经转染人骨形态发生蛋白7基因后骨髓间充质干细胞mRNA的表达

目的构建人骨形态发生蛋白7(humanbonemorphogeneticprotein7,hBMP-7)逆转录病毒载体并检测经逆转录病毒介导基因转染的兔骨髓间充质干细胞(bonemarrow-derivedmesenchymalstemcell,MSCs)mRNA的表达。方法构建hBMP-7逆转录病毒载体后利用脂质体介导的基因转移技术转染包装细胞PT67,制备含目的基因的重组逆转录病毒液并感染兔骨髓间充质干细胞,采用原位杂交、RT-PCR检测hBMP-7mRNA在MSCs中的表达。结果成功构建了hBMP-7逆转录病毒载体,经hBMP-7基因转染的MSCs可表达外源性BMP-7mRNA。结论采用逆转录病毒介导的方法可以将hBMP-7转染至MSCs中并表达外源性基因。     

hBMP7瞬时转染对兔骨髓间充质干细胞生物学行为的影响

[目的]运用人骨形成蛋白hBMP7(human bone morphogenetic protein-7,hBMP-7)基因体外转染兔骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),观察瞬时转染对兔MSCs生物学行为的影响.[方法]密度梯度离心法培养兔MSCs,在体外分别转染pcDNA1.1/AMP-hBMP7和pcDNA1.1/AMP并留置空白对照.检测转染基因的转录和表达,观察细胞形态和生长情况,检测碱性磷酸酶、钙结节和骨钙素等成骨细胞表型.[结果]hBMP-7基因存在于转染后的骨髓间充质干细胞中并表达相应的mRNA.目的基因表达后细胞形态略有变化,生长曲线与未诱导组无明显变化,钙结节形成,碱性磷酸酶增加,骨钙素表达增强.电镜见胞质中有钙质成分.[结论]hBMP-7基因可促进兔MSCs向成骨细胞表型转化.hBMP-7基因转染的MSCs有望成为组织工程化骨理想的种子细胞.     

人骨形态发生蛋白7重组腺病毒的制备及在骨髓基质干细胞中的表达

目的:构建骨形态发生蛋白7(BMP-7)和绿色荧光蛋白(GFP)融合基因的重组腺病毒载体,并检测其在骨髓基质干细胞(BMSCs)的表达.方法:RT-PCR法获得BMP-7基因.将其克隆至pcDNA3.1/CT-GFP质粒中,PCR扩增hBMP-7/GFP融合基因片段,与线性化pAxCAwt腺病毒载体连接,转染大肠杆菌LE392,筛选重组腺病毒黏粒,大量扩增后与DNA-TPC共转HEK293细胞,获得重组腺病毒Ad.hBMP-7/GFP.用重组病毒液转染兔BMSCs细胞,免疫组化方法检测BMP-7的表达.结果:经过多聚酶链反应及酶切鉴定证明获得了BMP-7重组腺病毒基因组,并包装出重组腺病毒,滴度为4.4×108pfu/ml.荧光显微镜和免疫组织化学证明BMP-7在重组腺病毒转染后的BMSC细胞中得到了表达.结论:成功制备BMP-7重组腺病毒,为骨缺损局部基因治疗研究奠定基础.     

经转染人骨形态发生蛋白7基因后骨髓间充质干细胞mRNA的表达

目的 构建人骨形态发生蛋白（human bone morphogenetic protein7，hBMP－7）逆转录病毒载体并检测经逆转录病毒介导基因转染的兔骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cell,MSCs)mRNA的表达。方法 构建hBMP-7逆转录病毒载体后利用脂质介导的基因转移技术转染包装细胞PT67，制备含目的基因的重组逆转录病毒液并感染兔骨髓间充质干细胞，采用原位杂交、RT－PCR检测hBMP－7mRNA在MSCs中的表达。结果 成功构建了hBMP-7逆转录病毒载体，经hBMP－7基因转染的MSCs可表达外源性BMP－7mRNA。结论 采用逆转录病毒介导的方法可以将hBPM－7转染至MSCs中并表达外源性基因。     

重组肝细胞生长因子质粒的构建及其在成骨细胞中的表达

目的 构建人肝细胞生长因子(hHGF)真核表达质粒,探讨重组质粒对体外培养胎兔成骨细胞增殖分化的影响,为转基因治疗骨科疾病提供实验基础.方法 RT-PCR扩增人肝脏中hHGF全长cDNA片段,克隆入pcDNA3.1( )真核表达载体中,用脂质体法将pcDNA3.1( )-hHGF质粒转染成骨细胞,通过G418筛选获得阳性克隆,用免疫荧光染色检测hHGF基因在成骨细胞内的表达;MTT法和FCM检测pcDNA3.1( )-hHGF转染后对细胞增殖和细胞周期的影响;采用RT-PCR和ELISA方法检测hHGF在成骨细胞中的表达.NPP法检测碱性磷酸酶合成情况.结果 成功构建hHGF真核表达质粒,免疫组化和RT-PCR检测显示转染成骨细胞后细胞内hHGF mRNA呈现高水平表达;MTT法和FCM检测显示重组质粒转染后能促进成骨细胞的增殖,S期细胞比例增多;ELISA法检测到hHGF在细胞中有分泌性表达.转染重组质粒的成骨细胞合成碱性磷酸酶能力显著提高.结论 成骨细胞经基因转染后可以表达hHGF,外源性hHGF基因能够刺激成骨细胞增殖、分化及成骨活性.     

hBMP-4瞬时转染对兔骨髓基质干细胞生物学行为的影响

目的应用兔骨髓基质干细胞(bonemarrowstromalcells,MSCs)作为基因治疗的靶细胞,体外转染人骨形成蛋白4(humanbonemorphogeneticprotein-4,hBMP-4)基因,观察瞬时转染对兔MSCs生物学行为的影响。方法贴壁法培养兔MSCs,分别在体外转染pEGFP-hBMP-4和pEGFP基因并留置空白对照。检测转染效率及目的基因的转录和表达,观察细胞形态及生长情况,检测碱性磷酸酶、钙结节及骨钙素等成骨细胞表型。结果基因转染效率达到20%～30%,RT-PCR显示MSCs本身有目的基因的少量转录,转染pEGFP-hBMP-4后转录增强。目的基因转染后细胞形态略有变化,生长曲线与对照组相似,碱性磷酸酶阳性染色面积增加(P=0.0016),钙结节增多(P=0.0001),骨钙素表达增强(P=0.03)。结论优化的条件下取得了较高的转染效率,hBMP-4基因转染可以增强目的基因的转录,加速MSCs向成骨细胞表型转化。hBMP-4转染的MSCs可望成为组织工程化骨理想的种子细胞。     

人骨形成蛋白-7基因重组腺病毒的构建及其在兔骨髓间充质干细胞中的表达

目的:克隆人骨形成蛋白-7(BMP-7)基因并构建其重组腺病毒,观察其在兔BMSc中的表达. 方法:用RT-PCR方法从人胎肾组织中克隆人BMP-7基因全长cDNA并测序;将BMP-7基因cDNA克隆到穿梭载体形成转移质粒pAdTrack-CMV-BMP-7,经PmeI酶切线性化后与骨架质粒感受态细胞AdEasier-1 Cells经电穿孔法同源重组得到腺病毒质粒pAdBMP-7并酶切鉴定,PacI酶切线性化后转染293细胞包装后获得复制缺陷型重组腺病毒AdBMP-7,将AdBMP-7体外感染兔BMSc后,以RT-PCR方法及观察AdEasy系统上的绿色荧光蛋白表达鉴定BMP-7基因的表达. 结果:用RT-PCR方法从胎肾组织中克隆出1296 bp的cDNA,测序证实为人BMP-7基因;酶切鉴定表明BMP-7基因已插入到pAdTrack-CMV穿梭质粒且腺病毒重组质粒pAdBMP-7构建成功;经293细胞包装3 d后可观察到绿色荧光蛋白表达(GFP),氯化铯梯度离心法最终获得约3×109 efu/L滴度的重组病毒;体外感染兔BMSc后RT-PCR方法及荧光显微镜证实BMP-7基因可在兔BMSc中表达. 结论:成功克隆人BMP-7基因并构建其重组腺病毒,证实了其在BMSc的表达,为骨再生的局部基因治疗打下基础.     

hBMP-7基因瞬时转染绝经后骨质疏松大鼠骨髓基质细胞的表达及对其生物学活性的影响

目的观察hBMP-7基因瞬时转染对去卵巢（OVX）大鼠的骨髓基质细胞（BMSCs）生物学特性的影响。方法通过去除双侧卵巢构建SD大鼠绝经后骨质疏松模型后,全骨髓法培养大鼠BMSCs,通过重组腺病毒将hBMP-7基因转染入OVX大鼠BMSCs。观察转染后细胞形态及生长情况以及碱性磷酸酶（ALP）变化。结果荧光显微镜下,转染24h后即可见大量绿色荧光蛋白表达阳性的细胞,基因转染效率高于70%。转染后细胞形态无明显改变,细胞增殖能力没有明显改变,ALP活性明显增高。免疫细胞化学染色结果表明,hBMP-7基因在OVX大鼠BMSCs中得到了有效的表达。结论重组腺病毒能够有效地将hBMP-7基因转染到OVX大鼠BM-SCs中,且hBMP-7能有效表达。基因转染对OVX大鼠BMSCs的增殖无明显影响,转染可促进OVX大鼠BMSCs向成骨细胞分化。     

血管内皮生长因子基因对人骨髓基质细胞增殖及代谢的影响

目的 观察血管内皮生长因子(VEGF)基因对人骨髓基质细胞(hBMSc)增殖、代谢的影响.方法 实验分为3组:①VEGF165和eGFP基因转染hBMSc组;②空腺病毒载体转染hBMSc组;③单纯hBMSc组.培养细胞,进行MTT检测,流式细胞仪分析细胞周期.取各组生长状态良好的第3代细胞,转染后,进行ALP含量检测,骨钙蛋白和层粘连蛋白榆测.结果 各组细胞数量随培养时间的延长都有所增加,各时间点经VEGF165基因转染的hBMSc吸光度值无显著性差异(p>0.05).经转染基因的hBMSc与转染空载体、未转染的hBMSc相比较,DNA合成前期细胞所占百分比无显著性差异,反应增殖活力的增殖指数PrI(包括DNA合成期、DNA合成后期和有丝分裂期)也无显著性差异(P>0.05).经转染的hBMSc碱性磷酸酶、骨钙蛋白和层粘连蛋白合成与转染空载体、未转染的hBMSc相比较有显著性差异(P<0.05),证实经转染的hBMSc碱性磷酸酶、骨钙蛋白和层枯连蛋白合成明显高于其他两组.结论 本实验证实了构建的Ad-VEGF165感染哺乳动物细胞后具有分泌VEGF165的能力,并获得了转VEGF165基因hBMSc.转染VEGF165对hBMSc体外增殖明显影响,同时可以显著提高BMSc分泌ALP,骨钙素(OC)和层粘连蛋白(LN),说明VEGF165对hBMSc体外向成骨细胞分化起到了促进作用.     

人骨形态发生蛋白-2基因腺病毒载体异位成骨

目的：评价人骨形态发生蛋白2(hBMP-2)基因腺病毒表达载体(recombinant adenoviral vector carrying the human BMP-2 gene, AdBMP-2)成骨能力并探讨其成骨机制。方法：应用 AdBMP-2体外感染兔骨髓间质干细胞（BMSC），7 d后观察hBMP-2和碱性磷酸酶(ALP)的表达,21 d后观察感染细胞钙结节形成能力。同时将AdBMP-2行裸鼠腓 肠肌组织内注射，术后20 d取材，观察hBMP-2的表达及肌组织内异位成骨情况。结果：AdBMP-2可高效感 染BMSC并获得hBMP-2的有效表达，ALP表达增高并形成钙结节。AdBMP-2在体内同样表达hBMP-2， 并且以软骨化骨的方式启动成骨。结论：感染AdBMP-2的BMSC向成骨细胞分化，AdBMP-2在体内有着良好的成骨能力。     

hBMP2转基因载体的构建及其在兔骨髓基质细胞中的表达

腹泻是离乳婴猴常见病,死亡率极高的病。作者多年的统计结果表明,死亡婴猴中58．3％死于腹泻。过去腹泻早期也使用过一些药物进行治疗, 但效果不太理想。最近,作者用胃肠粘膜保护剂联合思密达,口服补液盐辅助治疗婴猴腹泻,取得良好效果。 1 材料与方法 1．1 动物的选择选取离乳后3-60 d(4月龄离乳)的腹泻婴猴作试验观察,发病时间不超过24 h。全部婴猴半屏     

逆转录病毒介导人重组骨形态发生蛋白基因转染骨骼肌卫星细胞mRNA的表达

目的探讨逆转录病毒介导重组人骨形态发生蛋白7(recombinant human bone morphogenetic protein 7, rhBMP7)基因转染骨骼肌卫星细胞的可行性及目的基因的表达情况。方法体外获取和培养大鼠骨骼肌卫星细胞,构建rhBMP7逆转录病毒载体,利用脂质体介导的基因转移技术转染包装细胞PT67,经G418筛选后,制备含目的基因的重组逆转录病毒液,病毒液感染骨骼肌卫星细胞,使用RT-PCR方法检测rhBMP7 mRNA的表达情况。结果成功地构建了逆转录病毒真核表达载体,逆转录病毒介导rhBM7基因转染的骨骼肌卫星细胞能有效地表达外源性rhBMP7 的mRNA。结论采用逆转录病毒介导的方法可将rhBMP7转染至骨骼肌卫星细胞中,目的基因可在mRNA水平有效表达。     

逆转录病毒介导的人抗肌萎缩蛋白小基因在mdx鼠骨髓间充质干细胞的表达

目的构建含有人抗肌萎缩蛋白小基因的逆转录病毒载体并检测经逆转录病毒介导基因转移的假肥大型肌营养不良模型小鼠(mdx)骨髓间充质干细胞(MSCs)中目的基因的表达。方法构建含有抗肌萎缩蛋白小基因的逆转录病毒载体,利用脂质体介导的基因转移技术转染包装细胞PA317,制备含有目的基因的重组逆转录病毒并感染mdx鼠的MSCs,利用免疫荧光、RT-PCR法检测目的基因的表达。结果成功构建了抗肌萎缩蛋白小基因的逆转录病毒载体。含抗肌萎缩蛋白小基因的逆转录病毒感染mdx鼠MSCs后48h,RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳出现319bp DNA片断;免疫荧光检测显示感染组mdx鼠MSCs中可见红色颗粒,深浅不一。结论采用逆转录病毒介导的方法可以将抗肌萎缩蛋白小基因转移至mdx鼠MSCs并表达。     

人重组骨形态发生蛋白Ⅲ在大肠杆菌中的表达及活性测定

本文报道了利用基因工程技术在大肠杆菌中表达人重组骨形态发生蛋白Ⅲ。运用ＰＣＲ技术，从质粒ｐＳＰ６４／ｈＢＭＰ３中扩增出约０．３３ｋｂ的ｈＢＭＰ３ｃＤＮＡ片断，然后亚克隆到表达质粒ｐＭＳ３１ｂ申，在大肠杆菌一成功地高效表达出人ＢＭＰ３融合蛋白，表达产物具有体内诱导异位化骨的趋势。     

逆转录病毒介导人重组骨形态发生蛋白基因转染骨骼肌卫星细胞mRNA的表达

目的：探讨逆转录病毒介导重组人骨形态发生蛋白7（recombinant human bone morphogenetic protein7,rhBMP7)基因转染骨骼肌卫星细胞的可行性及目的基因的表达情况。方法：体外获取和培养大鼠骨骼肌卫星细胞，构建rhBMP7逆转录病毒载体，利用脂质体介导的基因转移技术转染包装细胞PT67，经G418筛选后，制备含目的基因和重组逆转录病毒液，病毒液感染骨骼肌卫星细胞，使用RT－PCR方法检测rhBMP7 mRNA的表达情况。结果：成功地构建了逆转录病毒真核表达载体，逆转录病毒介导rhBM7基因转染的骨骼肌卫星细胞能有效地表达外源性rhBMP7的mRNA。结论：采用逆转录病毒介导的方法可将rhBMP7转染至骨骼肌卫星细胞中，目的基因可在mRNA水平有效表达。     

反转录病毒载体介导的人β—珠蛋白基因在小鼠体内整合和表达的？…

OBJECTIVE: To examine the in vivo properties of retroviral recombinants carrying partially deleted human beta-globin gene (delta beta) and truncated erythroid enhancer (292 bp and 341 bp of 5'HS2) at the mRNA levels following short- and long-term reconstitution in mice with infected marrow cells. METHODS: First ecotropic virus producer cell lines with higher virus titers were isolated using "ping-pong" procedures. Then the human beta-globin gene was transferred into murine hematopoietic progenitor cells and the integration and expression of transferred gene were analyzed by southern blot and RNase protection assay or RT-PCR. RESULTS: The virus titers of both recombinants increased obviously after "ping-pong" procedures. The transferred human beta-globin gene was detected in murine CFU-S12 and the expression level was about 0.5%-5% of endogenous mouse alpha-globin gene. In 3 of 14 mice surviving long-term transplanted with bone marrow cells transduced with high-titer virus, bone marrow, spleen and thymus from two mice and bone marrow and spleen from another mouse contained the intact proviral genome. Long-term expression of the transferred gene was seen in one mouse at level of 7% of endogenous murine alpha-globin gene. CONCLUSIONS: The transferred human beta-globin gene can stably integrate into murine hematopoietic stem cells mediated by retroviral vectors and express in an erythroid-specific manner.     

腺病毒和慢病毒载体感染骨髓间质干细胞的比较

目的比较腺病毒和慢病毒载体感染骨髓间质干细胞（rMSCs）的荧光病毒基因表达的稳定性及持续时间。方法将含有绿色荧光蛋白（GFP）基因的慢病毒载体质粒同辅助质粒一起共感染293T细胞,重组包装;将慢病毒和腺病毒载体分别感染rMSCs,培养5周,分别在1、3、5周通过流式细胞仪检测GFP的表达情况。从GenBank中调出人骨形态发生蛋白2（hBMP2）基因序列,设计带有NheⅠ、AgeⅠ双酶切位点引物。从人肝脏组织中抽提总RNA,再逆转录成cDNA,扩增出hBMP2基因的全长序列。测序验证后克隆到慢病毒载体pHIV-CS-CDF-CG-PRE上,通过PCR扩增、酶切、测序等方法鉴定重组慢病毒载体。将该重组慢病毒载体质粒同辅助质粒一起共感染293T细胞,通过重组而包装成能表达hBMP2基因的有活性的慢病毒。结果两种病毒载体感染后1周,绿色荧光蛋白表达分别是90％和71％,到5周时,慢病毒载体的绿色荧光蛋白表达明显高于腺病毒载体,分别是79％和0．05％。扩增出1．2kb左右的hBMP2全长基因与GeneBank中的hBMP2阅读框架序列完全一致;成功克隆和构建了含hBMP2基因的慢病毒载体pHIV-hBMP2;对慢病毒载体进行了成功包装和分析。结论含hBMP2基因的慢病毒载体可成功构建。慢病毒载体对大鼠骨髓间质干细胞的转染效率明显优于腺病毒载体。     

昆虫杆状病毒表达系统中人骨形成蛋白3的表达及鉴定

探索人骨形成蛋白在昆虫杆状病毒系统中的表达规律。方法将ｈＢＭＰ３全长ｃＤＮＡ克隆入转移载体ＢａｃＰＫ８中,酶切鉴定后,将此载体与病毒ＤＮＡ经脂质体包裹转染昆虫细胞,重组病毒经蓝白选后,提取其ＤＮＡ进行ＰＣＲ反应,鉴定目的基因。收集重组病毒感染５ｄ的细胞进行免疫荧光及电子显微镜观察。结果克隆了目的基因的重组载体经内切酶消化后,琼脂糖电泳示有相应大小的目的基因片段切下,ＰＣＲ电泳结果见有目的基因片段的