淋球菌MlaA重组蛋白表达及多克隆抗体的制备与应用

目的 原核表达、纯化淋球菌MlaA蛋白,制备并鉴定其多克隆抗体。方法 构建原核表达载体pET-28a-MlaA,转化BL21(DE3)大肠埃希菌,经IPTG诱导重组蛋白的表达。通过亲和层析法纯化目的蛋白,并进行Western blot鉴定。以纯化的重组蛋白作为抗原,与佐剂乳化后免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,3次免疫后取小鼠静脉血并分离血清,采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定抗体效价,用Western blot、间接免疫荧光试验(IFA)和流式细胞术(FCM)检测MlaA多克隆抗体的反应性和特异性。结果 Western blot显示,pET-28a-MlaA转化BL21后表达相对分子质量为35×10³的淋球菌MlaA重组蛋白。ELISA检测MlaA免疫小鼠血清抗体效价为1∶8 000～1∶32 000。Western blot、IFA和流式细胞术检测制备的抗体能识别淋球菌变性和非变性MlaA蛋白。结论 成功表达并纯化淋球菌MlaA重组蛋白,免疫小鼠制备多克隆抗体,将制备的抗体血清作为一抗对淋球菌及其他不同类菌株进行Western Blot检测后发现,制备的多克隆...     

轮状病毒NSP4基因在非复制型腺病毒载体中的表达及免疫活性

目的:研究以非复制型重组腺病毒表达人轮状病毒NSP4基因作为新型轮状病毒基因疫苗的可行性．方法:用AdEasy系统构建表达NSP4蛋白的重组腺病毒,并通过形态学观察、PCR、RT- PCR、Southern blot和Western blot等对重组腺病毒进行鉴定．通过滴鼻途径免疫♀小鼠,对免疫后母鼠生产的乳鼠(4日龄)用SA11株轮状病毒灌胃攻击,观察腹泻的产生情况并进行腹泻评级．结果:获得了重组腺病毒rvAdEasyNSP4． Southern blot表明,在重组腺病毒中确有特异性的NSP4基因整合,Western blot证明,目的蛋白得到表达．初次免疫小鼠后血清IgG抗体的滴度可达1:1 000,但阳转率仅为28．5％;再次免疫后,血清抗体阳转率达到了85．7％;第3次免疫后,血清抗体阳转率达到100%．血清IgA 阳转率可以达到71．4％．实验组乳鼠攻毒后腹泻的百分率和腹泻评分(反应腹泻严重程度) 均较对照组低．结论:腺病毒载体可有效表达轮状病毒非结构蛋白NSP4并可有效诱导小鼠免疫反应,这些结果的取得为新型轮状病毒疫苗的研制提供了依据．     

弓形虫GRA4基因体外扩增、克隆及在耻垢分枝杆菌中的表达

目的体外扩增弓形虫RH株致密颗粒蛋白4（GRA4）基因，构建大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒ps3000-GRA4，重组耻垢分枝杆菌，鉴定重组蛋白的抗原性。方法用聚合酶链式反应（PCR）方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增GRA4基因，克隆入pGEM-T载体，然后亚克隆法构建ps3000-GRA4大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒，经电转化方法，将GRA4基因片断的穿梭质粒转化到耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis mc^2155）中，用重组耻垢分枝杆菌免疫小鼠，Western blot方法检测免疫小鼠血清中的弓形虫抗体。结果成功扩增了弓形虫的GRA4基因并构建克隆质粒pGEMT-GRA4、穿梭质粒ps3000-GRA4，Western blot分析显示，GRA4重组蛋白能被重组质粒免疫小鼠血清识别，分子质量单位约为40．0ku。结论重组耻垢分枝杆菌在小鼠体内表达出了重组蛋白GRA4，具有抗原性，刺激小鼠机体产生了抗弓形虫的抗体，为弓形虫重组BCG（Bacillus Calmette-Guerin）疫苗的研究奠定了基础。     

旋毛虫抗原基因Ts21的原核表达与重组蛋白鉴定

目的 原核表达旋毛虫相对分子质量（Mr）21 000抗原基因（Ts21）并对重组蛋白进行纯化和抗原性鉴定。 方法 将旋毛虫抗原基因Ts21亚克隆入原核表达载体pMAL-c2X，构建重组表达质粒pMAL-c2X-Ts21，经酶切鉴定正确后转化大肠埃希菌TB1，以异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。亲和层析法纯化表达产物。应用十二烷基磺酸钠?鄄聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹（Western blotting）分析鉴定重组蛋白的抗原性。将重组蛋白免疫小鼠制备免疫血清，ELISA检测抗体滴度，免疫荧光检测（IFA）确定Ts21蛋白在肌幼虫体内的分布。 结果 SDS-PAGE结果显示，表达产物为Mr 63 500的重组融合蛋白，IPTG诱导4 h后表达量最大，薄层凝胶光密度扫描显示表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的18.2%。Western blotting结果显示该重组蛋白可被旋毛虫、纳氏旋毛虫感染小鼠血清及旋毛虫病患者血清识别，但不能被乡土旋毛虫、布氏旋毛虫及伪旋毛虫感染小鼠血清识别；与钩虫病、囊尾蚴病、日本血吸虫病患者血清无交叉反应，但与并殖吸虫病、华支睾吸虫病及棘球蚴病患者血清有交叉反应。重组蛋白免疫小鼠可产生高滴度的血清抗体，IFA显示Ts21蛋白主要分布于肌幼虫体壁。 结论 成功制备了旋毛虫Ts21基因的重组蛋白，该蛋白具有较好的抗原性。     

重组SARS病毒M蛋白的免疫效应研究

目的 检测SARS冠状病毒重组M蛋白疫苗诱导小鼠的免疫应答能力。方法 PCR扩增M蛋白基因，构建至原核表达质粒pET-23a，pET-23a-M重组质粒转化BL21（DE3）宿主菌，诱导表达蛋白经SDSPAGE、免疫印迹分析和纯化后免疫BALB／c小鼠，3次免疫后测定免疫功能，进行免疫效果评价。结果 成功构建pET-23a—M重组质粒，转化宿主菌后诱导表达27kuM蛋白。检测M蛋白免疫鼠体内有特异性抗体产生，抗体效价达1，10^4；脾脏CD8^＋比例升高，CD4^＋／CD8^＋比值下降；免疫鼠血清IFN-y／和IL-4水平无显著变化。结论 SARS病毒重组M蛋白疫苗能诱导BAI。B／c小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫应答。     

犬瘟热病毒M蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的对犬瘟热病毒(CDV)弱毒株M基因进行克隆及原核表达,并制备鼠抗CDV M蛋白多克隆抗体。方法针对犬瘟热病毒弱毒株(CDV-LP)的M基因序列设计引物,用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增目的基因片段,扩增产物克隆至表达载体pET-30a(+)并转化至宿主菌BL21(DE3),在0.4mmol/L IPTG和37℃条件下诱导表达目的蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化后进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。以纯化的M蛋白免疫BALB/c小鼠,经3次免疫后采血,分离血清,制备鼠抗CDV M蛋白多克隆抗体。结果通过RT-PCR成功扩增出大小为1 014bp的CDV M基因,构建的重组质粒pET-30a(+)-M在大肠埃希菌中诱导表达出分子质量单位为43ku的重组M蛋白,与预期值相符;重组蛋白主要以包涵体形式表达,Western blot检测显示M重组蛋白能被抗CDV多克隆抗体识别;免疫小鼠制备的多抗能与纯化的重组蛋白发生特异性反应。结论本研究成功构建了pET-30a(+)-M并表达了CDV M蛋白,制备了鼠多克隆抗体,为建立CDV M蛋白的ELISA抗原检测方法,鉴定表达M蛋白的重组杆状病毒奠定了基础。     

EB病毒融合基因Z2A重组BCG的免疫学特性研究北大核心CSCD

目的对EB病毒融合基因Z2A构建的重组BCG进行鉴定及免疫学研究。方法采用Western blot方法检测重组BCG中Z2A基因的表达;用重组BCG免疫小鼠,用ELISA方法检测小鼠血清特异性抗体水平,采用乳酸脱氢酶法检测小鼠的细胞免疫水平,评价重组BCG的免疫效果。结果重组BCG表达的蛋白能被血清BZLF1抗体(或LMP2A抗体)识别;ELISA检测表明,重组BCG能刺激机体产生抗体,当重组BCG细菌数为5×108个/只时,抗体滴度最高为17 600(186.5±6.7pg/ml);BCG对照组及PBS对照组对GT39细胞的杀伤率分别为(32.5±2.7)%和(22.8±2.3)%,重组BCG组为(62.7±6.2)%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 EB病毒融合基因Z2A重组BCG免疫效果良好,能刺激小鼠产生体液免疫和细胞免疫反应。     

细粒棘球蚴铁蛋白基因的克隆重组高效表达及免疫学初步研究

目的构建细粒棘球蚴（Echinococcus granulosusEg）铁蛋白（ferritin）基因的原核表达重组质粒并表达、纯化该重组蛋白，初步研究其免疫反应。方法将细粒棘球蚴铁蛋白基因亚克隆于表达载体pGEX-6p-1，转化重组体到大肠杆菌B121中，在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导下表达；用SD争PAGE和Western—blot对表达产物进行初步鉴定，用切胶纯化的融合蛋白免疫BALB／c小鼠，通过Western-blot对该蛋白的免疫学特性进行初步研究。结果重组铁蛋白与GST以融合表达的形式在细菌中高效表达，表达产物为不可溶性的包涵体，蛋白分子量约为42kD。融合蛋白Egferritin／GST能被细粒棘球蚴免疫的家兔血清和特异性小鼠抗血清所识别，同时特异性小鼠抗血清可识别天然抗原囊液、原头蚴可溶性蛋白中约19kD的蛋白条带。结论成功地表达细粒棘球蚴重组铁蛋白，并且该蛋白有一定的免疫原性及抗原性。     

EB病毒融合基因Z2A重组BCG的免疫学特性研究

目的对EB病毒融合基因Z2A构建的重组BCG进行鉴定及免疫学研究。方法采用Westernblot方法检测重组BCG中Z2A基因的表达;用重组BCG免疫小鼠,用ELIsA方法检测小鼠血清特异性抗体水平,采用乳酸脱氢酶法检测小鼠的细胞免疫水平,评价重组BCG的免疫效果。结果重组BCG表达的蛋白能被血清BZLFl抗体（或LMP2A抗体）识别;ELISA检测表明,重组BCG能刺激机体产生抗体,当重组BCG细菌数为5×10-8个／只时,抗体滴度最高为17600（186．5±6．7Pg／ml）;BCG对照组及PBS对照组对GT39细胞的杀伤率分别为（32．5±2．7）％和（22．8±2．3）％,重组BCG组为（62．7±6．2）％,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论EB病毒融合基因Z2A重组BCG免疫效果良好,能刺激小鼠产生体液免疫和细胞免疫反应。     

细粒棘球蚴亲肌肉抗原在小鼠中的免疫保护力研究

目的 对细粒棘球蚴亲肌肉抗原(myophilin antigen)进行原核表达、纯化并用小鼠实验评价其免疫学特性. 方法 提取总RNA,构建克隆质粒Eg myophilin/pGEM-T,然后将亲肌肉抗原基因亚克隆于表达载体pET28a,进行诱导表达;纯化重组蛋白并免疫小鼠.利用Western blot、ELISA鉴定其免疫学特性,并通过包囊计数,评价其免疫保护力. 结果 成功构建原核重组表达载体Eg myophilin/pET28a,并表达、纯化出浓度较高的亲肌肉抗原.ELISA检测显示,用纯化的亲肌肉抗原免疫小鼠,诱导产生了特异性抗体;Western blot鉴定该抗体能识别重组抗原及原头蚴.攻击感染实验表明亲肌肉抗原免疫小鼠的包囊数为0.93±2.1,对照组为7.13±10.21,两者差异有统计学意义,获得的保护力约为94.4%. 结论 成功表达细粒棘球蚴亲肌肉抗原,纯化后的重组蛋白具有抗原性和免疫原性,有望作为棘球蚴病疫苗候选分子.     

SARS-CoV-2重组痘苗病毒载体疫苗的构建、筛选、安全性和免疫原性研究

目的 利用穿梭质粒通过同源重组构建表达SARS-CoV-2 RBDEPI蛋白重组痘苗病毒,并对其进行筛选、鉴定和免疫原性检测。方法 参照SARS-CoV-2全基因组序列设计合成目的基因RBDEPI,通过PCR、测序、酶切连接将目的基因插入到痘苗病毒穿梭载体pSTKE中,构建pSTKE-RBDEP。将pSTKE-RBDEPI与天坛株痘苗病毒VTT共转染鼠肾细胞BHK-21中,通过同源重组,并以增强型绿色荧光蛋白EGFP为筛选标记,通过多次绿色荧光噬斑筛选获得重组病毒rVTT△TK-RBDEPI。利用RT-PCR和Western blot检测rVTT△TK-RBDEPI目的基因的转录和目的蛋白的表达情况;通过ELISA和ELISPOT检测rVTT△TK-RBDEPI免疫小鼠SARS-CoV-2与痘苗病毒载体特异性抗体水平和特异性淋巴细胞IL-4与IFN-γ的表达情况,确定rVTT△TK-RBDEPI的免疫原性。结果 经过10次绿色荧光噬斑筛选、RT-PCR与Western blot鉴定获得1株能够表达SARS-CoV-2 RBDEPI的重组痘苗病毒rVTT△TK-RBDEPI,且rVTT△...     

2型猪链球菌细胞分裂蛋白GpsB的原核表达及其鉴定

目的 利用原核表达系统诱导表达2型猪链球菌(Streptococcus suis 2,S.suis 2)分裂相关因子GpsB重组蛋白,为后续研究奠定基础。方法 以S. suis 2菌株05ZYH33全基因组DNA为模板,经PCR扩增得到目的基因片段。目的基因经双酶切后连接至表达载体pET32a,转化大肠杆菌(Escherichia coli, E. coli)DH5α感受态细胞。重组质粒经测序鉴定正确后转化E. coli BL21感受态细胞。获得的重组表达菌经IPTG诱导表达目的蛋白。利用Ni离子亲和层析柱纯化重组蛋白,并进行SDS-PAGE和Western blot 鉴定。利用重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。结果 成功构建出重组表达载体pET32a^gpsB,并经IPTG诱导表达出目的蛋白。重组蛋白主要存在于表达菌裂解液上清中,分子质量约30 kD,与预期大小一致。Western blot 检测发现,该蛋白能被His-Tag 单克隆抗体特异性识别。制备的多克隆抗体能特异性识别重组GpsB蛋白(rGpsB)。结论 成功表达和纯化了rGpsB并获得了该蛋白的多克隆抗体,为进一步研究该蛋白在S.suis 2 分裂过程中的作用鉴定了基础。     

MERS-CoV S1蛋白的表达及鉴定

目的真核表达具有天然构象的中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)S1蛋白,并进行免疫反应性鉴定。方法以pcDNA3.1-S重组质粒为模板,PCR扩增S1基因,连接至pFastBac1质粒,构建重组质粒pFB1-S1。将pFB1-S1转化至DH10Bac感受态中,构建重组杆粒BpFB1-S1,然后转染sf9细胞获得重组杆状病毒rpFB1-S1并连续传代。将第四代rpFB1-S1接种sf9细胞后悬浮培养96h,取上清,用PEG8000浓缩并进行免疫亲和层析纯化,采用SDS-PAGE和Western blot鉴定其分子质量及免疫反应性;另取感染rpFB1-S1 48h的sf9细胞进行IFA鉴定。结果 S1基因PCR扩增产物大小为2 212bp,与预期相符。重组质粒pFB1-S1经酶切和测序分析鉴定构建正确。重组杆粒BpFB1-S1经PCR鉴定构建正确。IFA试验可见感染rpFB1-S1的sf9细胞出现特异性绿色荧光,即有目的蛋白表达。SDSPAGE显示纯化的重组S1为单一100×103(Mr)蛋白条带,Western blot检测该蛋白能被鼠抗S-RBD蛋白单克隆抗体识别。结论成功表达了具有免疫反应性的MERS-CoV S1蛋白,为MERS-CoV快速诊断方法的建立及候选疫苗的构建奠定了基础。     

流感病毒HA球状头部结构域在昆虫杆状病毒表达系统的表达及鉴定

目的通过昆虫杆状病毒表达系统获得具有良好免疫原性的流感病毒蛋白。方法将Hemagglutinin [Influenza A virus (A/California/09/2009(H1N1))进行截短,取57-271球状头部结构域氨基酸序列,在前面加Igκleader信号肽(METDTLLLWVLLLWVPGSTGD),设计H1HAHead基因。将基因序列按照昆虫细胞密码子偏好性进行优化、合成,通过EcoRI和HindIII双酶切克隆至pFastBAC HTA载体上,获得含有目的基因的重组质粒pFastBAC HTA-H1HAHead。利用热激法将重组质粒转化至大肠埃希菌DH10 Bac~(TM)感受态细胞,蓝白斑筛选获得重组杆状质粒rBacmid-H1HAHead。在脂质体的介导下,将重组杆状质粒转染至SF9细胞,对病毒进行拯救,转染后120 h,收取上清病毒液,盲传3代,获得SF9细胞,运用间接免疫荧光法(IFA)和Western blot检测目的蛋白的表达。结果经双酶切鉴定成功插入长度为762 bp的目的基因H1HAHead,通过脂质体介导长度为3 192 bp的重组杆状质粒rBacmid-H1HAHead构建成功。杆状病毒系统可表达目的蛋白,其分子质量单位28.25 ku,与预期一致。Western blot鉴定该蛋白能与特异性标签His-tag发生反应,IFA鉴定感染重组病毒的SF9细胞外源蛋白表达。结论通过昆虫杆状病毒表达系统成功表达目的蛋白,该蛋白有反应性,为流感抗体检测和新型疫苗的开发奠定了基础。     

弓形虫β-酮脂酰ACP合成酶的表达及鉴定

摘 要：目的 构建刚地弓形虫β-酮脂酰ACP合成酶（FABZ）原核表达质粒并在大肠杆菌中表达,建立检测和定位虫体FABZ蛋白表达的方法。方法 运用RT-PCR技术扩增弓形虫RH株速殖子fabz基因,克隆至pET32a (+)载体,在大肠杆菌Rosetta中诱导表达。Ni-NTA亲合层析柱纯化重组FABZ蛋白并制备其兔多克隆抗体。采用免疫印迹（Western blotting）技术和间接免疫荧光技术（IFA）检测和定位FABZ在虫体内表达。结果 成功表达重组FABZ蛋白,并制备其多克隆抗体。Western blotting技术检测出虫体转运肽型FABZ蛋白（t-FABZ）和成熟型FABZ蛋白（m-FABZ）,IFA技术检测出分布于核周内质网和顶质体的FABZ蛋白。结论 通过制备多克隆抗体,用Western blotting技术和IFA技术能检测和定位FABZ蛋白在虫体内表达,该方法在顶质体蛋白研究中具有较高的应用价值。     

猴痘F3L蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备

目的 猴痘病毒(MPXV)是一种能引起人畜共患病的正痘病毒属病毒,在人群和野生动物中具有较高的感染率,对人类公共卫生安全造成重大威胁。当前猴痘病毒的相关研究基础较弱,猴痘诊断试剂匮乏。本研究旨在以猴痘病毒基因F3L为对象表达F3L重组蛋白并免疫小鼠,制备F3L多克隆抗体,为猴痘诊断试剂的研发奠定基础。方法 克隆猴痘病毒基因F3L,构建至原核表达载体pET-28a上,测序无误后将重组质粒pET-28a-MPXV-F3L转化E.coli BL21感受态细胞,用优化的IPTG诱导表达条件表达MPXV-F3L重组蛋白,表达蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化后采用SDS-PAGE及Western blot进行鉴定。用纯化的重组蛋白免疫小鼠,制备F3L多克隆抗体血清,采用ELISA检测血清抗体滴度。结果 克隆得到的猴痘病毒F3L基因片段长度为471 bp,表达的pET-28a-MPXV-F3L重组蛋白分子质量约为24.6 ku,其最佳表达条件为IPTG浓度0.2 mmol/L、温度42℃、时间12 h。表达蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化后纯度达95.29%,经Western blot鉴定表达蛋白能...     

布鲁氏菌omp25重组BCG的构建及其疫苗作用检测

目的构建分泌性表达布鲁氏菌外膜蛋白OMP25基因重组卡介苗（rBCG-omp25），并免疫BALB／c小鼠，观察其免疫作用。方法利用分子生物学技术构建重组穿梭分泌载体pMV261-Ag85B-omp25．电穿孔技术导人卡介苗（BCG）。通过抗生素筛选、重组卡介苗基因组PCR扩增、测序，以及Western blot对重组卡介苗进行鉴定。分别用rBCG-omp25、BCG腹腔接种BALB／c小鼠，于免疫后第10、20、30、40和50d称重，尾部采血，用表达纯化的融合蛋白OMP25—32a检测免疫小鼠抗体的生成情况，用流式细胞仪（FCM）检测CD4^＋、CD8^＋T淋巴细胞百分率，并计算CD4^＋／CD8^＋T细胞比值。制作小鼠肝组织切片，HE染色观察病理学变化。结果重组卡介苗rBCG-omp25含有Ag85B-omp25序列，大小为745hp；Western blot表明rBCG-omp25可分泌表达布鲁氏菌OMP25。rBCG-omp25免疫小鼠后第20d，用Western blot检测到布鲁氏菌OMP25特异性抗体；rBCG—omp25免疫组和BCG免疫组的CD4^＋、CD8^＋T细胞百分率分别为38．68％、11．32％和、48．44％、14．01％，PBS组为33．24％、9．81％，差异有统计学意义（P〈0．05）。免疫后50d内rBCG-omp25组、BCG组与PBS组小鼠体重差异无统计学意义（P〉0．05）；各实验组小鼠肝组织均未见明显病理改变。结论构建的rBCG-omp25能够表达特异性蛋白OMP25。该蛋白能刺激小鼠产生特异性抗体，能刺激小鼠外周血CD4^＋、CD8^＋T淋巴细胞增殖。rBCG-omp25毒力弱，可作为预防布鲁氏菌病的疫苗候选株之一。     

细粒棘球蚴(中国大陆株)线粒体苹果酸脱氢酶重组蛋白的表达、纯化及免疫特性分析

目的 对细粒棘球蚴（中国大陆株）线粒体苹果酸脱氢酶（EgmMDH）重组质粒进行原核表达、纯化，并初步鉴定重组蛋白的免疫学特性。方法 对已构建的基因工程菌株mMDH／pGEM—T／JM109进行酶切，获取目的基因。将目的基因重组到pET28a表达载体上，筛选阳性表达菌株并进行诱导表达，经SDS—PAGE鉴定重组mMDH蛋白质为包涵体后，超声破碎细胞，尿素溶解包涵体，镍柱亲和层析法纯化，获取重组蛋白。以纯化的mMDH作抗原免疫小鼠，用Westernblot和ELISA方法检测重组蛋白的免疫原性及免疫鼠血清抗体水平。结果 成功构建原核重组表达载体mMDH／pET28a／BL21，并纯化出浓度较高的重组蛋白。ELISA结果显示，重组抗原免疫小鼠诱导产生了一定水平的血清抗体；Westernblot显示，原头蚴、囊液等天然抗原能被重组抗原免疫的小鼠血清识别。结论纯化后的重组蛋白mMDH具有较强的免疫原性，有望作为包虫病候选疫苗，值得进一步深入研究。     

犬新孢子虫ENO1蛋白的表达及亚细胞定位

目的为研究犬新孢子虫烯醇化酶(ENO1)的生物学功能,对ENO1进行原核表达,蛋白纯化后进行抗原性鉴定和亚细胞定位。方法根据GenBank公布的犬新孢子虫ENO1序列设计引物,以犬新孢子虫速殖子cDNA为模板,PCR扩增ENO1基因。将ENO1基因片段与原核表达载体pGEX-4T-1连接,连接产物转入表达感受态细胞Rosetta DE3a,经IPTG诱导表达ENO1并进行SDS-PAGE分析。重组蛋白经纯化后免疫小鼠,制备多克隆抗体,ELISA检测抗体效价,Western blot鉴定其反应原性,通过间接免疫荧光(IFA)和免疫电镜(IEM)试验进行亚细胞定位。结果 PCR扩增得到1 428 bp大小的ENO1基因片段,构建的原核表达载体pGEX-4T-1-ENO1鉴定正确。重组载体转化DE3a后经IPTG诱导高效表达重组蛋白,相对分子质量大小为78×10~3,该蛋白主要存在于重组菌超声破碎上清中。Western blot显示重组蛋白能被感染犬新孢子虫小鼠血清识别,即具有反应原性,可作为犬新孢子虫病的诊断抗原或疫苗候选靶标;IFA和IEM试验显示,ENO1在虫体的细胞质和细胞核内都有分布。结论成功构建了原核表达载体pGEX-4T-1-ENO1,ENO1在虫体的细胞质和细胞核内都有分布,且具有反应原性,为ENO1作为犬新孢子病的诊断抗原、药物靶标和疫苗候选分子提供了试验依据。     

SARS冠状病毒S1蛋白的原核表达与鉴定

目的 克隆SARS冠状病毒(SARs-CoV)S1基因片段，构建原核表达载体，并在宿主菌中诱导表达带组氨酸标记的融合蛋白。方法人工合成SARS-CoV Sl基因片段，克隆至pUCm-T载体，经DNA序列分析和酶切后，将酶切片段亚克隆至原核表达载体pET-28b( )，重组子pET-28b／SARS-S1转化大肠杆菌ril，IPTG诱导表达，Western blot鉴定表达产物；纯化表达产物并用ELISA检测其抗原特异性。结果 获得了主要以包涵体形式存在的32kD的目的蛋白，Western blot鉴定其为带组氨酸标记的融合蛋白，ELISA证明其能与合成肽的抗体及病人血清中的SARS-CoV的抗体特异结合。结论 成功构建了SARS-CoV S1基因的组氨酸标记表达载体pET-28b／SARS-S1，并在ril中得到了高效表达；表达的s1蛋白具有较好的抗原特异性，便于免疫动物以获得特异抗体，为SARS-CoV的实验室快速诊断打下了基础。