肝细胞生长因子基因修饰的人骨髓间充质干细胞促进大鼠肢体血管新生

目的评价肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)修饰的人骨髓间充质干细胞(Human bone marrow mesenchymal stem cells,hMSC)体内促血管新生效应,探讨其作用机制。方法结扎Wistar大鼠右侧股动脉,建立局部肢体缺血模型。将hMSC、hMSC/Ad-HGF或PBS,通过肌肉注射接种于缺血区,21d后以对侧肢体为正常对照,进行激光多普勒灌注成像测定、HE染色和免疫组化检查,评价骨骼肌微血管密度。以MTT、Transwell及内皮细胞体外管状结构形成实验,评价hMSC/Ad-HGF对血管内皮细胞的体外增殖、迁移及成管状能力的影响。结果 21d后,hMSC/Ad-HGF和hMSC组血流灌注水平明显高于对照组(P0.01),前者接近PBS组,显著高于hMSC组(P0.05)。组织学分析表明,每高倍视野肌肉组织中,hMSC/Ad-HGF组微血管数量最高,PBS组和hMSC组次之,对照组最低(P0.01)。hMSC/Ad-HGF培养上清可明显促进ECV304细胞的增殖,刺激作用高于表皮生长因子(20ng/mL,P0.001);促进细胞跨膜迁移和管状样结构形成,强于表皮生长因子。结论 hMSC/Ad-HGF可促进血管内皮细胞的增殖、迁移及血管结构重建,从而引发血管新生效应。     

骨髓间充质干细胞联合VEGF-C治疗兔肢体淋巴水肿

目的 :观察骨髓间充质干细胞(BMSC)移植联合外源性VEGF-C蛋白治疗兔肢体淋巴水肿疗效。方法:手术和放射相结合制作兔后肢淋巴水肿模型,随机分为对照组(生理盐水组)、骨髓间充质干细胞治疗组(BMSC组)、VEGF-C治疗组(VEGF-C组)及联合治疗组(BV组),每组各8只。治疗后28 d测量肢体体积变化,并于治疗后30 d Western blot检测移植组织中VEGF-C表达、VEGFR-3免疫组化染色及微淋巴管计数。结果:Western blot结果显示,对照组、BMSC组及VEGF-C组的VEGF-C表达无显著性差异(P0.05),BV组的VEGF-C表达较其余3组增多(P0.05),对照组、BMSC组及VEGF-C组的微淋巴管计数组间比较差异无显著性(P0.05),BV组的微淋巴管计数较其余3组明显增加(P0.05)。BMSC组及VEGF-C组的VEGFR-3免疫组化染色呈阳性表达,与对照组比较有显著性差异(P0.05),BV组的VEGFR-3免疫组化染色呈强阳性表达,与其余3组比较均有显著性差异(P0.05)。结论:骨髓间充质干细胞联合VEGF-C可以更加有效地改善肢体淋巴水肿。     

肝细胞生长因子基因修饰的间充质干细胞治疗兔股骨头坏死

目的探讨间充质干细胞（Mesenchymal stem cell，MSCs）和肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor，HGF）在治疗股骨头坏死骨缺损中的作用。方法贴壁法分离培养兔骨髓MSCs，体外鉴定成骨和成脂肪能力。利用外科手术法建立兔双侧股骨头坏死骨缺损模型，将复合细胞的骨基质明胶材料填塞缺损区。治疗后3个月，取材进行组织学检查。MSCs和携带肝细胞生长因子基因的腺病毒载体感染的间充质干细胞（MSC／HGF）经荧光染料二醋酸琥珀酰酯羟基荧光素标记后，氯化钴处理72h，流式细胞仪分析细胞增殖情况。结果培养的细胞在适当条件诱导下，可分化为成骨细胞和成脂肪细胞。组织学显示，单纯支架对照组仅见疏松的纤维肉芽组织填充；MSC组可见致密的纤维肉芽组织填充，其间有较多新生血管，但未见新生骨组织；基因转染细胞组多为软骨样组织填充，周围可见新骨带形成。LaBe-Sandhu骨组织学评分显示，MSC／HGF具备最佳的骨修复能力，三组差异显著（p〈0.01）。培养体系中加入氯化钴后，已增殖的MSC／HGF比例显著高于MSCs（P〈0.001），提示MSC／HGF具有更强的抗低氧损伤能力。结论在该模型中，MSC／HGF体内成骨能力优于MSCs，这种现象可能与MSC／HGF具有更强的抗低氧损伤能力有关。结果提示肝细胞生长因子基因修饰是间充质干细胞应用于缺血性骨坏死治疗的有效途径。     

肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子1对骨髓间充质干细胞GATA-4表达的影响

目的探讨联合应用肝细胞生长因子（HGF）和胰岛素样生长因子1（IGF-1）对骨髓间充质干细胞（BMSCs）GATA-4表达的影响,为临床开展干细胞移植的可行性提供依据。方法从家兔股骨和胫骨中抽取骨髓分离BMSCs进行培养,心肌细胞由新生兔的心室获得,然后按1∶1的比例混合进行共同培养,将8个培养瓶中的4瓶细胞加入HGF（150 ng/ml）和IGF-1（200 ng/ml）,另4瓶不加HGF和IGF-1进行共同培养,分别培养1 d,3 d,1周直到6周后,分化的BMSCs运用激光显微切割系统进行捕获,搜集并提取核糖核酸（RNA）。运用免疫组织化学、电子显微镜和逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）证实BMSCs转化为心肌样细胞,并通过半定量RT-PCR检测BMSCsGATA-4的动态时序表达。结果在共同培养前,α-肌动蛋白在BMSCs呈阴性表达,BMSCs有多个核仁。与心肌细胞共同培养后,部分BMSCsα-肌动蛋白表达呈阳性,并呈现有心肌细胞样超微结构,包括肌纤维、线粒体和内质网,与心肌细胞共同培养的BMSCs表达心脏转录因子GATA-4。与未给予HGF和IGF-1的细胞比较,联合给予HGF和IGF-1后可明显提高BMSCs GATA-4的表达。给予生长因子后捕获的BMSCs GATA-4表达从第1 d开始增强,在2周时达到高峰,以后维持在较高水平。结论BMSCs与心肌细胞共同培养后可分化成心肌样细胞,并表达心脏转录因子GATA-4。联合应用HGF和IGF-1可促进BMSCs向心肌细胞分化,提高GATA-4的表达。     

肝细胞生长因子及骨髓间充质干细胞联合移植治疗慢性缺血性心脏病的实验研究

目的研究经肝细胞生长因子(HGF)及骨髓间充质干细胞(MSCs)联合移植治疗慢性缺血性心脏病的疗效。方法采集香猪髂骨骨髓,用密度梯度法和贴壁分离法相结合的方法分离、培养MSCs,通过细胞表面标记(CD34、CD44、CD71、Ⅷ因子和desmin)成份鉴定;HGF基因的重组腺病毒(AdHGF)+MSCs共培养并检验HGF对MSCs生物学特征的影响。经左胸冠状动脉回旋支放置Ameroid环建立慢性心肌缺血香猪模型,将40只小型香猪采用随机对照分为5组(n=8),于缺血心肌处分别注射5×106/ml MSCs+4×109pfu 200μl AdHGF(MSCs+AdHGF组)、4×109pfu 200μl AdHGF(AdHGF组)、5×106/ml MSCs 200μl(MSCs组),4×109pfu 200μl AdNull(AdNull组)和生理盐水1 ml(对照组)。治疗4周后行心脏超声心动图,数字减影动脉造影(DSA),单光子发射计算机体层摄影(SPECT)心肌灌注检查及心肌凋亡细胞等检测。结果流式细胞仪检测MSCs表面标记CD44、CD71阳性,CD34、Ⅷ因子、desmin阴性;增殖细胞抗原(PCNA)蛋白表达显示HGF具有较强刺激MSCs增殖分化作用;彩色超声心动图检查提示:经治疗后MSCs+AdHGF组左心室舒张期末容积(LVEDV)、左心室射血分数(LVEF)、短轴缩短率(FS)明显改善,差异有统计学意义(P<0.05);DSA检测缺血区新生血管数MSCs+AdHGF组较AdHGF组、MSCs组明显增多,差异有统计学意义(P<0.05);SPECT显示MSCs+AdHGF组左室心肌增厚、灌注明显改善,运动增强,差异有统计学意义(P<0.05);心肌HE染色血管密度,MSCs+AdHGF组明显高于AdHGF组和MSCs组[(39.4±1.2)个/HPF vs.(36.5±1.4)个/HPF、(34.5±1.7)个/HPF,P<0.05];心肌TUNEL染色法检测,MSCs+AdHGF组、AdHGF组细胞凋亡率明显低于MSCs组(P<0.05)。结论 MSCs+AdHGF联合具有促进慢性缺血心肌新血管生成、抑制细胞凋亡、改善心功能等作用;MSCs+AdHGF联合治疗缺血性心脏病作用较单纯HGF或MSCs移植更明显。     

体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的实验研究

目的：探讨HGF和EGF对骨髓间充质干细胞向肝细胞方向的诱导分化作用，探索出合适的诱导条件，为肝细胞移植、生物人工肝、组织工程构建等提供基础。方法：骨髓来自杂种犬的髂骨，采用全血贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞，流式细胞仪检测细胞CD标记；用含HGF和EGF的α—MEM培养液进行诱导培养，并于诱导后7、14、21d留取细胞；用免疫组化检测AFP、CK18，免疫荧光检测ALB，PAS反应检测糖原；流式细胞仪检测细胞分化率。结果：分离的骨髓间充质干细胞表面CD13、CD34和CD45皆为阴性，CD29为阳性。诱导至7d出现AFP表达．14d表达增高，21d时表达下降。CK18、ALB和糖原14d时出现表达，并随时间延长表达逐渐增加：21d时ALB表达阳性率可达50％以上。结论：HGF和EGF有诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的作用。     

人骨髓间充质干细胞向肝细胞诱导分化的进一步研究

目的：探索骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）向肝细胞诱导的最有效方法,并对诱导后的细胞进行鉴定。方法：取健康成人的适量骨髓,采用梯度密度离心法分离BM-MSCs并行贴壁培养,扩增至第3代,取第3代细胞分3组分别进行诱导。A组：肝细胞生长因子（HGF）＋表皮生长因子（EGF）;B组：肝细胞生长因子（HGF）＋成纤维生长因子（FGF）;C组：肝细胞生长因子（HGF）＋表皮生长因子（HGF）＋成纤维生长因子（HGF）。分别进行培养,诱导前通过流式细胞仪分析细胞表面标志CD44、CD90的表达率对培养的BM-MSCs进行鉴定,诱导后通过RT-PCR、免疫组织化学法、糖原染色检测鉴定其诱导分化情况。结果：本文通过建立从人骨髓中分离、培养、扩增、传代、纯化BM-MSCs,定向诱导分化,使其成功向肝样细胞转化,图像分析表明C组鼠抗人白蛋白单克隆抗体（ALB）表达最为明显。结论：证明3种组合均可成功将骨髓间充质干细胞向肝样细胞诱导分化,均能分泌肝细胞特异性标记如鼠抗人甲胎蛋白单克隆抗体（AFP）、ALB、糖原,其中C组效果最为突出。     

兔骨髓间充质干细胞分离方法的比较

目的：建立并优化骨髓间充质干细胞分离纯化的方法。方法：从兔的胫骨中抽取骨髓，分别通过直接培养、经Fichu—Hypeque和Perool两种分离介质进行分离后再培养的方法，收获所培养的细胞，然后测量间充质干细胞所占的比例。结果:直接培养、经Fichu—Hypaque、Perool分离后再培养的细胞中，骨髓间充质干细胞比例分别为67．3％、83．6％、93．4％。结论:采用Perool分离方法可以更好的提高MSCs的纯度，提高MSCs的培养效率。     

骨髓间充质干细胞联合血管内皮生长因子基因治疗肢体缺血的实验研究

目的 观察骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cell,BMSC)联合血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因治疗对家兔肢体缺血模型的疗效.方法 切除新西兰兔右后肢全长股浅动脉并结扎股深动脉以建立兔后肢缺血模型,随机分为空质粒对照组(EP组)、骨髓间充质干细胞组(BMSC组)、VEGF基因治疗组(VEGF组)及联合治疗组(BV组),每组各8只.分别于治疗后28 d及30 d进行动脉造影及VEGF免疫组化染色.结果 EP组、BMSC组及VEGF组的新生血管计数组间比较差异无统计学意义(P＞0.05).BV组的新生血管计数较其余3组明显增加,差异有统计学意义(F=35.47,P＜O.01).BMSC组及VEGF组的VEGF免疫组化染色呈阳性表达,与EP组比较差异有统计学意义(F=764.32,P＜0.01).BV组的VEGF免疫组化染色呈强阳性表达,与其余3组比较差异有统计学意义(F =764.32,P＜0.01).结论 BMSC联合VEGF基因治疗兔肢体缺血可使VEGF获得稳定而有效的表达,从而改善肢体缺血.     

血管内皮生长因子基因转染骨髓间充质干细胞移植于梗塞心肌的实验研究

目的 探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）移植联合血管内皮生长因子（VEGF）基因转染对大鼠梗塞心肌组织的修复重建、血管再生及梗塞后心功能的影响。方法 体外分离、培养、纯化SD大鼠的MSCs，以BrdU标记MSCs，腺病毒介导VEGF基因转染MSCs。建立大鼠急性心肌梗死模型4周后，随机分为4组（每组10只），分别行梗塞心肌内注射：转染VEGF基因的MSCs移植组（组Ⅰ）、单纯MSCs移植组（组Ⅱ）、单纯VEGF基因治疗组（组Ⅲ）和以注射无血清IMDM培养液为对照组（组Ⅳ）。移植4周后观察移植细胞的分化和新生血管的形成，并通过超声多普勒检测心功能变化。结果 组Ⅰ和组Ⅱ中，梗塞心肌处可见BrdU标记的移植细胞，cTnT染色阳性。超声心动图检查发现，组Ⅰ和组Ⅱ的左室射血分数（LVEF）的改善显著高于对照组（P均〈0．01），而组Ⅰ的LVEF改善程度要明显高于组Ⅱ；部分BrdU染色阳性的细胞可以分化成为内皮细胞，参与构成了梗塞区域的新生毛细血管。相对于对照组，组Ⅰ和组Ⅲ都有明显的血管新生（P均〈0．01）。结论 MSCs移植联合VEGF基因转染可以通过促进心肌再生和新生血管的形成来重建缺血心肌，显著改善心功能。     

人脐带间充质干细胞改善小鼠下肢缺血机制的代谢组学分析

背景与目的：外周血管疾病（PAD）是因各种原因所致血流灌注不足而引发的疾病,部分患者无法手术。近年来,干细胞移植开始应用于PAD的治疗,并取得了一定的效果。然而目前尚未见其作用机制涉及代谢方面的研究。因此,本研究利用液相色谱-质谱（LC-MS）代谢组学初步探讨人脐带间充质干细胞（HUCMSC）促进下肢缺血组织修复中所涉及的代谢通路与代谢分子,并重点分析酸性鞘磷脂酶（ASM）-神经酰胺（Cer）代谢途径的变化。方法：从人脐带组织中分离获得HUCMSC,培养扩增后用流式细胞术鉴定其表面分子标记。8周龄雄性小鼠（C57BL/6J）采用结扎并离断其左侧下肢股动脉、股静脉的方法制备下肢缺血模型,将造模后的小鼠随机均分为两组,分别于缺血侧下肢局部注射HUCMSC混悬液（HUCMSC组）与PBS （对照组）。分别在术后3、7、14 d,取两组小鼠缺血侧腓肠肌组织,行HE染色与Masson染色,观察两组小鼠缺血肌肉的形态学变化;行LC-MS检测,并结合KEGG数据库分析,比较两组肌肉组织的代谢组学差异。结果：分离获得的HUCMSC高表达CD105、CD90、CD73,低表达HLA-DR、CD14、CD...     

间充质干细胞治疗胰腺炎的研究进展

目前胰腺炎的临床治疗仍以对症支持治疗为主,具有住院周期长、医疗费用高和高病死率,因此亟需寻找到一种新的治疗策略。间充质干细胞(MSCs)因其高度的自我更新、多向分化潜能、低免疫原性以及免疫调节功能等优势,已成为再生医学中组织或器官修复的理想种子细胞。近年来众多研究发现MSCs移植胰腺炎动物模型后,不但可归巢到损伤区域,而且可通过抗炎、抗凋亡、促血管新生及免疫调节作用等促进胰腺组织的修复,这表明MSCs有望成为治疗胰腺炎的新策略。笔者就MSCs在急、慢性胰腺炎治疗中的最新研究进展作一综述。     

人肝细胞生长因子基因修饰大鼠骨髓间充质干细胞系的构建

目的 构建人肝细胞生长因子(hHGF)基因修饰大鼠骨髓间充质干细胞系(MSCs).方法 采用脂质体法将hHGF基因慢病毒载体质粒(lenti-hHGF)转染至293FT细胞,收集病毒上清液感染大鼠MSCs细胞,经过G418筛选得到稳定分泌hHGF的MSCs细胞株(hHGF-MSCs细胞).以转染空载体细胞(eGFP-MSCs)、未转染慢病毒载体的MSCs细胞作为对照.采用免疫印迹法检测hHGF的表达.hHGF-MSCs细胞分别加入成骨诱导剂或成脂诱导剂培养,分别采用茜素红染色和油红O染色鉴定成骨细胞和脂肪细胞表型.结果 与未转染慢病毒载体的MSCs细胞和eGFP-MSCs细胞比较,hHGF-MSCs细胞hHGF表达上调(P＜0.01).hHGF-MSCs细胞体外诱导培养后具有明显的成骨和成脂表型,可向成骨细胞和脂肪细胞分化.结论 成功构建hHGF基因修饰大鼠MSCs.     

骨髓间充质干细胞复合骨基质明胶构建组织工程化软骨

目的分离并诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)成软骨分化,与同种异体骨基质明胶(BMG)结合,在体外构建组织工程软骨。方法分离骨髓MSCs,实验组DMEM培养液中加入rhTGF-β1和rhIGF-Ⅰ,对照组未加入诱导因子。比较实验组和对照组细胞的增殖和成软骨分化情况。制备同种异体BM G,扫描电镜观察,与细胞结合在体外构建组织工程软骨,1、2、3和5周取材作胶原染色、蛋白聚糖染色和扫描电镜观察。结果实验组中M SCs集落形成效率(21/106)明显高于对照组(3/106)(u=3.8783,P<0.01);实验组8例中有7例表达Ⅱ型前胶原m RNA,而对照组仅1例表达(χ2=6.250,P<0.05);实验组细胞培养液中的己糖醛酸逐渐升高,第15d已达到初始浓度的1.38倍,而对照组无明显升高(t=3.933,P<0.01)。制备得到的同种异体BMG为三维立体多孔结构,可塑性好并有适宜的机械强度。胶原、蛋白聚糖染色和扫描电镜观察发现,细胞在BM G表面和孔隙内大量增殖,培养后5周在组织工程软骨块的内部即可见软骨陷窝。结论rhTGF-β1和rhIGF-Ⅰ可促进MSCs增殖和成软骨分化,与同种异体BMG结合后可在体外成功构建组织工程软骨。同种异体BM G符合组织工程软骨基质材料的基本要求,有望成为一种理想的用于关节骨软骨缺损修复的软骨组织工程载体材料。     

腺病毒载体介导NGF基因转染大鼠肌源性干细胞的实验研究

目的:探讨腺病毒载体介导神经生长因子(NGF)体外转染大鼠肌源干细胞(MDSCs)应用于基因治疗的可行性。方法:培养并纯化MDSCs细胞株,采用具有高效转染能力的腺病毒载系统将NGF基因导入MDSCs中,采用绿色荧光蛋白(EGFP)荧光技术检测转染率、实时荧光定量PCR (qPCR)检测目的基因NGF的表达情况。结果:...     

他克莫司促进基因修饰的同种异体间充质干细胞修复骨缺损

目的　探讨他克莫司 (FK 5 0 6)在腺病毒介导的转骨形态发生蛋白 2 (BMP 2 )基因的同种异体间充质干细胞 (MSCs)修复节段性骨缺损中的作用。方法　大鼠股骨节段性骨缺损模型 ,分别植入不同的基因修饰的MSCs与胶原复合物 ,于术后 2、4、6、8周行放射学检查 ,术后 8周的标本行组织学检查及组织形态计量学分析。结果　术后 8周 ,放射学评分Adv hBMP 2转染的同系MSCs组 (A组 )、Adv hBMP 2转染的同种异体MSCs应用FK5 0 6组 (C组 )均高于Adv hBMP 2转染的同种异体MSCs未用FK5 0 6组 (D组 ) ,差异有显著性 (P <0 .0 5 )。组织学检查显示 ,术后 8周A、C组以板层骨为主 ,D组以编织骨和类骨质为主 ,内有炎症细胞浸润 ;组织形态计量学分析显示 ,术后 8周A、C组新骨形成的量多于D组 ,差异有显著性 (P <0 .0 5 )。结论　短期小剂量应用FK 5 0 6可抑制Adv hBMP 2基因转染的同种异体大鼠MSCs移植诱发的免疫排斥反应 ,促进长骨干节段性骨缺损的修复。     

兔骨髓间质干细胞修复肌腱缺损效果观察

目的　观察兔骨髓间质干细胞(MSCs)修复肌腱缺损的效果。　方法　分离培养家兔MSCs,检测CD44mRNA进行鉴定。6只家兔分为实验组和对照组,每组3只。在兔跟腱处造成3cm长的缺损,实验组家兔以自体MSCs为种子细胞、以胶原聚羟基乙酸(PGA)为生物支架构建肌腱并移植于跟腱缺损处,对照组家兔仅以PGA生物支架修复跟腱缺损。于术后4、8、12周对移植部位进行大体和组织学观察。　结果　MSCs培养11d时CD44mRNA显示阳性。实验组术后8周肉眼可见移植处形成腱样组织, 12周时组织学观察可见形态一致、顺应力学方向排列于胶原中的腱样细胞,类似正常肌腱组织。对照组所形成的新生组织较实验组细小且与周围组织粘连, 12周时组织学观察见细胞排列紊乱,胶原纤维呈松散网丝状。　结论　应用组织工程技术以自体MSCs修复肌腱缺损具有可行性。     

携带Ad.ANG的骨髓基质细胞移植于缺血心肌的实验研究

目的　利用编码血管生长素基因的腺病毒 (Ad .ANG)转染骨髓基质细胞 (BMSCs) ,并移植于缺血心肌 ,研究其对心功能的保护作用。方法　Ad .ANG体外转染BMSCs后 ,通过ELISA方法检测ANG的表达和分泌情况 ;将转染Ad .ANG的BMSCs移植于同基因背景Lewis大鼠梗死心肌 ,通过EF、左室舒张末期容积等超声指标研究其对心功能的保护作用 ,另外通过免疫组化、电镜研究细胞存活、分化和血管新生情况。结果　Ad .ANG转染BMSCs后 ,在培养上清中有大量ANG出现 ,4～ 7d时表达达到高峰 ,15d后仍可检测到蛋白表达。移植于缺血心肌 4周后 ,实验组在心功能改善方面明显好于单纯细胞移植组 (P <0 0 5 )、Ad .ANG治疗组 (P <0 0 1)和空白对照组 (P <0 0 1) ,在促血管新生方面 ,实验组也明显优于以上 3组。结论　转染Ad .ANG后的BMSCs可获得很高的表达水平 ,移植于缺血心肌后 ,在改善心功能和促进血管新生方面明显优于单纯细胞移植组和基因治疗组。