应用免疫组织化学S-100和α-肌动蛋白抗原鉴定组织工程软骨

背景：通常采用阿辛蓝染色技术鉴定软骨组织，然而对于组织工程软骨形成早期，阿辛蓝染色不能很好的显示细胞外基质的分泌情况。 目的：拟观察采用免疫组织化学法S-100抗原结合α-肌动蛋白抗原染色鉴别人工合成组织工程化软骨结构的可行性。 设计、时间及地点：对比观察，于2006-12／2008—02在深圳市人民医院临床医学研究中心完成。 材料：2周龄SPF级SD大鼠，体质量50--60g，用于体外培养剑突软骨细胞；DegraPol材料，长20mm，内/外径分别为2．5/4mm，管壁厚度为0．75mm，由瑞士联邦理工大学聚合材料研究所提供。 方法：于第3代收集软骨细胞接种于DegraPol管状支架形成软骨细胞-支架复合物，体外培养3周后植入同系大鼠腹腔大网膜体内培养1周。分别于体外培养3周和体内培养1周后取软骨细胞-DegraPol复合物制备组织学检测标本行苏木精-伊红染色和S-100抗原、α-肌动蛋白抗体免疫组织化学染色。 主要观察指标：倒置显微镜观察软骨细胞-DegraPol复合物的变化；免疫组织化学染色鉴定软骨细胞。 结果：体外培养3周后，苏木精-伊红染色显示软骨细胞位于软骨陷窝内，软骨基质呈蓝色。种植软骨细胞于DegraPol管状泡沫材料支架内侧面，体外培养3周后，在管腔的内侧壁S-100抗原阳性表达，α-肌动蛋白抗原阴性。证实在细胞-支架复合物植入同系大鼠体内培养之前已经形成了新的组织工程化软骨层。置入动物体内培养1周后，所获得的新组织为混合性的细胞结构，S-100抗原阳性多集中在管腔的内侧壁，而α-肌动蛋白抗原阳性反应多集中在管腔的外侧壁。 结论：软骨组织S—100抗原阳性表达，结缔组织α-肌动蛋白抗原阳性表达。S-100和α-肌动蛋白抗原可作为组织工程化软骨的鉴定指标。     

无细胞真皮支架与同种细胞相容性的动态观察

背景：无细胞真皮作为真皮替代材料已广泛应用于临床皮肤缺损的修复,能否将其应用范围扩展使其作为真皮支架用于组织工程皮肤的构建呢？目前国内外对这一方面都在进行着大量的研究。目的：动态评价同种无细胞真皮基质的细胞相容性,验证其作为皮肤组织工程支架材料的可行性。设计、时间及地点：单一样本观察,于2007-10/2008-03在中国辐射防护研究院组织工程实验室完成。材料：试验中皮肤样品源自武警山西总队医院行包皮环切术的健康儿童切除的包皮。方法：采用高渗盐-SDS-胰蛋白酶法制备同种无细胞真皮,组织块贴壁法培养人成纤维细胞,使其接种于支架材料上,通过苏木精-伊红染色以及扫描电镜观察成纤维细胞在支架材料上的贴附、生长、增殖以及迁移情况。主要观察指标：①同种无细胞真皮基质的形态结构。②无细胞真皮基质的细胞相容性。结果：同种无细胞真皮基质肉眼观察为乳白色,柔韧有弹性,苏木精-伊红染色和扫描电镜显示表皮以及真皮乳头层和网状层细胞以及细胞成分已经完全去除,且真皮的胶原网状支架保留完整;接种该支架材料上的成纤维细胞生物学行为活跃,不仅能够在其表面贴附、生长、增殖,并沿细胞间隙向真皮内部浸润生长,穿过乳头层达到网状层,而且分泌细胞外基质,填充细胞间隙形成膜片样结构。结论：通过高渗盐-SDS-胰蛋白酶法制备的无细胞真皮具有良好的细胞相容性,可作为真皮支架材料用于组织工程皮肤的构建。     

犬内皮与平滑肌细胞的短期静态联合培养

目的:为获得组织工程化自体血管,观察体外静态培养条件下犬内皮细胞与平滑肌细胞联合培养组织学及形态学的特征。方法:实验于2004-07/2005-06在首都医科大学宣武医院外科院级实验室完成。①实验材料:雄性杂种犬,3个月龄,体质量8～12kg。②实验方法:贴块法及酶解法对犬内皮细胞及平滑肌细胞进行原代分离培养及扩增,将第Ⅱ代平滑肌细胞以1×109L-1的密度种植于胶原膜上培养13d,再将第Ⅱ代内皮细胞接种于生长平滑肌细胞的胶原膜上2d。③实验评估:行苏木精-伊红染色同时扫描电镜和透射电镜观察平滑肌细胞和内皮细胞在胶原载体上联合培养后的形态。结果:苏木精-伊红染色见平滑肌细胞较均匀的分布于支架材料表面及内部;扫描电镜下,平滑肌细胞可以在胶原载体材料上生长,增殖明显并在短期内形成多层细胞。内皮细胞与平滑肌细胞联合培养2d就可在平滑肌细胞层表面获得连续的单层内皮细胞层。结论:在短期静态培养条件下犬的血管平滑肌细胞和内皮细胞可以在胶原载体材料上形成具有两层细胞结构的组织工程化动脉血管组织片。     

新生牛皮胶原蛋白海绵的制备及其体外细胞相容性

背景：现已证实,人肌腱、牛肌腱、鼠尾、猪皮、新生牛跟腱制备的胶原蛋白海绵有良好的细胞相容性。目的：采用新生牛皮提取胶原蛋白、制备生物医用胶原蛋白海绵,观察其与羔羊肾成纤维细胞的相容性。设计、时间及地点：对比观察实验,于2006-05/2007-02在西北民族大学生命科学与工程学院生物工程与技术国家民委重点实验室完成。材料：出生24h内宰杀的新生尕里巴牛犊皮,岷县黑裘皮羔羊肾原代成纤维细胞。方法：取新生牛犊皮,经脱毛、胃蛋白酶＋冰醋酸联合处理、盐析、透析、冻干后制备胶原蛋白海绵。将海绵与羔羊肾F3代成纤维细胞混悬液共培养,分别设胶原海绵材料组、阴性对照组（生理盐水）、阳性对照组（橡胶塞浸提液）。主要观察指标：应用倒置相差显微镜及JVC数码摄像系统观察、拍摄与记录细胞形态、生长情况。培养20,35d,对共培养物进行AO染色,观察细胞在胶原海绵中的增殖情况。培养65d后制石蜡切片,行苏木精-伊红染色,观察细胞在胶原海绵中的生长情况。结果：阳性对照组细胞培养24h细胞圆缩,不贴壁,3d后全部死亡。胶原海绵材料组与阴性对照组细胞形态均正常,细胞贴壁生长良好。随着培养时间的延长,海绵孔隙逐渐变小,细胞数量增加,形态变小,海绵外观从柔软、混浊变得挺拔、透明。AO染色显示培养20,35d的胶原海绵-羔羊肾成纤维细胞共培养物中有大量细胞存在,并且在胶原蛋白空隙中有大量细胞成团簇状生长。苏木精-伊红染色显示有大量蓝色细胞核和新生的红色胶原纤维。结论：制备的新生牛皮胶原蛋白海绵对岷县黑裘皮羔羊肾成纤维细胞有良好的相容性。     

小肠黏膜下层无细胞基质作为阴道平滑肌细胞载体的可行性

背景:目前国内外用于阴道组织工程研究的主要支架材料聚乙醇酸存在降解过快等缺陷.天然脱细胞支架材料尤其是小肠黏膜下层逐渐成为组织工程研究的重点.目的:探索用猪小肠黏膜下层基质作为组织工程学阴道细胞载体的可行性.方法:取新西兰雌兔,分离出阴道平滑肌组织块,组织块+酶消化法原代培养阴道平滑肌细胞.体外培养传代后作为种子细胞接种于自制猪小肠黏膜下层基质体外联合培养,倒置显微镜动态观察细胞形态及生长增殖情况,分别于1,2,3,4周时取标本,行组织学检查.结果与结论:①体外成功培养出阴道平滑肌细胞,倒置显微镜下,见培养的阴道平滑肌细胞呈现长梭状,细胞集结于培养皿上形成典型的"峰和谷"样构型.②黏膜下层无细胞基质外观呈白色,半透明,有一定韧性.苏木精-伊红染色未见细胞成分存在.③阴道平滑肌细胞-肠黏膜下层标本切片苏木精-伊红染色后,光镜下可见细胞成分逐渐增多,由表浅向深层部位生长.④阴道平滑肌细胞-肠黏膜下层标本切片采用抗兔平滑肌α-肌动蛋白单克隆抗体免疫组化染色后,均可见抗兔α-Actin的阳性细胞.结果初步证明了猪小肠黏膜下层基质可作为一种平滑肌细胞载体.     

3-羟基丁酸与3-羟基己酸共聚酯的血管内生物相容性（英文）

背景：可降解聚合材料3-羟基丁酸与3-羟基己酸共聚酯（3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate,PHBHHx）具有良好的机械性能和生物可降解性。目的：在体研究PHBHHx的血管内生物相容性。方法：采用脱细胞羊肺动脉为支架,以PHBHHx涂层,构建复合补片,植入新西兰兔腹主动脉内,以脱细胞未涂层羊肺动脉片作为对照。分别于植入后第1,4,12周取出移植补片进行组织学、免疫荧光染色、扫描电镜和钙含量测定。结果与结论：复合补片管腔面光滑无血栓,内膜增生适度,再细胞化完全;免疫荧光染色可见新生内膜组织中类内皮细胞呈CD31阳性反应,单层连续排列,间质细胞呈平滑肌肌动蛋白阳性反应;复合补片的钙含量明显低于未涂层羊肺动脉片。说明PHBHHx的血管内生物相容性满意,是心血管组织工程较为理想的腔内涂层材料。     

新生牛跟腱胶原蛋白海绵与动物肾、睾丸、皮肤细胞的生物相容性

背景：随着新生牛血清的产业化，新生牛跟腱资源大量积累，使得利用其制备医用胶原蛋白海绵并产业化成为可能。目的：采用新生牛跟腱制备胶原蛋白海绵，观察其与Vero细胞、天祝白牦牛胚胎皮肤细胞和岷县黑紫羔羊睾丸细胞的生物相容性。设计、时间、地点：重复测量观察，于2006-02／05在西北民族大学生命科学与工程学院生物工程与技术国家民委重点实验室完成。材料：用出生24h内的新生牛跟腱经冰醋酸、胃蛋白酶等消化，经盐析、透析及冻干等处理后，制成胶原蛋白海绵。天祝白牦牛胚胎皮肤f2代细胞和岷县黑紫羔羊睾丸f2代细胞为自制，Vero细胞为协和医科大学细胞中心提供。方法：在6孔板中，将3种细胞分别接种于经紫外线、臭氧灭菌后的胶原蛋白海绵上，于37℃、体积分数为0．05的CO2恒温箱培养，同时设对照实验。主要观察指标：相差显微镜观察接种5，12，24，72h时3种细胞在胶原蛋白海绵上和6孔板底的生长情况，接种11d对共培养物行考马斯亮蓝、苏木精-伊红染色。结果：接种后5h，在胶原蛋白海绵周围的6孔板底部可看到细胞已贴壁、伸展，个别细胞有分裂现象，在胶原蛋白海绵表面，隐约可见圆形细胞排列。接种后48～72h时，6孔板底部细胞铺满单层。接种后11d，考马斯亮蓝和苏木精-伊红染色显示3种共培养物中均有大量细胞良好生长，胶原海绵外观变得挺拔、透明、有韧性。结论：新生牛跟腱胶原蛋白海绵与上述3种来自不同动物、不同组织的细胞有很好的生物相容性，可做皮肤细胞、肾细胞和睾丸细胞的培养支架。     

新生牛皮胶原蛋白海绵的制备及其体外细胞相容性

目的:采用新生牛皮提取胶原蛋白、制备生物医用胶原蛋白海绵,观察其生物学活性与细胞相容性。方法:实验于2006-05/2007-02在西北民族大学生命科学与工程学院生物工程与技术国家民委重点实验室完成。实验方法:①取出生24h内宰杀的新生尕里巴牛犊皮制备胶原蛋白海绵。②将新生牛皮胶原蛋白海绵与黑裘皮羔羊肾F3代成纤维细胞混悬液共培养,分别设胶原海绵材料组、阴性对照组(生理盐水)、阳性对照组(橡胶塞浸提液)。实验评估:①应用倒置相差显微镜观察细胞形态。②培养20,35d对细胞与胶原蛋白海绵共培养物进行AO染色观察细胞在胶原海绵中的增殖情况。③培养65d后制石蜡切片,行苏木精-伊红染色观察细胞在胶原海绵中的生长情况。结果:①细胞形态观察结果:阳性对照组细胞培养24h细胞圆缩,不贴壁,3d后全部死亡。胶原海绵材料组与阴性对照组细胞形态均正常,细胞贴壁生长良好。随着培养时间的延长,海绵孔隙逐渐变小,细胞数量增加,形态变小,海绵外观从柔软、混浊变得挺拔、透明。②细胞在胶原海绵中的增殖情况:吖啶橙-AO染色显示培养20,35d胶原海绵-羔羊肾成纤维细胞共培养物中有大量细胞存在,并且在胶原蛋白空隙中有大量细胞成团簇状生长。③细胞在胶原海绵中的生长情况:苏木精-伊红染色显示有大量蓝色细胞核和新生的红色胶原纤维。结论:制备的新生牛皮胶原蛋白海绵对岷县黑裘皮羔羊肾成纤维细胞有良好的生物相容性,无细胞毒性。     

3-羟基丁酸与3-羟基己酸共聚酯的血管内生物相容性

背景:可降解聚合材料3-羟基丁酸与3-羟基己酸共聚酯(3-hydroxybutyrate-co- 3-hydroxyhexanoate,PHBHHx)具有良好的机械性能和生物可降解性.目的:在体研究PHBHHx的血管内生物相容性.方法:采用脱细胞羊肺动脉为支架,以PHBHHx涂层,构建复合补片,植入新西兰兔腹主动脉内,以脱细胞未涂层羊肺动脉片作为对照.分别于植入后第1,4,12周取出移植补片进行组织学、免疫荧光染色、扫描电镜和钙含量测定.结果与结论:复合补片管腔面光滑无血栓,内膜增生适度,再细胞化完全;免疫荧光染色可见新生内膜组织中类内皮细胞呈CD31阳性反应,单层连续排列,间质细胞呈平滑肌肌动蛋白阳性反应;复合补片的钙含量明显低于未涂层羊肺动脉片.说明PHBHHx的血管内生物相容性满意,是心血管组织工程较为理想的腔内涂层材料.     

组织工程尿道在裸鼠皮下的埋置

背景：由于创伤、先天畸形、肿瘤或手术继发的尿道缺损、狭窄、憩室等病理状况下，需要采用自体组织修复其缺损。目的：验证构建组织工程化尿道的可行性。设计、时间及地点：观察性实验，于2005—01／2006-01在中山大学林百欣医学研究中心完成。材料：雄性新西兰兔10只，体质量3．0～3．5k，用于制备脱细胞尿道；4～6周龄BALB／cA—nude裸鼠20只，体质量18～20g，与细胞外基质材料复合体进行体内培育。方法：取新西兰兔完整尿道，脱细胞后形成细胞外基质材料，切取成体新西兰兔阴茎头约1／2大小，组织块法培养扩增兔平滑肌细胞：之后将尿道海绵体平滑肌细胞种植到脱细胞尿道基质上，将其植入裸鼠背部皮下进行培育。实验分为2组，实验组埋置细胞材料复合体，对照组埋置未接种细胞的单纯脱细胞尿道基质。主要观察指标：植入后1，2，4，6，8周取材，行大体和组织学及电镜观察细胞材料复合体的生长情况，免疫组织化学鉴定平滑肌细胞的表达。结果：①大体观察裸鼠背部切口愈合良好，饮食活动正常。植入后1，2周实验组脱细胞基质表面已有少量的组织膜形成；4周组织膜逐渐增厚，有小血管长入；6，8周脱细胞基质材料逐渐被新的细胞替代。②苏木精一伊红染色可见，随着时间延长，脱细胞材料逐渐被吸收，被各种细胞代替。其中平滑肌细胞最多，并可见大小不等的血管长入基质，部分有形成血窦的倾向；提示复合材料在裸鼠体内逐渐形成类似正常尿道的组织结构。③电镜观察从第4周有血管长入基质，可见较多的平滑肌细胞和内皮细胞及少量的成纤维细胞和巨噬细胞，并有部分平滑肌细胞凋亡。④α-平滑肌肌动蛋白抗体进行免疫组织化学染色后可见有平滑肌细胞生长。 结论：采用组织工程技术可再造出类似于正常尿道的海绵体组织。