普马拉病毒核蛋白基因片段原核表达及产物纯化

目的通过原核表达获得普马拉病毒重组核蛋白。方法采用RT-PCR方法,从感染普马拉病毒的鼠肺标本中扩增得到编码核蛋白1-117 aa的基因片段。将截短的核蛋白基因片段插入原核表达载体PQE30构建重组质粒,转化至大肠杆菌M15,经IPTG诱导表达,利用N i-NTA Agarose对表达产物进行纯化。结果重组蛋白得到了高效表达。表达产物分子量15 000,在菌体中主要以可溶性蛋白形式存在。通过亲和层析,得到了纯化的重组蛋白。结论普马拉病毒重组核蛋白基因片段得到了有效表达。     

汉坦病毒核蛋白核心区域高效表达及产物鉴定

汉坦病毒是引起肾综合征出血热（HFRS）的主要病毒,汉坦病毒的基因由L、M、S三个片段构成,分别编码病毒RNA聚合酶,囊膜核蛋白G1和G2及核衣壳蛋白（简称核蛋白,Nucleocapsid Protein,NP）。血清学研究表明,汉坦病毒核蛋白具有很强的抗原性和免疫原性,同时NP抗原可以与汉坦病毒内的多种血清型病毒的免疫血清产生交叉反应,表明汉坦病毒的NP具有共同的抗原决定族。有鉴于此,我们对核蛋白的核心区域进行表达和纯化,并用SDS-PAGE和Western-Blotting对重组核蛋白进行鉴定,为其应用于诊断抗原提供技术依据。[第一段]     

北海道型汉坦病毒核蛋白基因的克隆表达及其免疫原性

目的 构建北海道型汉坦病毒(HOKV)核蛋白(NP)基因的重组杆状病毒表达载体,在昆虫细胞中表达出具有免疫原性的抗原,用于HOKV的检测及诊断.方法 应用RT-PCR方法扩增HOKVFusong-Cr-247株的NP基因,并将该基因片段克隆到PCR[R]2.1TA载体,转化到One ShortTM TOP10感受态细胞构建TA克隆载体,并与pFastBacTM1转座质粒载体分别用Kpn I和Not I双酶切,用T4连接酶连接,构建pFast PUUV-S重组转座质粒,经双酶切、PCR扩增及插入序列方向鉴定后.转化到DH10BacTM E.coli 感受态细胞,经三抗培养基筛选和PCR扩增鉴定后获得重组Bacmid质粒,将重组Baemid质粒转染Sf9昆虫细胞制备重组杆状病毒毒液,并继续扩增重组杆状病毒,以第三代毒液感染Sf9昆虫细胞,96h后收获细胞.用间接免疫荧光(IFA)、SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定和分析.结果 实验应用Bac-to-BacTM杆状病毒表达系统,成功构建了含普马拉类汉坦病毒核蛋白基因的重组杆状病毒表达载体.并在昆虫细胞中获得表达.IFA结果显示,感染细胞的胞浆中有亮绿色荧光颗粒,SDS-PAGE和Western blot检测细胞表达产物的50×103(M)的蛋白条带,证实重组病毒感染昆虫细胞后表达了相应的重组核蛋白,与预计的结果相符.并能与抗汉坦病毒抗体结合.结论 成功表达具有HOKV免疫原性及反应性的重组核蛋白,为研制HOKV的诊断试剂奠定了基础.     

汉坦病毒核蛋白及其单抗标记物在建立ELISA试剂中的应用

[目的]利用重组汉坦病毒核蛋白及其单克隆抗体的酶标记物建立IgM捕获ELISA诊断试剂。[方法]制备、纯化重组核蛋白抗原和抗核蛋白单抗并进行辣根过氧化物酶标记，在抗人μ链包被板中结合四甲基联苯胺-过氧化氢（TMB／H2O2）酶底物系统，从血清中检测肾综合征出廊热早期特异性IgM抗体，并与免疫荧光抗体法（IFA）进行比较。[结论]检测42份可疑HFRS病人血清，ELISA法和IFA法均阳性的20份，均阴性的19份；ELISA法阴性、IFA法阳性的1份，ELISA法阳性、IFA法阴性的2份，2种方法的差异无统计学意义（配对x^2=0．08，P〉0．05）。[结论]用重组汉坦病毒核蛋白及其单克隆抗体的酶标记物建立IgM捕获ELISA诊断试剂可用于HFRS的早期IgM抗体检测。     

汉坦病毒核蛋白在免疫荧光诊断技术中的应用

目的从国内生产肾综合征出血热（HFRS）疫苗Z10株中克隆汉坦病毒核蛋白基因,应用杆状病毒-昆虫细胞表达系统使其在昆虫细胞中表达,制成抗原片,用于检测血清中汉坦病毒抗体.方法从汉坦病毒Z10株感染细胞上清液中提取病毒RNA,应用RT-PCR方法扩增S基因,与穿梭质粒连接并转化大肠杆菌,得到重组穿梭质粒.将其转化含杆状病毒基因组的大肠杆菌,筛选出含S基因的重组杆状病毒DNA的大肠杆菌,提取重组杆状病毒DNA转染昆虫细胞,应用ELISA法及间接免疫荧光法检测重组蛋白的抗原性.结果用RT-PCR方法扩增得到S基因,筛选出的重组杆状病毒感染细胞sf9,制成抗原片.此抗原片仅与HFRS阳性患者血清起反应,而与正常人及其它发热患者血清不起反应.检测浙江省各医院送检的97份疑似肾综合征出血热患者血清及36份正常人血清,与传统的抗原片比较,阳性符合率为100%.结论可以应用杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达汉坦病毒重组蛋白.以此制备的抗原片,可用于患者血清中汉坦病毒抗体检测,具有特异性强、敏感性高,试剂制备简单、安全,为诊断肾综合征出血热提供新的途径和手段.     

人胰岛素生长因子1的原核表达及其单克隆抗体的制备

目的原核表达、纯化人胰岛素样生长因子1（hIGF-I）,并制备其单克隆抗体（mAb）。方法通过RT-PCR方法从人体肝脏组织中扩增得到hIGF-I基因片段,构建重组原核表达质粒pET-28a（＋）/hIGF-I,在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达。将表达蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠,取其脾脏和小鼠杂交瘤细胞融合制备针对hIGF-I的特异性单克隆抗体。结果成功表达出了hIGF-I蛋白。SDS-PAGE电泳显示所表达蛋白质的相对分子量（Mr）大小约为18 KD。获得了1株能够稳定表达抗hIGF-I抗体的杂交瘤细胞株（8F2）,其分泌的mAb的IgG亚类（型）为IgG2b,ELISA检测,对应腹水mAb的效价分别为1∶7.5×10^5。Western-blot结果显示抗hIGF-I mAb具有良好的特异性。结论成功制备了抗hIGF-I mAb,为进一步研究IGF-I在肿瘤治疗中的作用提供了有力的工具。     

汉坦病毒核蛋白基因表达及产物抗原活性的研究

为了制备肾综合征出血热（ ＨＦＲＳ） 诊断用基因工程抗原,构建了合汉坦病毒７６１１８ 株编码核蛋白（ ＮＰ） 基因片段的重组质粒ｐＢＶ２２０Ｈ１－３Ｓ, 经转化大肠杆菌和诱导表达,ＳＤＳＰＡＧＥ 显示菌体中有分子量约为４８ ＫＤ 的新蛋白质生成。用经包含体纯化获得的表达产物做抗原,以间接酶联免疫（ＥＬＩＳＡ） 检测了４８ 份疑似出血热患者的血清特异性ＩｇＧ,其结果与经典的间接免疫荧光（ＩＦＡ） 检测的阴性、阳性及总符合率分别为１００ ％ 、９２－８６ ％ 和９３－７５ ％ 。证实该重组ＮＰ 具有良好的生物活性和诊断抗原价值     

汉坦病毒单克隆抗体的制备和鉴定

本文用汉坦病毒A16和R22株活毒免疫BALB／c小鼠，取牌细胞与sp2／0骨髓瘤细胞融合，制备了6株分泌抗汉坦病毒单克隆抗体的杂交癌细胞系。单克隆抗体IgG亚类鉴定表明，其中2株为IgG1，1株为IgG2b，3株为IgG2a。用间接免疫荧光检测单抗腹水滴度，分别在1：10240～1：81920之间；用反向被动血凝抑制试验测定单抗腹水，滴度均低于1：20。免疫印迹试验表明，6株单克隆抗体均为抗核蛋白单抗。对已知型别病毒的反应话表明，其中3株为组特异性单抗，1株为汉滩型特异性单抗，2株为汉城型特异性单抗。还用6株单抗对宁夏新分离毒株进行抗原性分析。     

汉坦病毒核蛋白的重组表达及其免疫印迹法在肾综合征出血热血清抗体检测中的应用

目的 应用基因工程技术,在昆虫细胞中表达汉坦病毒（HV）S基因,表达产物作为诊断抗原,用于检测血清中抗HV特异性抗体IgG。方法 PCR扩增HV-Z10株N蛋白（NP）编码基因,基因工程方法构建NP编码基因昆虫表达系统 rBAC-Z10S-TN。间接荧光法了解重组NP（rNP）表达及与特异性免疫反应情况,SDS-PAGE观察重组蛋白表达情况。建立免疫印迹法检测肾综合征出血热（HFRS）患者血清样品,并与常规间接免疫荧光法进行比较。结果 rBAC-Z10S-TN高效表达rNP,SDS-PAGE显示rNP的蛋白表达带,此抗原仅与HFRS患者血清起反应。经双盲试验,两法检测血清143份,HFRS阳性符合率为97.67%。结论 成功构建了HV-Z10株NP编码基因高效真核表达系统。所建立的免疫印迹法可作为HFRS简便、安全、敏感、特异的血清学诊断新方法。     

H7N9亚型禽流感病毒核蛋白NP原核表达载体的构建与表达

目的构建甲型H7N9禽流感病毒NP基因的原核表达载体,并表达其编码重组蛋白。方法 RT-PCR法扩增H7N9病毒NP基因,克隆至原核表达载体PET28a(+)中,构建表达载体PET28a(+)-NP质粒;经PCR、双酶切、测序鉴定后,将PET28a(+)-NP质粒转化表达菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达NP重组蛋白。应用western blot法鉴定NP蛋白的表达。结果成功构建NP基因的原核表达载体,在大肠杆菌中表达出分子量为56kD的NP重组蛋白。结论实现了禽流感病毒H7N9NP重组蛋白在原核系统中的高效表达,为禽流感诊断试剂及单抗的研发工作奠定了基础。     

流感病毒M1单克隆抗体的制备及其生物学特征

目的 制备针对流感病毒基质蛋白M1的单克隆抗体(mAb),为研究流感病毒检测试剂盒提供实验材料.方法 以纯化的M1蛋白为免疫原,免疫Balb/c小鼠,将其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,筛选出分泌抗M1 mAb的杂交瘤细胞,注射小鼠腹腔获得M1 mAb,并用辣根过氧化物酶(HRP)标记M1 mAb.通过Western印迹法、ELISA、细胞感染免疫染色实验检测所获M1 mAb的作用和特性.结果 获得能稳定分泌抗流感病毒基质蛋白M1的杂交瘤细胞系,纯化腹水得到M1 mAb和HRP-M1 mAb.Western印迹法结果显示,M1 mAb和HRP-M1 mAb能与M1抗原及H1N1、H3N2亚型流感病毒的M1蛋白反应,是针对M1蛋白的mAb;利用ELISA方法研究M1 mAb和HRP-M1 mAb对M1抗原及流感病毒的检测作用,结果显示它们能检测H1N1和H3N2亚型的甲型流感病毒,而HRP-M1 mAb的检测能力比M1 mAb强;细胞免疫染色实验显示,M1 mAb能结合H1N1和H3N2亚型病毒感染的细胞.结论 针对M1蛋白的M1 mAb和HRP-M1 mAb已制备成功.它们能检测H1N1和H3N2亚型甲型流感病毒,有望应用于流感病毒诊断以及鉴别诊断试剂盒的研发.     

寨卡病毒NS1单克隆抗体制备及其在临床诊断中的应用

目的 用寨卡病毒非结构蛋白NS1免疫小鼠并制备鼠源单克隆抗体,建立捕获ELISA方法检测寨卡病毒NS1蛋白.方法 合成NS1基因序列构建真核表达载体pcDNA3.1-NS1,转染HEK293细胞收集上清,经Ni+柱亲和层析法纯化NS1蛋白.以纯化的NS1重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,取脾脏进行细胞融合,筛选阳性细...     

抗汉滩病毒McAb可变区基因克隆及序列分析

目的克隆和分析抗汉滩病毒单克隆抗体(McAb)H7可变区基因.方法根据鼠源抗体可变区(V)氨基酸序列,设计合成一组抗体重、轻链可变区(VH/VK)简并引物.采用一步法提取McAb H7细胞总RNA,通过RT-PCR扩增V基因,并进行核苷酸序列测定和分析.结果通过RT-PCR成功克隆了H7可变区重轻链基因,序列分析表明均为开放阅读框,符合小鼠抗体框架结构,含有明确的4个骨架区和3个抗原决定簇互补区,与抗体二硫键形成有关的两个特征性半胱氨酸亦高度保守.同源对比表明,H7-VK长357 bp,编码119个氨基酸,属JK4重排;H7-VH长360 bp,编码120个氨基酸,属JH4重排.经GenBank查询证实为新基因,登记号为AY245601和AY245602.结论 McAb H7可变区基因的获得,为有目的地开展HFRSV基因工程抗体的遗传改造及体外亲和力成熟等研究奠定了基础.     

人ZP3融合蛋白的原核表达

目的:在原核中表达人卵透明带蛋白3(zone pelluc ida,ZP3)。方法:将人ZP3基因的核心片段克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中。经酶切和序列分析后,用重组质粒转化大肠杆菌BL21,并经丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生GST-ZP3融合蛋白。结果:重组菌株明显诱导表达出预期分子质量为63 000 D的融合蛋白。结论:成功地构建GST-ZP3融合蛋白表达载体,并在大肠杆菌中表达GST-ZP3融合蛋白,为进一步开展免疫避孕与生殖免疫的研究奠定基础。     

HCCR重组蛋白的表达及其单克隆抗体的制备

目的:克隆人宫颈癌基因(human cervical cancer oncogene,HCCR)的C末端截短序列(膜外区序列),重组表达并纯化HCCR-C端蛋白,制备和初步鉴定针对HCCR-C端蛋白的单克隆抗体。方法:从人肝癌细胞株HepG2中提取总RNA,RT-PCR扩增出HCCR-C端,构建其原核表达质粒,表达HCCR-C融合蛋白,以纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,常规细胞融合和选择性培养,亚克隆筛选出分泌特异抗体的杂交瘤细胞株,制备单抗腹水,Western blot、细胞组化初步鉴定抗HCCR-C端单克隆抗体。结果:成功克隆了HCCR-C末端截短序列,原核表达并纯化了HCCR-C端重组蛋白;经ELISA双筛,获得3株能稳定分泌抗HCCR-C端单克隆抗体的杂交瘤细胞株;Western blot及细胞免疫荧光结果显示,其分泌抗体效价高且均能特异识别HCCR蛋白。结论:成功制备并初步鉴定了针对HCCR-C端的单克隆抗体,为深入研究HCCR蛋白的生物学功能和建立新的肝细胞癌早期诊断方法奠定了可靠基础。     

原核表达HPV16 L1蛋白ELISA方法检测血清抗体

目的:从感染人乳头瘤病毒(HPV)的新鲜宫颈癌组织中扩增HPV16型晚期蛋白L1基因全长,构建原核表达载体,表达并纯化蛋白用于ELISA检测。方法:根据基因序列设计一对特异引物,用PCR的方法从宫颈癌组织DNA中获得L1基因,以pet28a为载体构建表达质粒,IPTG诱导表达蛋白,DEAE及葡聚糖凝胶分离纯化目的蛋白,将蛋白包被平底96孔板用于ELISA检测。结果:从宫颈癌临床标本克隆到HPV16型L1蛋白编码序列,其原核表达产物纯化后可用于ELISA检测。结论:成功获得人有抗原性的HPV16 L1蛋白,可用于ELISA检测。     

江西省1株汉滩型汉坦病毒的分离与鉴定

目的 了解江西省啮齿动物携带的肾综合征出血热汉坦病毒的基因型别。方法 采用Vero-E6细胞对8份免疫荧光汉坦病毒抗原阳性鼠肺标本进行病毒分离,采用直接免疫荧光法和RT-PCR方法对培养物进行鉴定,对分离株部分M基因进行序列测定和分析。结果 1份标本培养后经直接免疫荧光试验检测到汉坦病毒特异性免疫荧光颗粒,培养物能在Vero-E6细胞中稳定传代,毒株命名为AYW89-15。毒株核酸经汉坦病毒M基因特异性分型引物进行RT-PCR检测,获得汉滩型汉坦病毒(Hantaan virus, HTNV)预期大小的目的片段;通过序列分析发现,分离株与HTNV参考株核苷酸同源性为83.1%～94.7%,氨基酸同源性为95.0%～99.0%,与汉城型等其他型别汉坦病毒核苷酸和氨基酸同源性均低于75%。进化树分析表明AYW89-15位于HTNV所在的枝系。 结论 新分离株AYW89-15为HTNV。     

发热伴血小板减少综合征患者核衣壳蛋白特异性IgM水平与病情严重程度的相关性

目的探讨核衣壳蛋白(N蛋白)特异性Ig M抗体水平与发热伴血小板减少综合征(SFTS)疾病病情严重程度的相关性。方法回顾性分析某三甲医院30例SFTS患者的临床特点及实验室检查结果,比较N蛋白特异性Ig M(+)组与N蛋白特异性Ig M(-)组患者的临床特点及预后转归;根据患者疾病严重程度分为轻症组和重症组,比较轻症组患者与重症组患者Ig M抗体滴度与发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV) RNA载量的相关性;从而观察分析N蛋白特异性Ig M抗体滴度、SFTSV-RNA载量与患者病情严重程度的相关性。结果 N蛋白特异性Ig M(-)组中有神经症状、死亡及病重例数均明显较Ig M(+)组多(均P 0. 05); N蛋白特异性Ig M抗体水平与SFTSV-RNA载量、凝血酶原时间(PT)、乳酸脱氢酶(LDH)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)均呈负相关(r值分别为-0. 495、-0. 440、-0. 367、-0. 280,均P 0. 05);而与血小板(PLT)呈正相关(r=0. 335,P=0. 002)。SFTSVRNA载量与PT、LDH、AST均呈正相关(r值分别为0. 606、0. 604、0. 587,均P 0. 001);而与PLT呈负相关(r=-0. 384,P 0. 001)。发病第10～13天时轻症组患者N蛋白特异性Ig M抗体滴度高于重症组患者(P 0. 05)。结论N蛋白特异性Ig M抗体的出现及滴度的升高有助于SFTSV的清除,且对患者凝血功能及肝损伤、心肌损伤有修复作用; N蛋白特异性Ig M抗体可能是预测患者预后的重要因素。