布鲁氏菌和幽门螺杆菌等6种病原菌16S rRNA和cagA等基因的克隆与鉴定

目的克隆并鉴定布鲁氏菌的16SrRNA、支原体的16SrRNA、泰泽氏菌的16SrRNA、空肠弯曲菌的flaA、肝螺杆菌的flaB和幽门螺杆菌的cagA基因,为建立实时荧光定量PCR检测方法作准备。方法设计、合成布鲁氏菌的16SrRNA、支原体的16SrRNA、泰泽氏菌的16SrRNA、空肠弯曲菌flaA、肝螺杆菌flaB和幽门螺杆菌的cagA基因的特异性引物;PCR扩增、克隆16SrRNA、flaA、flaB和cagA基因;对重组质粒进行酶切鉴定、PCR鉴定和测序分析。结果布鲁氏菌的16SrRNA、支原体的16SrRNA、泰泽氏菌的16SrRNA、空肠弯曲杆菌的flaA、肝螺杆菌的flaB和幽门螺杆菌的ca-gA基因PCR扩增产物分别在612bp、600bp、922bp、637bp、1545bp和1168bp处出现特异性目的条带,结果均与预期扩增的目的片段大小一致。将PCR产物分别与pMD18-T载体连接并转化感受态细菌大肠埃希菌JM109。对重组质粒pT-BC16SrRNA、pT-MP16SrRNA、pT-CP16SrRNA、pT-CJflaA、pT-HHflaB和pT-HPcagA分别进行酶切鉴定及PCR鉴定,结果均可见特异性目的条带。测序结果显示,布鲁氏菌的16SrRNA、支原体的16SrRNA、泰泽氏菌的16SrRNA、空肠弯曲菌的flaA、肝螺杆菌的flaB和幽门螺杆菌的cagA基因序列与GenBank中细菌相应序列同源性高达100%,说明上述6种致病菌的16SrRNA、flaA、flaB和cagA基因已成功克隆。结论成功克隆了布鲁氏菌16SrRNA、支原体的16SrRNA、泰泽氏菌的16SrRNA、空肠弯曲菌的flaA、肝螺杆菌的flaB和幽门螺杆菌的cagA基因,为建立实时荧光定量PCR检测方法奠定了基础。     

空肠弯曲菌hipO基因的Real-time PCR检测研究

目的建立基于新型Taqman荧光探针的荧光实时(Real-time)PCR方法用于空肠弯曲菌的筛选检测与快速鉴定。空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)是近十几年来在世界范围内广泛重视的人畜共患病原菌,可以导致人类的急性肠炎与食物中毒,并能引发格林-巴利综合征等并发症。为更好地利用分子生物学技术对空肠弯曲菌进行快速、准确的基因检测,本研究从样品增菌液与单菌落中提取细菌DNA,建立了针对空肠弯曲菌特异的hipO(hippuricase,马尿酸酶)基因的Real-time PCR方法,用于空肠弯曲菌的快速筛选检测与可疑菌落快速鉴定。试验结果表明,该方法检测细菌的灵敏度为1~10CFU,人工布菌鸡肉的检测灵敏度为1~10CFU。本研究所建立的空肠弯曲菌荧光实时PCR方法具有准确、可靠、快速的特点。     

胎儿弯曲菌PCR检测方法的建立及其初步应用

目的 建立胎儿弯曲菌PCR快速检测方法。方法 以胎儿弯曲菌表面蛋白基因sapB2为靶基因,应用软件设计特异性引物,通过反应条件的优化,引物敏感性、特异性和灵敏度的试验以及模拟污染样品的检测,建立胎儿弯曲菌PCR快速检测方法并应用于临床样品检测。结果 该研究建立的PCR方法能特异性扩增胎儿弯曲菌sapB2(789 bp)基因片段,空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、唾液弯曲菌和豚肠弯曲菌以及其他17株参考菌如大肠杆菌、沙门菌等均未扩增出条带;胎儿弯曲菌纯培养物最低可检出0.23 pg/μL的DNA,模拟感染样品污水和奶牛粪便样品中胎儿弯曲菌的最低检出量分别为0.9 CFU/mL和20 CFU/g;临床样品检测中,400份奶牛肛门擦拭样品和125份产妇阴道擦拭样品的PCR检测结果均为胎儿弯曲菌阴性,与传统的平板分离方法同步检测结果一致。结论 所建立的胎儿弯曲菌PCR检测方法具有特异性强、敏感度高、简便快速等特点,为胎儿弯曲菌的快速检测提供了技术支持,对识别该菌株的暴发流行,相关疾病的诊断和控制具有重要意义。     

变性高效液相色谱检测空肠弯曲菌

目的应用多重PCR反应(multiplex PCR,mPCR)结合变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)技术建立食品中空肠弯曲菌的快速检测方法。方法以编码嗜热弯曲菌属的16S rRNA基因、编码空肠弯曲菌的gyrA基因为靶基因,选择2对引物,建立并优化了鉴别空肠弯曲菌的多重PCR体系,扩增产物分别为287bp、159 bp。采用22株细菌验证了该多重PCR具有特异性。PCR检测的灵敏度在DNA水平上达到10 pg/μL;在人工模拟污染样品起始污染浓度为1.5个/mL时,42℃微需氧条件下培养24 h可被检出。结果在随机采集的172份冷冻鸡肉类样品中,检出了18份样品为空肠弯曲菌阳性。结论本研究建立的多重PCR-DHPLC方法可特异、灵敏地实现对空肠弯曲菌的快速检测。     

动物及其产品中空肠弯曲菌PCR检测方法的建立

目的建立快速检测空肠弯曲菌的PCR方法。方法从鸡猪样品中分离培养获得空肠弯曲菌,以该菌特异的VS1基因保守序列为模板自行设计引物,扩增产物为516bp片段,同时进行特异性、灵敏度试验。结果显示该方法只对空肠弯曲菌有扩增产物出现,而其它细菌如大肠杆菌、沙门氏菌、无乳链球菌、粪链球菌、金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌ATCC、腐生葡萄球菌等均不能扩增出特异性片段,检测灵敏度达6 CFU/ml。结论该方法具有灵敏、高效、特异、稳定的特点。     

均匀设计法在实时定量PCR检测条件优化中的应用研究

目的探索均匀设计在优化实时定量PCR检测条件中的应用,确立心钠素基因实时定量的最佳条件。方法以乳鼠心肌细胞cDNA为模板,退火温度和引物浓度为影响因素,应用均匀设计法探索影响心钠素基因实时荧光定量PCR的扩增条件;量化不同实验条件下的扩增效果,在最优的扩增条件下建立ANP基因定量扩增的相对标准曲线,并检测扩增效率。结果通过均匀设计法的试验设计,用8个试验点,完成了对温度和引物浓度2因素8水平的实验条件优化,建立了ANP基因实时定量PCR检测的最佳组合,为退火温度59.2℃、引物终浓度200μM。结论均匀设计是一种简便易行、快速经济的实时定量PCR检测条件的优化方法。     

TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测布鲁氏菌

目的利用新一代TaqMan MGB探针技术,建立特异敏感的实时荧光定量PCR方法,用于布鲁氏菌的快速检测。方法针对布鲁氏菌基因组中16SrRNA序列设计特异性引物和探针,建立一套基于TaqMan MGB探针技术的实时荧光定量PCR方法,验证方法的特异性、敏感性和稳定性,对2008-2010年期间采集的773份动物样本中的布鲁氏菌进行检测,并与普通PCR方法进行比较分析。结果建立的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法对布鲁氏菌的检测具有高度的特异性,对小肠结肠耶尔森菌、假结核耶尔森菌、肠炎沙门氏菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、空肠弯曲菌、泰泽氏菌均无交叉反应。生成的标准曲线的相关系数为0.999,斜率为-3.301,TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR效率为100.872%。TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR能够准确地从布鲁氏菌阳性样本中检测到布鲁氏菌DNA,最低能够检测到的布鲁氏菌数量为9.3拷贝,比常规PCR方法的灵敏度高100倍。对773份动物样本进行检测,结果TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR能检出53份布鲁氏菌阳性样本,而常规PCR只检出37份阳性。结果显示,TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法比常规PCR方法更敏感,能够直接从动物样本中检出布鲁氏菌DNA,检测时间仅为2h。结论本研究首次建立了直接用于检测动物样本中布鲁氏菌的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法,该技术适用于传染性病原体的快速检测与鉴定。     

应用实时荧光PCR技术检测空肠弯曲菌

目的应用实时荧光PCR技术建立一种特异、敏感的空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)检测方法。方法通过对空肠弯曲菌基因组的保守序列进行分析来设计引物及Taqman探针来实现对空肠弯曲菌的检测。结果该方法具有较强的灵敏性及特异性能够对空肠弯曲菌进行有效的检测,其对空肠弯曲菌增菌液的最低检出限为5CFU/ml而对实际样品的检测限为10CFU/g。结论该方法无需增菌培养过程能够直接对样品进行检验,较常规的生化检测方法省时省力,具有较强的实际应用价值。     

TaqMan探针实时荧光定量PCR快速检测土拉弗朗西斯菌

目的 建立TaqMan探针实时荧光定量PCR方法(FQ-PCR),快速检测土拉弗朗西斯菌。方法 针对土拉弗朗西斯菌的外膜蛋白fopA基因,利用Primer 5.0设计引物及TaqMan探针,人工合成fopA基因保守片段,克隆到载体作为阳性标准品,进行荧光定量检测,制作定量标准曲线,并以合成fopA基因为模板,PF、PR 为引物,研究其灵敏度、特异性和准确性。结果 构建了含fopA基因的重组质粒,以不同浓度的重组质粒制作标准曲线,在103~107拷贝数之间有较好的线性关系。灵敏度试验表明,该方法可检测到30.6个拷贝数的重组质粒,比普通PCR灵敏度高;特异性试验表明,能选择性检测土拉弗朗西斯菌,而与其他病原菌无交叉反应,与普通菌落PCR结果一致;重复性试验表明,拷贝数为3.06×106样品5次平行试验,标准差为0.201,变异系数为0.88%。结论 本研究建立了TaqMan探针FQ-PCR快速检测技术,具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点,可用于快速、实时、定量检测土拉弗朗西斯菌,为快速检测生物战剂级微生物建立了一种人工合成特异基因TaqMan探针实时荧光定量PCR新方法。     

空肠弯曲杆菌LAMP检测方法的建立及初步应用

目的 建立一种灵敏的环介导等温扩增方法（Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP）用于空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)的快速检测。方法：根据已公布的空肠弯曲杆菌旋转酶基因（gyrA）设计引物,建立并优化LAMP反应体系,对检测方法的特异性和灵敏度进行验证,并运用该方法对我国不同地方鸡种空肠弯曲杆菌的携带率进行调查。结果 该方法能扩增出典型的梯形条带,且扩增产物的酶切鉴定结果与理论值相符;对单增李斯特菌等8株实验菌株进行检测,仅空肠弯曲杆菌的LAMP结果为阳性;该方法检测空肠弯曲杆菌纯培养物的灵敏度为20cfu／mL,高于常规PCR检测方法10倍;不同地方鸡种空肠弯曲杆菌携带率介于6%～90%之间,差异显著。结论 本试验建立的空肠弯曲杆菌LAMP检测方法特异性强、灵敏度高,有望在临床样品检测中发挥作用。     

Evaluation of a cytolethal distending toxin (cdt) gene-based species-specific multiplex PCR assay for the identification of Campylobacter strains isolated from diarrheal patients in Japan

We have developed a cytolethal distending toxin (cdt) gene-based species-specific multiplex PCR assay for the detection and identification of Campylobacter jejuni, C. coli, and C. fetus. The applicability of this assay was evaluated with 325 Campylobacter strains isolated from diarrheal patients in Japan and the results were compared with those obtained by other genetic methods, including hipO gene detection and 16S rRNA gene sequencing. Of the 325 strains analyzed, 314 and 11 were identified as C. jejuni and C. coli, respectively, by combination of hipO gene detection and 16S rRNA gene sequencing. When the multiplex PCR assay was employed, 309, 310, and 314 strains were identified as C. jejuni on the basis of cdtA, cdtB, and cdtC gene-specific primers, respectively. Similarly, 11, 11, and 10 strains were identified as C. coli on the basis of cdtA, cdtB, and cdtC gene-specific primers, respectively. Sequence analysis of the cdt gene region of 6 strains (5 C. jejuni and 1 C. coli) which did not yield specific PCR products in any of the cdt gene-based multiplex PCR assays revealed deletions or mutations of the cdt genes. Pulsed-field gel electrophoresis indicated that C. jejuni and C. coli strains were genetically diverse. Taken together, these findings suggest that the cdtC gene-based multiplex PCR seems to be a particularly simple and rapid method for differentiating between species of Campylobacter strains, such as C. jejuni and C. coli. However, combination of these multiplex PCR assays will allow more accurate identification.     

TaqMan探针实时荧光PCR方法检测粪便中微小隐孢子虫卵囊

以微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)特异性DnaJ-like蛋白基因的保守序列为模板,设计和合成特异性引物和荧光标记探针,通过检测微小隐孢子虫卵囊DNA和加标模拟样品进行敏感性分析,建立标准曲线,并对其特异性和干扰性进行评价。结果显示,该方法只对微小隐孢子虫卵囊进行特异性扩增,其他常见的肠道原虫和肠道病原菌均不能扩增;微小隐孢子虫纯卵囊基因组DNA检测的灵敏度为26个/ml;对加标粪样可检测至2 600个/ml卵囊。提示本研究建立的实时荧光PCR检测微小隐孢子虫卵囊方法具有快速、特异性和敏感性高等优点。     

一种莱姆病螺旋体real-time PCR方法的建立及其在鼠标本检测中的应用评价

目的 基于莱姆病螺旋体recA 基因,建立一种检测鼠中莱姆病螺旋体的real-time PCR方法。方法 通过GenBank分析比较莱姆病螺旋体recA 基因,选择其保守序列设计MGB探针及引物并进行方法学评估。并应用建立的real-time PCR方法和nested PCR方法对收集的123份鼠标本进行检测分析。结果 本研究建立的real-time PCR方法仅对莱姆病螺旋体检测阳性,其最小检出浓度为10¹ copies/μL。标准曲线各浓度点Ct值批内、批间平均变异系数(CV)分别为1.56%和2.30%。123份鼠标本中,real-time PCR检测59例阳性,nested PCR检测43例阳性。结论 新建立的real-time PCR方法具有快速、敏感和特异的优点,可用于鼠标本中莱姆病螺旋体的检测。     

实时荧光定量PCR法检测日本血吸虫

目的 运用实时荧光定量PCR法检测日本血吸虫。 方法 根据日本血吸虫18 S小亚基单位核糖体核酸（18S rRNA）基因设计特异性引物,PCR扩增出1 450 bp序列,经TA克隆后转入大肠埃希菌DH5α,提取重组质粒,鉴定后作为模板制作荧光定量PCR 标准曲线。方法重现性评价,用初始循环数（Ct,拷贝/反应）进行标准差分析,并计算变异系数（CV）。 结果 制作的标准曲线循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.998 7。方法重现性评价,在1.05×107～1.05×103个拷贝范围内,对应的Ct平均值分别为17.55、20.93、24.32、27.59和30.95;CV值分别为1.31%、1.53%、0.90%、1.85%及0.90%,在重复性试验中试验间数据平均变异系数为1.27%,无非特异性扩增。 在试验检测范围内（Ct≤30.95）,可检测的日本血吸虫基因组浓度为6.15 pg,3 h内完成。 结论 运用荧光定量PCR方法检测日本血吸虫DNA,快速、灵敏、特异性高。     

Study of real-time PCR assays for rapid detection of food-borne pathogens

A duplex real-time SYBR Green LightCycler PCR (LC-PCR) assay with DNA extraction using QIAamp DNA Stool Minikit was evaluated for detection of 8 of 19 species of food-borne pathogens, including Plesiomonas shigelloides, Providencia alcalifaciens, in five stool specimens. The time frame was within 2h or less. The protocol used the same LC-PCR with 22 pairs of specific primers. The rapid amplification and reliable detection of specific genes were determined by this LC-PCR assay from 10 cases of food-borne outbreaks in Shimane Prefecture from 2002 to 2005. These cases included Campylobacter jejuni (4), Clostridium perfringens (2), enteropathogenic Escherichia coli and astA positive E. coli (1), and astA positive E. coli, enterohemorrhagic E. coli 026, and Bacillus cereus (1 each). Rapid amplification and reliable detection of specific genes of food-or water-borne pathogenic bacteria in fecal samples should facilitate the diagnosis and management of food-borne outbreaks.     

基于TaqMan探针的猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒实时荧光定量PCR方法的建立

目的 建立一种能检测猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒（PRRSV）的TaqMan探针荧光定量PCR方法。方法 根据PRRSV的ORF7基因保守区的核苷酸序列设计引物和TaqMan探针,通过探针浓度的优化,建立检测PRRSV的TaqMan探针荧光定量PCR方法。用该方法对30份临床疑似病料进行检测, 并与常规RT-PCR方法和病毒分离方法进行比较。结果 TaqMan荧光PCR检测PRRSV的最佳探针浓度为0.4μmol,检测灵敏度可达3.51拷贝/μl。检测的30份样品与病毒分离结果的符合率为100%,与普通PCR的检测结果（25/30）比较,本方法对临床样品的检出率（28/30）更高。结论 建立的方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于临床样品的检测。