新生树鼩心肌细胞与心肌成纤维细胞的分离培养、纯化及鉴定

摘要:目的 为了分离得到可以应用于树鼩建立人类心血管病理、毒理细胞模型的纯度较高、活力较强的心肌细胞和心肌成纤维细胞。方法 使用差速贴壁1.5 h纯化心肌细胞进行培养,并比较5-溴-2-脱氧尿苷、阿糖胞苷及TGF-β抑制剂的纯化效率以获取最适纯化方案,培养过程在37℃、5%CO2条件下进行。使用MTT法测定细胞活力以确定方法可行性。利用α-横纹肌肌钙蛋白（α-SA）及心肌肌钙蛋白I（Tn I）对树鼩心肌细胞进行免疫组化及免疫荧光鉴定,利用波性蛋白（Vimentin）对树鼩心肌成纤维细胞进行免疫荧光染色以达到鉴定目的。结果 原代培养新生树鼩心肌细胞生长良好。在倒置显微镜下观察,培养10d左右的心肌细胞可以基本完成局部融合并有伴细胞搏动。MTT法检测结果显示心肌细胞活力可以在最少15d内保持良好水平。细胞鉴定结果显示树鼩心肌细胞α-SA免疫组化呈阳性,Tn I免疫荧光鉴定呈阳性,心肌成纤维细胞呈阴性,符合一般心肌细胞特征;心肌成纤维Vimentin免疫荧光结果呈阳性。结论 分离纯化得到的树鼩心肌细胞和心肌成纤维细胞,细胞纯度较高、结构完整并具有相对较高的细胞活力,是一种较为理想的、可以应用于树鼩建立人类心血管病理、毒理细胞模型的心肌细胞和心肌成纤维细胞。     

丙型肝炎病毒感染树鼩的研究进展

丙型肝炎病毒(HCV)感染是世界范围内肝病流行的主要病因,是当前全球关注的严重的公共健康问题之一。建立适用、可靠的HCV感染动物模型,是推动研究HCV感染和慢性化机制、研制HCV疫苗和防治药物所必需。但HCV像其他嗜肝病毒一样具有非常严格的种属特异性,目前除     

树鼩实验感染乙型肝炎病毒的再评价

目的评价乙肝病毒（ＨＢＶ）实验感染树的稳定性与实用性。方法用含ＨＢＶ的２．２．１５细胞或乙肝患者混合血清以不同剂量、经不同途径接种６０只健康树。观察其临床表现，检测血清ＡＬＴ、ＨＢｓＡｇ．ＨＢｅＡｇ及ＨＢＶ－ＤＮＡ。肝组织行ＨＥ及免疫组织化学染色，结果部分树出现一过性食欲不振、稀便；６０只树不同时相ＡＬＡ水平均在正常范围；８只树ＨＢＶ标志物一过性阳性；肝组织未见类似于人乙型肝炎的典型病理改变；免疫组织化学染色为阴性。结论树不能持续稳定感染ＨＢＶ     

中缅树鼩自然感染五种高致病性人腺病毒的血清流行病学分析

目的 分析中缅树鼩(Tupaiabelangeri, Tree Shrew)自然感染5种高致病性人腺病毒(Human Adenovirus, HAdv)的血清流行病学,以探讨人腺病毒感染树鼩的可能性。方法 采用固定病毒稀释血清法测定34份树鼩血清对Ad3、Ad4、Ad7、Ad14和Ad55的中和抗体水平。结果 4种B组腺病毒的中和抗体阳性率及中和效价较E组4型的大,阳性率由大到小依次为:Ad14(55.88%)、Ad3(47.06%)、Ad55(29.71%)、Ad7(14.71%)、Ad4(8.82%),树鼩血清主要表现为Ad3、Ad14和Ad55混合型多价抗血清。结论 中缅树鼩可自然感染5种人腺病毒,有望以树鼩为实验动物,建立一种成熟的人腺病毒感染模型。     

嗜血杆菌属CODEHOP PCR检测方法的建立及在树鼩检测中的应用

目的建立树鼩中嗜血杆菌的CODEHOP PCR快速检测方法,为树鼩微生物质量控制提供参考。方法应用CODEHOP在线简并引物设计工具,比对NCBI中6株嗜血杆菌的外膜蛋白序列设计简并引物。通过4株嗜血杆菌标准菌株和24株它属菌株进行特异性和敏感性评价,将建立CODEHOP PCR检测方法,应用于树鼩嗜血杆菌的检测。结果简并引物HF1/HR8和HF3/HR3扩增标准菌株副鸡嗜血杆菌(ATCC 29545)、溶血嗜血杆菌(ATCC 33390)、流感嗜血杆菌(ATCC 33391)、副流感嗜血杆菌(ATCC 33392)的目的片段分别为506 bp~535 bp和344 bp~390 bp,经测序和NCBI Blast比对,结果准确。两对引物组合,能够有效的区分嗜血杆菌属菌株与它属菌株,检测限最低可达2.1 pg/μL。在受试的野生树鼩呼吸道样本中嗜血杆菌阳性率为33.3%(20/60)。结论所建立的方法具有较好的特异性和敏感性,操作简便,能够用于动物样品的嗜血杆菌检测。     

用树鼩cDNA芯片研究树鼩肝癌中参与信号传导的部分基因变化情况

目的利用树鼩cDNA芯片研究黄曲霉毒素B1（AFBl）和（或）乙型肝炎病毒（HBV）引起的树鼩肝细胞癌（HCC）发生过程中参与信号传导的部分基因表达变化情况，从而进一步探讨HCC发生的分子机制。方法实验树鼩分3组：A组（AFB1组）、B组（AFB1＋HBV组）、C组（正常对照组）。所有动物在实验过程中定期接受剖腹手术取肝组织检查，至肝癌形成时处死动物取肝癌和癌旁组织。用树鼩cDNA芯片检测实验第30、60、90周肝活检组织、肝癌组织及其癌旁组织中各基因的表达情况，并用实时逆转录聚合酶链反应（Real time RT-PCR）法验证cDNA芯片结果。结果在A组和B组从癌前到癌变过程中胰岛素样生长因子-Ⅱ（IGF-Ⅱ）、C-rel、核因子-κB2（NF—κB2）均显示有差异表达，同时bcl-2、细胞周期素A（cyclin A）、睫状神经营养因子（CNTF）仅在B组显示有差异表达。而C组这几个基因无差异表达。实验组与对照组比较，在诱癌的早、中期（30、60周）均出现CNTF及cyclin A的差异表达。realtime RT PCR结果与cDNA芯片检测结果基本一致。A组IGF-Ⅱ、C—rel基因及B组IGF-Ⅱ基因，在肝癌组织表达水平明显低于癌旁及实验30、60周组织，而癌旁与实验30、60周相比较则无明显差异；B组CNTF基因在癌旁、肝癌及60周之间比较无明显改变，但均明显高于30周；A组CNTF基因表达水平在癌旁、肝癌组织高于癌前组织，但差异无统计学意义；C组这3个基因不同时期比较亦无明显差异。结论树目自部分信号传导通路相关cDNA芯片应用于检测树目目HCC发生过程中信号传导通路中各基因表达的变化，对进一步了解树鼠甸HCC发生的机制有重要实用价值。IGF-Ⅱ、NF-κB2、C-rel、Bcl-2、cyclin A及CNTF这几个基因与树HCC的发生发展密切相关。     

嗜血杆菌属CODEHOP PCR检测方法的建立及在树鼩检测中的应用北大核心CSCD

目的建立树鼩中嗜血杆菌的CODEHOP PCR快速检测方法,为树鼩微生物质量控制提供参考。方法应用CODEHOP在线简并引物设计工具,比对NCBI中6株嗜血杆菌的外膜蛋白序列设计简并引物。通过4株嗜血杆菌标准菌株和24株它属菌株进行特异性和敏感性评价,将建立CODEHOP PCR检测方法,应用于树鼩嗜血杆菌的检测。结果简并引物HF1/HR8和HF3/HR3扩增标准菌株副鸡嗜血杆菌(ATCC 29545)、溶血嗜血杆菌(ATCC 33390)、流感嗜血杆菌(ATCC33391)、副流感嗜血杆菌(ATCC 33392)的目的片段分别为506bp^535bp和344bp^390bp,经测序和NCBI Blast比对,结果准确。两对引物组合,能够有效的区分嗜血杆菌属菌株与它属菌株,检测限最低可达2.1pg/μL。在受试的野生树鼩呼吸道样本中嗜血杆菌阳性率为33.3%(20/60)。结论所建立的方法具有较好的特异性和敏感性,操作简便,能够用于动物样品的嗜血杆菌检测。     

羊皮癣病病原菌的分离鉴定

采用沙保弱氏培养法（Sabourordcultivation），从四川某县黄羊种畜场128只南江黄羊中所患皮癣病（发病率68．75％）取皮屑、被毛，经过分离培养、真菌学鉴定，系石膏样小孢菌（Microsporumgypseum）、羊毛状小孢子菌（Microsporumlauosum），对皮康圣、三酸合剂敏感。     

HBV与AFB1诱发树鼩肝癌前病变过程中癌基因异常表达的实验研究

动态观察HBV与AFB1诱发树鼩肝细胞癌(HCC)病变过程肝癌前病变γ-谷氨酰转肽酶阳性肝细胞灶(GGT阳性灶)和胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)、p21及p53表达情况,探讨HCC发生的可能机制。实验动物分4组:A组血清HBV阳性和摄入AFB1;B组HBV阳性;C组摄入AFB1;D组空白对照。结果:(1)各实验组肝癌前病变GGT阳性灶数量、大小均明显高于空白对照组(P<0.05),A组明显大于B、C组(P<0.05);(2)实验第15周,即有IGF-Ⅱ阳性表达,在第45周阳性率明显高于第75周(P<0.05);(3)A、B两组动物肝组织中HBsAg阳性率高达92.1％,首次在树鼩肝组织中检出HBxAg,且阳性率达86.5％。提示:HBV与AFB1协同致树鼩HCC;HCC发生早期就有癌基因IGF-Ⅱ的异常表达。     

1型糖尿病树鼩骨骼肌病变及其发病机制

目的探讨1型糖尿病(T1DM)树鼩骨骼肌病变的发病机制。方法正常对照组(A组,n=8);STZ糖尿病成模组9只(B组),糖尿病未成模组5只(C组)。在光镜和透射电镜下观察股二头肌形态学变化,以免疫组化法检测肌组织中细胞凋亡相关分子Bcl2、Fas、FasL、caspase1和caspase3的表达。结果B组肌纤维普遍萎缩,肌纤维横截面积明显小于A组(2.49±0.47μm2vs3.79±0.40μm2,P<0.05)电镜下B组肌组织呈灶性肌丝溶解,肌质膜呈锯齿状突起,部分线粒体嵴断裂、基质溶解或空泡化。肌膜下线粒体密集成群、排列紊乱和形态异常。肌细胞核异染色质增多并呈块状边集。肌组织微血管内皮伸出许多伪足,内皮增厚、管腔狭窄。微血管基底膜无明显增厚。B组肌组织对Bcl2、Fas/FasL和caspase3均呈阳性表达,A组和C组仅对FasL呈弱阳性表达。结论骨骼肌纤维普遍性萎缩、灶性肌丝溶解、肌质膜异常突起和线粒体损伤是T1DM树鼩骨骼肌病变的主要特征,骨骼肌组织中细胞凋亡通路激活可能是糖尿病肌病的重要原因。     

Human hepatitis B virus and hepatocellular carcinoma II. Experimental induction of hepatocellular carcinoma in tree shrews exposed to hepatitis B virus and aflatoxin B1

On the basis of the successful establishment of an animal model in tree shrews experimentally infected with human hepatitis B virus (HBV), a study on the hepatocarcinogenic effects of HBV and/or aflatoxin B1 (AFB1) was conducted. The results showed that the incidence of hepatocellular carcinoma (HCC) was significantly higher in the animals both infected with HBV and exposed to AFB1 (52.94%) than in those solely infected with HBV (11.11%) or exposed to AFB1 (12.50%). No HCC of precancerous lesions were found in the controls that were neither HBV-infected nor AFB1-exposed. Precancerous lesions, including liver cell dysplasia and enzyme-altered hyperplastic hepatocyte foci, were observed before the occurrence of HCC, and the frequency of their appearance correlated well with the incidence of HCC. HBV DNA and the protein it encodes were detected in the cancer cells and/or the surrounding hepatocytes. Integration of HBV DNA inot the host liver genome was found during hepatocarcinogenesis among the animals infected by HBV. These results suggest that exposure to HBV and AFB1 may play a synergistic role in the development of HCC, and support the viewpoint of an aetiological relationship between HBV and HCC.Abbreviations HCC hepatocellular carcinoma - HBV human hepatitis B virus - AFB1 aflatoxin B1 - GGT foci hyperplastic hepatocyte foci positive for -glutamyltranspeptidase - LCD liver cell dysplasia     

树鼩实验室规范化繁育研究初报

目的探讨树鼩最佳养殖环境及条件。方法详细记载实验室养殖树鼩的体重变化,饲养环境,分笼时间,受孕,分娩等情况,比较分析其最佳的养殖条件。结果通过各种饲养条件的比较,如繁育种树鼩的选择,条件的选择,饲养方式的优化,垫料的选择及饮食的标准化等,均有助于改善树鼩的养殖状态。结论实验室环境内,通过条件优化,近距离观察树鼩有助于树鼩品系的优化改良。     

黄姑鱼创伤弧菌的分离和鉴定

目的从患病黄姑鱼体内分离出致病力较强的菌株L1,人工感染实验证实该菌株为黄姑鱼的病原菌。对该细菌进行了形态、生理生化特性测定和16SrRNA分子鉴定,测定16SrRNA基因序列,分析相关细菌相应序列的同源性,构建了系统进化树。结果表明菌株L1与创伤弧菌(Vibrio vulnificus)的亲缘关系最近,具有98.7%的同源性。结合该菌株的生理生化特性,可鉴定菌株L1为创伤弧菌。     

肠道菌鉴定培养基的研究进展

目前,细菌学的分类和鉴定技术有了很大的发展,但是,临床上肠道菌鉴定主要还以生化反应为主.单管多用的显色培养基筛选微生物是一种较新的技术,其操作简便、特异性强,能提高微生物细菌鉴定在临床上的地位,单管多用的显色培养基的开发、应用是今后的发展趋势.     

老年慢性阻塞性肺病急性加重期患者呼吸道致病菌分布及耐药性分析

目的探讨老年慢性阻塞性肺病急性加重期(AECOPD)患者呼吸道致病菌分布与耐药性,为临床用药提供有效依据。方法对380例AECOPD患者进行呼吸道致病菌鉴定与药敏试验,以分析其菌群分布与耐药性。结果 380例患者中痰培养阳性者150例(39.47%),单一感染120例(80.00%)(细菌感染72例、真菌感染48例),混合感染30例(真菌混合感染2例、细菌合并真菌感染21例、细菌混合感染7例)。检出病原菌178株,革兰阴性杆菌134株(75.28%),以铜绿假单胞菌(35株)与鲍曼不动杆菌(26株)最为多见;革兰阳性球菌32株(17.98%),以金黄色葡萄糖球菌(17株)最为多见;另见真菌12株(6.74%)。铜绿假单胞菌对碳青霉烯类、β-内酰胺酶抑制剂复合物敏感性较高,对氨苄西林、头孢曲松耐药性较高;鲍曼不动杆菌对头孢哌酮/舒巴坦、碳青霉烯类、米诺环素耐药率较低,对其他抗生素耐药性较高;肺炎克雷伯杆菌对阿莫西林、氨苄西林、复方新诺明药物耐药性较高,对第四代头孢类抗生素、碳青霉烯类抗生素、β-内酰胺酶抑制剂复合物敏感性较高;金黄色葡萄糖球菌及肠球菌对万古霉素、替考啦宁、利奈唑胺敏感性较高。结论老年AECOPD患者呼吸道致病菌以革兰阴性杆菌为主,对抗菌药物耐药性较高,细菌培养与耐药性检测对指导临床合理用药具有重要意义。     

慢性阻塞性肺部疾病急性加重期病原菌分布及耐药性研究

目的探讨慢性阻塞性肺疾病急性加重期(AECOPD)的病原菌分布和耐药性。方法收集柳州多家医院2012年2月至2014年6月期间呼吸内科的AECOPD患者805例,详细记录入组患者的临床资料,分析AECOPD患者的病原菌分布及耐药特点。结果 805例AECOPD患者中分离出病原菌482例,共分离病原菌602株,其中革兰氏阴性菌430株,占71.5%,革兰氏阳性菌97株,占16.1%,真菌75株,占12.5%;铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌居前3位,分别占20.3%、18.3%和13.8%;肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌对哌拉西林耐药率均80.0%,大肠埃希菌对头孢哌酮、头孢曲松、环丙沙星、左氧氟沙星耐药率较高,均50.0%。结论 AECOPD病原菌以革兰阴性杆菌为主,治疗应根据病原菌及药敏试验结果指导,临床合理选用抗菌药物。     

常见苛养菌培养的研究进展

链球菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血杆菌是常见苛养菌,该菌培养条件苛刻,临床分离率低。本文就近几年来,苛养菌培养基成分的改良、生长结果的评价以及今后研究的方向等进行了综述。     

用人工繁育的围生期和幼年树鼩感染人乙型肝炎病毒的初步研究

目的通过用人工繁育的围生期和幼年树鼢接种人乙型肝炎病毒（HBV），并优选感染指标的检测方法，提高树鼢对HBV的感染率及检出方法的敏感性和可靠性。方法用人HBV阳性血清接种42只人工繁育的围生期和幼年树鼢，选择合适的引物，经巢式PCR（nPCR）技术检测它们肝组织及血清的HBVDNA，并对扩增出的DNA片段进行测序验证，以及对活检肝组织作病理组织学观察。结果接种后动物的肝组织和血清HBVDNA的阳性率分别为47．6％（20／42）和71．4％（30／42），肝组织和血清共同阳性的为40．5％（17／42），总阳性率为78．6％（33／42）；扩增的DNA片段经测序与人HBVDNA相应片段的同源性为98％和99％；肝组织病理改变以轻度炎性病变较多见。结论用人工繁育的围生期和幼年树鼢感染HBV，可提高树鼢对HBV的感染效率；用nPCR技术及选择合适的引物配对检测肝组织和血清标本的HBVDNA，是评价树曲庶婆HBV娃掰．曲齄戚、可靠方溃