miR-221与miR-222通过靶基因TIMP3调控胶质瘤细胞侵袭能力

目的 探讨miR-221和miR-222在胶质瘤细胞侵袭过程中的作用及其机制.方法 采用反义寡核苷酸下调miR-221和miR-222表达,Transwell、Western blot、荧光素酶实验及体内实验分别检测细胞侵袭能力、体内肿瘤生长、相关基因蛋白表达变化及靶基因鉴定.结果 下调miR-221和miR-222表达能明显抑制胶质瘤细胞侵袭能力,同时相关侵袭蛋白MMP2和MMP9表达下降.miRNA靶基因预测软件分析、Western blot、荧光素酶实验证实TIMP3是miR-221和miR-222的靶基因.裸鼠皮下肿瘤模型显示下调miR-221和miR-222表达抑制体内肿瘤生长.免疫组化发现TIMP3表达上调,MMP2和MMP9表达下调.结论 在胶质瘤细胞中,侵袭相关蛋白TIMP3是miR-221和miR-222的一个新靶基因.

Abstract：

Objective To investigate the role and mechanism of miR -221 and miR -222 in glioma cell invasion. Method After reduction of miR -221 and miR -222 by antisense oligonucleotides, cell invasion,invasion related - gene expression and target identification were determined by Transwell assay, Western blot analysis and luciferase reporter assay,respectively. Moreover,the effects of miR -221 and miR -222 on xenograft tumors in nude mice were also observed. Results Down - regulation of miR - 221 and miR - 222 decreased glioma cell invasion in vitro, and inhibited glioma growth in a subcutaneous mouse model. Furthermore,down -regulation of miR -221 and miR - 222 resulted in obvious inactivation of MMP2 and MMP9. Western blot analysis and luciferase reporter assay showed that the reduction of miR - 221 and miR -222 repressed TIMP3 protein expression and TIMP3 mRNA 3'UTR existed the biding sites of miR -221 and 222. Conclusions TIMP3 is a novel target of miR -221 and miR -222 in glioma cell invasion.     

siRNA干扰整合素α_vβ_3表达抑制脑胶质瘤细胞U251增殖的实验研究

目的 探索特异性siRNA靶向干扰恶性胶质瘤U251细胞中INTα_vβ_3表达后对细胞生长的作用.方法 将INTα_vβ_3特异性siRNA经脂质体(LipofectamineTM~(2000))转染U251细胞.RT-PCR、免疫细胞化学和Western blot法检测INTα_vβ_3蛋白表达.MTT检测干扰后细胞增殖变化.结果 INTα_vβ_3特异siRNA对U251细胞增殖有明显抑制作用.siRNA组、脂质体组与对照组各时间点的结果 差异有统计学意义.免疫细胞化学对照组和脂质体组均见INTα_vβ_3呈绿色表达,siRNA组表达降低.Western blot法和RT-PCR结果 证实转染特异siRNA后的细胞在蛋白及mRNA水平均能抑制INTα_vβ_3的表达.结论 特异性siRNA可干扰INTα_vβ_3在脑胶质瘤U251细胞中的表达并抑制细胞增殖.     

实时荧光定量RT-PCR法测定脑胶质瘤中MT1-MMP基因mRNA表达水平

目的探讨胶质瘤恶性程度和MT1-MMP基因mRNA表达水平的关系。方法采用实时荧光定量RT-PCR法检测34例脑胶质瘤和7例正常脑组织（取自癫痫病人手术切除脑组织）中MT1-MMP的mRNA表达水平。结果经实时荧光定量RT-PCR法检测，正常脑组织和低级别、高级别胶质瘤的△△Ct（循环阈值）值分别为（0．834±0、517）、（4．063±2．309）和（7.072±4．072）。正常脑组织与低级别、高级别胶质瘤之间，低级别、高级别胶质瘤之间MT1-MMP基因mRNA表达水平的差异具有统计学意义（P〈0．05）。结论脑胶质瘤中存在MT1-MMP基因mRNA高水平的表达，随着肿瘤恶性级别的增加，MT1-MMP基因mRNA表达水平有增高趋势。     

隔蛋白7对胶质瘤细胞系U251细胞周期的影响

目的 检测SEVT7对胶质瘤细胞系U251的细胞周期、增殖、侵袭以及凋亡的影响.方法 流式细胞术分析转染SEPT7对细胞周期的影响,Western blot检测细胞周期因子表达变化,MTT法和Annexin V法评价SEFT7对U251细胞的增殖活性和凋亡的影响,Martrigel三维立体培养分析转染SEPT7后U251细胞侵袭能力的变化.结果 SEPT7使U251细胞G0/G1期阻滞,S期细胞比例(SPF)降低,增殖活性和侵袭能力明显受到抑制,并可诱发细胞凋亡.结论 SEPT7抑制U251细胞侵袭、增殖,促进凋亡.结果 提示,SEPT7是对胶质瘤具有抑制作用的基因.     

人脑胶质瘤MMP2/TIMP2与肿瘤血管的相关性分析

目的探讨人脑胶质瘤中的基质金属蛋白酶2(MMP2)、金属蛋白酶2组织抑制剂(TIMP2)与血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(VEGFR)表达的相关性,分析其在肿瘤血管形成中的作用。方法应用免疫组化SP法检测40例脑胶质瘤及12例正常脑组织中MMP2、TIMP2、VEGF、VEGFR1、和VEGFR 2蛋白的表达。结果 MMP2、VEGF、VEGFR1和VEGFR2蛋白表达的免疫反应评分(IRS)在胶质瘤中明显升高,TIMP2蛋白表达的免疫反应评分(IRS)在胶质瘤中明显降低,差异有统计学意义(P0.05);胶质瘤组中MMP2与VEGFR2、TIMP2蛋白表达的免疫反应分数显著相关(r=0.396,P0.01;r=0.317,P0.05)。结论 MMP2/TIMP2可能通过影响VEGFR-2介导的信号转导途径调控胶质瘤肿瘤血管生成。     

HIF-1α、整合素αvβ3与脑胶质瘤血管生成相关性研究

胶质瘤是最常见的颅内恶性肿瘤,具有侵袭性生长的生物学特性,而肿瘤的生长必需依赖新生血管的生成.目前认为缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、整合素αvβ3在肿瘤血管形成和肿瘤侵袭性生长过程中起到了极其重要的作用.缺氧是实质性肿瘤物理微环境的基本特征之一,在缺氧条件下,HIF-1α参与编码多种肿瘤血管生成因子的基因转录,促进肿瘤血管生成[1];整合素αvβ3介导的黏附行为和信号传导,在肿瘤的发生、发展、新血管生成、侵袭性生长等阶段亦发挥重要的作用.     

IFN-β裸DNA对人脑胶质瘤生长的抑制作用

目的探讨β干扰素(IFN-β)基因对人脑胶质瘤生长的抑制作用,以及人IFN-β裸DNA治疗人脑胶质瘤的可行性.方法建立裸鼠SHG44胶质瘤模型,用脂质体包埋法将含IFN-β基因的真核表达载体(pSV2IFN β)注入裸鼠皮下SHG44脑胶质瘤,观察肿瘤生长情况并计算肿瘤体积,通过免疫组化、原位末端转移酶标记(TUNEL)染色以及瘤体坏死区计数检测,了解IFN-β基因对人脑胶质瘤生长的抑制作用.结果 IFN-β在荷瘤裸鼠瘤体内获得表达,裸鼠皮下胶质瘤生长受到抑制,并诱导SHG44胶质瘤细胞凋亡.结论 IFN-β裸DNA能够抑制人脑胶质瘤生长,该实验为IFN-β基因治疗人脑胶质瘤的应用奠定了初步基础.     

应用siRNA敲低MMP-9基因表达后对人U251胶质瘤细胞增殖和侵袭的作用

目的 研究siRNA靶向抑制MMP-9基因对U251细胞的增殖和侵袭的抑制作用.方法 采用oligofectamine转染试剂将siRNA导入到胶质瘤细胞U251,分别采用半定蕈PCR及Western blotting从mRNA和蛋白水平检测干扰效果;采用细胞生长曲线、MTT和流式细胞法检测siRNA对细胞增殖的影响,应用2D、3D生长实验(Two,three-dimensional growth experiment)和Transwell实验检测转染MMP-9 siRNA后对细胞侵袭的影响.结果 半定量PCR以及Western blotting显示MMP-9基因的mRNA转录水平以及蛋白水平的表达均得到抑制;细胞生长曲线、MTT检测及流式细胞仪检测结果显示MMP-9基因表达被抑制后,U251细胞增殖率明显受到抑制,2D、3D生长实验和Transwell侵袭实验证实转染后U251细胞体外侵袭能力明显降低(P＜0.01).结论 应用siRNA敲低胶质瘤细胞MMP9基因表达后,胶质瘤细胞的侵袭和增殖能力明显下降.     

VEGF、MMP-2与人脑胶质瘤的病理分级和侵袭性的相关研究

目的　研究血管内皮生长因子 (VEGF)和基质金属蛋白酶 2 (MMP 2 )在人脑不同级别胶质瘤中的表达。探讨VEGF、MMP 2与肿瘤病理级别和侵袭性的关系。方法　采用免疫组织化学 (SP)法检测 5 6例脑胶质瘤中VEGF、MMP 2的表达。结果　胶质瘤中VEGF、MMP 2的表达水平在高级别组 (Ⅲ、Ⅳ级 )明显高于低级别组 (Ⅰ、Ⅱ级 ) ,两组间有显著性差异 (P <0 .0 5 )。结论　VEGF、MMP 2在胶质瘤的血管生成与侵袭性生长中起重要作用 ,其表达水平与胶质瘤的病理级别有密切关系。     

人脑胶质瘤表皮生长因子受体表达及与增殖和侵袭相关性的研究

目的 探讨胶质瘤细胞EGFR基因表达以及和肿瘤细胞增殖及侵袭性生长的相互关系。方法 应用免疫组化方法观察了6例正常脑组织、50例胶质瘤标本和2个恶性胶质瘤体外细胞系的EGFR、Ki67、MMP2和MMP9表达。结果 EGFR、Ki67、MMP2和MMP9在胶质瘤中的表达不同,正常脑组织和WHOⅡ级与Ⅲ、Ⅳ级肿瘤和体外细胞系之间的表达差异显著,且四者间的表达水平两两相关。结论 EGFR过表达可以引起Ki67、MMP2和MMP9的过表达,从而促进胶质瘤细胞的增殖和侵袭。     

人隔蛋白7的真核表达载体的构建及表达

目的 构建人隔蛋白7(SEPT7,hCDC10/SEPT7)的表达载体并对U251人脑恶性胶质瘤细胞系进行转染且检测其表达.方法 RT-PCR方法扩增SEPT7 cDNA片段,并将扩增的片段插入pCDNA3真核表达载体,构建成含SEPT7cDNA的重组载体pCDNA3/SEPT7,以脂质体介导该质粒转染人脑恶性胶质瘤细胞系U251,应用RT-PCR和免疫荧光染色鉴定转染细胞中hCDC10/SEPT7的表达.用流式细胞术对转染前后的U251细胞进行细胞周期分析.结果 成功构建含SEPT7cDNA的重组载体pCDNA3/SEPT7,并使其稳定转染U251细胞,在转染的细胞中,证实有SEPT7mRNA表达上调.细胞周期检测结果G0/G1期细胞增多,SPF降低.结论 成功构建SEPT7表达载体,并在人脑恶性胶质瘤细胞系获得表达,延迟细胞周期进展.     

RNA干扰联合抑制PI3KP85和AKT1表达对U251胶质瘤细胞侵袭的影响

目的 探讨应用RNA干涉(RNAi)技术抑制U251恶性胶质瘤细胞丝/苏氨酸蛋向激酶1(AKT1)和3-羧基磷脂酰肌醇激酶的85000催化亚基(P13KP85)表达后对U251胶质瘤细胞侵袭的抑制作用.方法 实验设正常对照组(未做任何处理);阴性对照组(rAd-HK组):用无义序列重组腺病毒感染U251胶质瘤细胞;基凶治疗组(rAd-A+P组):用靶向AKT1和P13KP85的重组腺病毒感染U251胶质瘤细胞.应用实时PCR检测AKT1和P13KP85 mRNA水平的变化;应用Western blot方法 检测AKT1和P13KP85蛋白水平的变化,并对肿瘤细胞中相关功能蛋白的表达进行分析;应用酶联免疫分析法(ELISA)检测细胞外基质金属蛋白酶2(MMP2)和基质金属蛋白酶9(MMP9)浓度的变化;应用划痕和Transwell实验评价肿瘤细胞侵袭能力的变化.结果tAd-A+P 可显著抑制U251胶质瘤细胞AKT1和P13KP85的表达.与正常对照组和rAd-HK组比较.rAd-A+P组MMP2、MMP9表达下降,而基质金属蛋白酶抑制因子(TMP2)表达上调,差异有统计学意义(P<0.05).划痕和Transwell实验显示rAd-A+P组细胞体外侵袭能力明显减弱.结论 靶向AKT1和P13KP85的RNAi技术可以显著抑制U251胶质瘤细胞AKT1和PDKP85表达,对U251胶质瘤细胞的侵袭能力产生明显抑制作用.     

RNA干扰联合抑制PI3KP85和AKT1表达对U251胶质瘤细胞侵袭的影响

目的 探讨应用RNA干涉(RNAi)技术抑制U251恶性胶质瘤细胞丝/苏氨酸蛋向激酶1(AKT1)和3-羧基磷脂酰肌醇激酶的85000催化亚基(P13KP85)表达后对U251胶质瘤细胞侵袭的抑制作用.方法 实验设正常对照组(未做任何处理);阴性对照组(rAd-HK组):用无义序列重组腺病毒感染U251胶质瘤细胞;基凶治疗组(rAd-A+P组):用靶向AKT1和P13KP85的重组腺病毒感染U251胶质瘤细胞.应用实时PCR检测AKT1和P13KP85 mRNA水平的变化;应用Western blot方法 检测AKT1和P13KP85蛋白水平的变化,并对肿瘤细胞中相关功能蛋白的表达进行分析;应用酶联免疫分析法(ELISA)检测细胞外基质金属蛋白酶2(MMP2)和基质金属蛋白酶9(MMP9)浓度的变化;应用划痕和Transwell实验评价肿瘤细胞侵袭能力的变化.结果tAd-A+P 可显著抑制U251胶质瘤细胞AKT1和P13KP85的表达.与正常对照组和rAd-HK组比较.rAd-A+P组MMP2、MMP9表达下降,而基质金属蛋白酶抑制因子(TMP2)表达上调,差异有统计学意义(P<0.05).划痕和Transwell实验显示rAd-A+P组细胞体外侵袭能力明显减弱.结论 靶向AKT1和P13KP85的RNAi技术可以显著抑制U251胶质瘤细胞AKT1和PDKP85表达,对U251胶质瘤细胞的侵袭能力产生明显抑制作用.     

RNA干扰联合抑制PI3KP85和AKT1表达对U251胶质瘤细胞侵袭的影响

目的 探讨应用RNA干涉(RNAi)技术抑制U251恶性胶质瘤细胞丝/苏氨酸蛋向激酶1(AKT1)和3-羧基磷脂酰肌醇激酶的85000催化亚基(P13KP85)表达后对U251胶质瘤细胞侵袭的抑制作用.方法 实验设正常对照组(未做任何处理);阴性对照组(rAd-HK组):用无义序列重组腺病毒感染U251胶质瘤细胞;基凶治疗组(rAd-A+P组):用靶向AKT1和P13KP85的重组腺病毒感染U251胶质瘤细胞.应用实时PCR检测AKT1和P13KP85 mRNA水平的变化;应用Western blot方法 检测AKT1和P13KP85蛋白水平的变化,并对肿瘤细胞中相关功能蛋白的表达进行分析;应用酶联免疫分析法(ELISA)检测细胞外基质金属蛋白酶2(MMP2)和基质金属蛋白酶9(MMP9)浓度的变化;应用划痕和Transwell实验评价肿瘤细胞侵袭能力的变化.结果tAd-A+P 可显著抑制U251胶质瘤细胞AKT1和P13KP85的表达.与正常对照组和rAd-HK组比较.rAd-A+P组MMP2、MMP9表达下降,而基质金属蛋白酶抑制因子(TMP2)表达上调,差异有统计学意义(P<0.05).划痕和Transwell实验显示rAd-A+P组细胞体外侵袭能力明显减弱.结论 靶向AKT1和P13KP85的RNAi技术可以显著抑制U251胶质瘤细胞AKT1和PDKP85表达,对U251胶质瘤细胞的侵袭能力产生明显抑制作用.     

Bimodal anti‐glioma mechanisms of cilengitide demonstrated by novel invasive glioma models

Integrins are expressed in tumor cells and tumor endothelial cells, and likely play important roles in glioma angiogenesis and invasion. We investigated the anti‐glioma mechanisms of cilengitide (EMD121974), an αvβ3 integrin inhibitor, utilizing the novel invasive glioma models, J3T‐1 and J3T‐2. Immunohistochemical staining of cells in culture and brain tumors in rats revealed positive αvβ3 integrin expression in J3T‐2 cells and tumor endothelial cells, but not in J3T‐1 cells. Established J3T‐1 and J3T‐2 orthotopic gliomas in athymic rats were treated with cilengitide or solvent. J3T‐1 gliomas showed perivascular tumor cluster formation and angiogenesis, while J3T‐2 gliomas showed diffuse single‐cell infiltration without obvious angiogenesis. Cilengitide treatment resulted in a significantly decreased diameter of the J3T‐1 tumor vessel clusters and its core vessels when compared with controls, while an anti‐invasive effect was shown in the J3T‐2 glioma with a significant reduction of diffuse cell infiltration around the tumor center. The survival of cilengitide‐treated mice harboring J3T‐1 tumors was significantly longer than that of control animals (median survival: 57.5 days and 31.8 days, respectively, P < 0.005), while cilengitide had no effect on the survival of mice with J3T‐2 tumors (median survival: 48.9 days and 48.5, P = 0.69). Our results indicate that cilengitide exerts a phenotypic anti‐tumor effect by inhibiting angiogenesis and glioma cell invasion. These two mechanisms are clearly shown by the experimental treatment of two different animal invasive glioma models.     

贝伐珠单抗联合高压氧治疗小鼠胶质母细胞瘤的效果

目的 探讨贝伐珠单抗（Bev）联合高压氧（HBO）对小鼠胶质母细胞瘤（GBM）的治疗作用。方法 体外培养U251细胞,随机分为对照组、Bev组（Bev作用24 h）、HBO组（HBO治疗1次）和Bev+HBO组（Bev作用24 h后,接受HBO治疗1次）,采用MTT法检测细胞增殖能力,采用划痕实验和Transwell小室实验检测细胞迁移和侵袭能力。取100只雄性BALB/c裸鼠,右侧纹状体注射U251细胞建立GBM模型,造模后7 d随机分为对照组（腹腔注射PBS,3次/周,连续2周）、Bev组（腹腔注射Bev,5 mg/kg,3次/周,连续2周）、HBO组（HBO治疗,1次/d,连续2周）、Bev+HBO组（同时接受Bev和HBO处理2周）;每组取10只小鼠记录生存时间;每组取5只小鼠,HE染色测定肿瘤体积;每组取5只小鼠,CD34免疫组化染色测定肿瘤组织微血管密度（MVD）;每组取5只小鼠,PCR检测肿瘤组织基质金属蛋白酶（MMP）9 mRNA表达水平。结果 Bev对U251细胞增殖能力无明显影响（P>0.05）,明显增强U251细胞迁移和侵袭能力（P<0.01）;明显降低肿瘤组织MVD（P<0.05）,明显增加肿瘤组织MMP9 mRNA表达水平（P<0.05）,但对荷瘤小鼠肿瘤体积及生存时间无明显影响（P>0.05）。HBO明显抑制U251细胞增殖、迁移、侵袭能力（P<0.01 ）,明显降低荷瘤小鼠肿瘤组织MMP9 mRNA表达水平（P<0.01）,但对荷瘤小鼠生存时间、肿瘤体积及肿瘤组织MVD均无明显影响（P>0.05）。Bev联合HBO明显抑制U251细胞增殖、侵袭和迁移能力,明显降低荷瘤小鼠肿瘤组织MVD和MMP9 mRNA水平（P<0.05）,明显缩小肿瘤体积（P<0.05）,明显延长荷瘤小鼠的生存时间（P<0.01）。结论 单独应用Bev或HBO对GBM小鼠肿瘤体积及生存时间无明显影响,但Bev联合HBO明显抑制小鼠GBM生长,明显延长小鼠生存时间。     

脑胶质瘤细胞体外促进人骨髓间充质干细胞肿瘤相关基因表达

目的观察与人脑胶质瘤细胞共培养后的人骨髓间充质干细胞(human bone marrow-derived mesenchymal stromal cells,h MSCs)中肿瘤相关基因表达的变化,初步评估h MSCs在人脑胶质瘤环境中的生物安全性在致瘤性方面的风险。方法将h MSCs与人脑胶质瘤细胞U251于体外共同培养5d后,通过肿瘤基因芯片、实时定量RT-PCR及Western-blot实验检测h MSCs中肿瘤相关基因表达水平的变化。结果基因芯片结果显示,与单独培养的h MSCs对比,与人脑胶质瘤细胞U251共同培养后的h MSCs中存在SPINT2、TK1、STC1、MMP1、CCND1、SORT1、SEPT6、CDC20、SHB、CDK5、RELA、XRCC4、KIT、CTPS、CAPNS1及ETV6等16个肿瘤相关基因的表达明显上调(3倍以上),而无一基因表达下调;实时定量RT-PCR结果显示癌基因KIT、CAPNS1、TK1、MMP1、CCND1、CDC20、RELA以及STC1在共培养组h MSCs中呈表达上调;Western-blot结果显示癌基因KIT、MMP1、CCND1以及RELA的蛋白水平在共培养组h MSCs中呈表达上调。结论 h MSCs在脑胶质瘤细胞的影响下可出现部分癌基因的高度表达,提示了对于h MSCs应用于对脑胶质瘤进行基因治疗的生物安全性在致瘤性方面的风险需引起关注及深入研究。