的 检测开空调机前后室内空气中及空调机滤网灰尘中尘螨主要变应原的浓度，探讨空调机滤网中的尘螨变应原与哮喘发病的关系。 方法 采集开空调机前后哮喘患者和健康者家庭卧室空气中的灰尘及空调滤网灰尘，分别用ELISA检测其粉尘螨1组变应原（Der f 1）、屋尘螨1组变应原（Der p 1）和尘螨2组变应原（Der 2）的浓度。 结果 哮喘患者家庭空调开机前空气中Der p 1、Der f 1和Der 2的浓度分别为（0.23 ± 0.13）、（2.62 ± 1.08）和（0.93 ± 0.41） ng/m³，开机后依次为（0.56 ± 0.25）、（4.74 ± 1.22）和（2.33 ± 0.64） ng/m³，开机前后相比，三者浓度差异均有统计学意义（P<0.05）；健康者家庭空调开机前空气中Der p 1、Der f 1和Der 2的浓度分别为（0.33 ± 0.11）、 （11.5 ± 3.08）和（2.1 ± 0.8） ng/m³， 开机后分别为（0.63 ± 0.23）、 （19.8 ± 4.3）和（3.6 ± 1.0） ng/m³，开机前后相比，三者浓度差异均有统计学意义（P<0.05）。空调滤网灰尘中Der p 1、Der f 1和Der 2的浓度，哮喘患者家庭分别为（0.52 ± 0.19）、 （3.34 ± 0.63）和（2.53 ± 0.65） μg/g灰尘，健康者家庭分别为（1.30 ± 0.35）、 （5.16 ± 0.92）和（3.47 ± 1.13） μg/g灰尘。空调滤网灰尘中尘螨主要变应原浓度，健康者家庭和哮喘患者家庭的Der f 1和Der 2浓度均大于使过敏人群致敏的尘螨主要变应原浓度阈值2 μg/g 灰尘。 结论 空调滤网灰尘中存在尘螨抗原，是室内尘螨变应原的重要来源之一，是引起过敏性哮喘的诱因之一。     

噬菌体抗体库的构建及人源抗内毒素类脂A抗体的筛选

目的寻找一种治疗内毒素血症及其并发症较为有效的途径.方法从感染革兰阴性杆菌J7患者体内含有内毒素类脂A抗体的淋巴细胞中提取mRNA,经反转录再从IgG重链Fd两端及轻链通用引物分别扩增Fab基因片段,依次插入到噬菌体载体pCOMR3中,电穿孔转入大肠杆菌XL-blue,经辅助病毒VCSM13感染,重组噬菌体溶源裂解.结果Fab抗体表达于噬菌体CPⅢ的N端,噬菌体抗体库的容量为4.8×106,筛选出抗内毒素类脂A抗体,经LPS蛋白对噬菌体抗体库进行3轮淘选,使抗内毒素类脂A的特异性抗体得到100倍的富集.结论通过直接和竞争ELISA实验筛选出3株结合活性好的特异性抗体,为下一步应用研究奠定了基础.     

江西地区AR患者变应原分布情况及血清尘螨sIgE与IgG4水平的关系

目的探讨江西地区变应性鼻炎（AR）患者常见变应原分布情况及血清尘螨特异性IgE（sIgE）和IgG4水平的关系。方法对164例AR患者进行11种常见变应原皮肤点刺试验（SPT）,采用ELISA法检测血清尘螨sIgE和sIgG4。结果变应原SPT阳性率为100%（164/164例）,变应原主要为屋尘螨（65.3%）、粉尘螨（58.2%）、热带螨（36.6%）和为德国小蠊（15.5%）;引起AR的单种变应原阳性76例,2种阳性者38例,≥3种阳性者50例;AR组血清尘螨sIgE和sIgG4水平高于对照组（P均〈0.01）;尘螨变应原阳性强度与血清尘螨sIgE水平呈正相关（r=0.221 7,P〈0.05）,血清尘螨sIgE与IgG4水平呈正相关（r=0.184 3,P〈0.05）。结论屋尘螨、粉尘螨、热带螨、德国小蠊是江西地区AR患者主要的变应原。AR患者血清尘螨sIgE和IgG4水平明显升高,监测血清sIgE和IgG4水平对AR的治疗有指导意义。     

大肠癌噬菌体抗体库的构建及初步鉴定

目的 构建及初步鉴定大肠癌噬菌体抗体Fab呈现库.方法 分离大肠癌患者外周血淋巴细胞,提取淋巴细胞总RNA,逆转录成cDNA.用相应引物进行PCR,扩增出轻链和重链Fd段基因,经酶切后分别和噬粒载体pComb3连接,再经电穿孔转化大肠杆菌XLl-Blue菌株.将轻链和重链Fd基因先后克隆人pComb3中.结果 从分离出的淋巴细胞中提取到高质量RNA,RT-PCR分别扩增出约680 bp大小的κ、λ和Fd基因.PCR 产物和载体经纯化、双酶切后进行连接转化,成功地构建了人源性Fab抗体基因库,库容量达2.1×107,轻链K、κ、λ和重链Fd基因均插入pComb3的重组率为50%.结论 构建了大肠癌患者自然致敏抗体Fab段噬菌体呈现库,为筛选大肠癌相关抗体打下基础.     

人源性抗-HBc单链噬菌体抗体库的构建

目的 构建人源性单链噬菌体抗体库，为筛选人源性抗—HBc单链抗体奠定基础。方法 利用逆转录—聚合酶链反应(RT—PCR)和噬菌体表面展示技术，直接从乙肝病毒核心抗体(抗—HBc)阳性患者淋巴细胞中提取总RNA，逆转录成cDNA；合成全套人抗体可变区引物扩增抗体可变区基因，并将重、轻链可变区基因进行拼接装配成单链抗体(ScFv)基因，重组于噬菌粒载体叶pHEN1，转化抑制型大肠埃希菌E.coliTG1，以辅助噬菌体援救后，构建成人源性单链噬菌体库。结果 成功地构建了人源性抗—HBc单链噬菌体库，库容量达10^6。结论 利用RT—PCR和噬菌体表面展示技术可以成功构建人源性单链抗体库，并达到建库标准，可进一步从中筛选人源性单链抗体。     

人源性大肠癌Fab段噬菌体抗体库的筛选与鉴定

目的　通过大肠癌组织及体外培养的大肠癌细胞抗原对人源性大肠癌Fab段噬菌体抗体原始库的反复筛选 ,鉴定抗体库的特性并检测其与人大肠癌相关抗原的结合活性。方法　PCR鉴定阳性重组菌xL1 B1ue中人大肠癌相关抗体Fab段的插入率 ,构建人大肠癌Fab段原始库 ,提取 3例用于构建原始抗体库的致敏大肠癌组织抗原 ,13例非致敏大肠癌组织抗原及 3种体外培养的大肠癌细胞株Lovo、HT 2 9、LS 174T的抗原各自等体积混合 ,利用 3组混合抗原分别对原始抗体库进行 3轮筛选 ,将筛选后的三个三级库等体积混和后通过ELISA法鉴定其与人大肠癌组织及体外培养的大肠癌细胞的结合活性 ,取胃癌、食管癌及正常肠粘膜组织和体外培养的胃癌、肝癌细胞进行对照研究。结果　N片段及κ链的插入率分别为 40 %和 70 % ,Fd片段及κ链均插入质粒Pcomb3的重组率为 2 8% ,Fab段基因库库容为 2 .1× 10 6,3组大肠癌混合抗原分别对原始抗体库进行 3轮筛选后 ,抗体库均得到了不同程度的富集 ,ELISA显示富集后的Fab段抗体库对大肠癌组织及体外培养的大肠癌细胞均有较特异性的结合活性。结论　利用噬菌体抗体库技术筛选出了相关抗大肠癌Fab段抗体 ,且筛选后的抗体片段与人大肠癌相关抗原有较特异性的结合活性     

尘螨Ⅰ类变应原所致过敏性哮喘治疗的研究进展

尘螨是引起哮喘等过敏性疾病的主要气传变应原之一,其变应原种类繁多,尘螨Ⅰ类变应原是主要的致敏成分之一。本文就尘螨Ⅰ类变应原引起的螨性过敏性哮喘的发病机制、治疗及其研究进展做一综述。     

人源性大肠癌Fab段噬菌体抗体库的免疫组化鉴定

目的：鉴定基因工程抗体库技术构建的人源性大肠癌自然致敏噬菌体Fab段抗体库与人大肠癌组织及体外培养的大肠癌细胞的特异性结合活性。方法：通过免疫组化的方法检测抗体库对人大肠癌标本及体外培养的大肠癌lovo细胞的结合活性，并取绒毛状腺瘤、胃癌、食管癌及正常肠粘膜组织和体外培养的胃癌、肝癌细胞进行对照研究。结果：30例大肠癌有22例发生了阳性反应；肠息肉、胃癌、食管癌、正常肠粘膜各取20例，发生阳性反应的分别为13例、5例、4例和1例，体外培养的胃癌、肝癌细胞未发生阳性反应。结论：大肠癌噬菌体抗体库能较特异性地与人大肠癌组织及体外培养的大肠癌细胞结合。     

Influence of House Dust Mite Impermeable Covers on Health-Related Quality of Life of Adult Patients with Asthma: Results of a Randomized Clinical Trial

The aim of this study was to evaluate the effect of house dust mite impermeable covers on asthma-specific health-related quality of life in adult asthmatic patients that were trained in guided self-management. In a 2-year randomized placebo-controlled clinical trial, information on the quality of life was collected. The improvement of Mini Asthma Quality of Life Questionnaire (AQLQ) score in the allergens-avoidance group (0.26) was comparable to the improvement in the placebo group (0.30) and not significant. HDM-impermeable covers for pillows, duvets, and mattresses did not result in improved health-related quality of life.     

人源性抗结核分枝杆菌噬菌体展示单链抗体文库的构建

目的 构建人源抗结核分枝杆菌噬菌体展示单链抗体文库,为结核特异性单链抗体的筛选奠定基础. 方法 从抗结核分枝杆菌抗体阳性患者淋巴细胞中提取总RNA,逆转录成cDNA,PCR扩增获得抗体的重、轻链可变区基因,然后拼接装配成单链抗体基因,重组于噬菌粒载体pCANTAB5S,转化大肠埃希菌E.coli TG1,以辅助噬菌体拯救后,构建人源性抗结核分枝杆菌噬菌体展示单链抗体库. 结果 成功构建人源性抗结核分枝杆菌噬菌体展示单链抗体文库,库容量达107. 结论 以结核患者淋巴细胞免疫球蛋白可变区基因片段和噬菌粒展示载体pCANTAB5S为基础,成功构建人源性抗结核分枝杆菌噬菌体展示单链抗体库,并达到建库标准,可进一步从中筛选获得结核特异性单链抗体.     

尘螨1类嵌合变应原TAT-IhC-R8的致敏效果分析

目的探讨尘螨1类嵌合变应原TAT-Ih C-R8的致敏效果。方法将40只BALB/c小鼠随机分为PBS对照组(PBS组)、OVA致敏组(OVA组)、R8致敏组(R8组)和TAT-Ih C-R8致敏组(TIR8组)4组,每组10只。上述3个致敏组分别用OVA、R8和TAT-Ih C-R8于第0、7、14天进行腹腔注射致敏(剂量为10μg/ml);自第21天起,分别用上述致敏液(剂量为10μg/ml)雾化吸入30 min,连续7 d。PBS组则用PBS进行腹腔注射和雾化吸入。最后一次雾化吸入24 h后将小鼠脱臼处死,分别收集支气管肺泡灌洗液(BLAFs)和血清,并进行脾细胞培养。以ELISA法检测BALFs及脾细胞培养上清液(SCSs)中细胞因子IFN-γ和IL-13水平,以及血清中特异性抗体Ig E(s Ig E)、Ig G1和Ig G2a水平;并对BALF进行白细胞和嗜酸性粒细胞(EOS)计数。此外,制作小鼠肺组织病理切片,经HE染色后进行观察。结果与PBS组相比,OVA、R8组和TIR8组小鼠肺部炎症均明显,表现为肺组织炎性细胞浸润、支气管上皮细胞部分断裂及脱落、血管炎等,而PBS组小鼠未见明显病理改变。TIR8组小鼠BALF中白细胞总数和EOS数均显著高于OVA组和R8组(P均0.01),其BALF及SCSs中IL-13水平亦明显高于OVA组和R8组(P均0.01),但IFN-γ含量则显著低于该两组(P均0.01)。TIR8组小鼠血清s Ig E和Ig G1抗体水平明显高于OVA组和R8组(P均0.01),但其Ig G2a抗体水平则显著低于该两组(P均0.01)。结论TAT-Ih C-R8可有效激发小鼠肺部炎症,且其致敏效果明显优于R8。