丝裂霉素诱导的肝癌细胞凋亡致敏树突状细胞

目的:建立丝裂霉素诱导癌细胞凋亡致敏从人外周血诱导扩增的树突状细胞的方法。设计:以癌细胞凋亡致敏树突状细胞为观察对象的随机对照实验。单位:解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所,解放军军事医学科学院放射医学研究所。材料:实验于1998-04/1999-05在解放军军事医学科学院放射医学研究所完成。细胞株为QBC939胆管癌细胞株,药物为抗肿瘤药物丝裂霉素。方法:从正常人外周血分离获得单核细胞,加入50μg/L重组人粒细胞集落刺激因子,1000U/mL白细胞介素4,隔天一次,共4次,培养第3天,加入丝裂霉素诱导凋亡的胆管癌细胞,再继续体外培养4d后,用树突细胞富集柱收集树突状细胞。主要观察指标:①培养的树突状细胞的鉴定。②树突状细胞和坏死胆管癌细胞以及正常培养的胆管癌细胞共培养,观察其吞噬凋亡小体负载抗原。③检测不同密度的树突状细胞(1×103/孔,5×103/孔,1×104/孔)的免疫刺激活性及负载抗原后的免疫刺激活性,以单核细胞作对照组。结果:①培养、扩增得到的树突状细胞高表达共刺激分子B7和CDla,表面具有典型不规则突起。②丝裂霉素诱导癌细胞凋亡形成的凋亡小体被树突状细胞捕捉、吞噬。③负载抗原的树突状细胞其激发同种异体T淋巴细胞增殖的能力进一步增强。结论:丝裂霉素诱导癌细胞凋亡可以致敏重组人粒细胞集落刺激因子加重组人白细胞介素4从人外周血单核细胞诱导、扩增出的树突状细胞,树突状细胞可以有效提呈凋亡胆管癌细胞的抗原,可望成为有效的肿瘤抗原致敏树突状细胞的新途径。     

HBcAg和HBeAg对人树突状细胞成熟和功能的影响

目的观察乙型肝炎核心抗原(hepatitis B core antigen,HBcAg)和乙型肝炎e抗原(hepatits B e antigen,HBeAg)对人树突状细胞的影响。方法分离20例健康者外周抗凝血淋巴细胞,将贴壁细胞加重组人白细胞介素4和重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子培养至第7天,将树突状细胞分为HBcAg组、HBeAg组和树突状细胞对照组,分别加入HBcAg、HBeAg对树突状细胞刺激培养至第10天,检测刺激培养后细胞表型与分泌的细胞因子及其对树突状细胞体外诱导的淋巴细胞增殖效应和淋巴细胞毒活性的影响。结果 HBcAg组、HBeAg组树突状细胞表面分子(CD83,CD86,HLA-ABC)水平和分泌干扰素-γ、白细胞介素-12p70水平、体外诱导淋巴细胞增殖效应及淋巴细胞毒活性与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01);HBcAg组增强树突状细胞的分子表达、分泌白细胞介素-12p70及体外诱导淋巴细胞毒活性与HBeAg组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论 HBcAg和HBeAg可增加人树突状细胞表达成熟活化的分子、分泌细胞因子,增强树突状细胞体外诱导淋巴细胞增殖效应及淋巴细胞毒活性。     

人脐血间充质干细胞培养及对异体外周血T淋巴细胞增殖的影响

目的:研究发现间充质干细胞具有独特的免疫调节特性,体外能够抑制混合淋巴细胞培养或有丝分裂原刺激中的T淋巴细胞增殖.实验观察体外分离培养的脐血间充质干细胞对异体外周血T淋巴细胞增殖的抑制效果.方法:实验于2004-10/2006-06在解放军兰州军区兰州总医院完成.①对象:足月正常分娩产妇脐血及健康志愿者外周血分别由解放军兰州军区兰州总医院妇产科、血液科提供,产妇与志愿者对实验均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准.②实验方法:Percoll法分离脐血单个核细胞,贴壁纯化,达80%～90%融合时胰蛋白酶消化,按2.0×108L-1密度传代,取第4-5代细胞用于实验.密度梯度法分离外周血单个核细胞,以含体积分数为0.2胎牛血清的RPMI 1640培养基调整细胞浓度至1×109 L-1时加入尼龙棉柱内,用培养基冲出非黏附细胞即为T淋巴细胞.脐血间充质干细胞分为2×108,1×108,0.5×108 L-1组,各100 μL接种于96孔培养板,加入2×108 L-1 T淋巴细胞悬液100 μL,再给予植物血凝素刺激T淋巴细胞转化.以T淋巴细胞 植物血凝素为阳性对照.③实验评估:观察体外培养的脐血间充质干细胞形态,应用流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达.MTT法测定脐血间充质干细胞对异体外周血T淋巴细胞增殖的影响.结果:①形态特征与表面抗原表达:原代培养10～18 d形成平行排列、辐射状或旋涡状的成纤维样细胞,即为脐血源性的间充质干细胞,传代7 d左右细胞达90%融合.流式细胞仪检测90%细胞稳定表达间充质干细胞相关抗原CD13,CD29,CD44,CD166,不表达造血细胞系的表面抗原CD34,CD45.②脐血间充质干细胞对异体T淋巴细胞增殖的抑制:与阳性对照比较,经脐血间充质干细胞共培养后植物血凝素刺激T淋巴细胞的增殖作用受到抑制,增殖指数明显降低(P＜0.01).间充质干细胞与T淋巴细胞比值为1:1,1:2和1:4时的增殖抑制率分别为(48.16±2.31)%,(34.47±3.09)%,(22.15±2.63)%.结论:脐血间充质干细胞可显著抑制异体外周血T淋巴细胞的增殖,该抑制作用呈剂量依赖性.     

L-精氨酸对树突状细胞表型及功能的影响

目的 体外分离培养人外周血树突状细胞(DCs),并探讨L-精氨酸(L-arg)对DCs表型表达及抗原提呈能力的影响.方法 对照组密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞,取贴壁细胞加入粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-4(IL-4),第6天加入肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激DCs成熟;实验组在此基础上加入不同剂量L-arg继续培养;第8天用倒置显微镜观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞表型,混合淋巴细胞反应观察各组细胞的抗原提呈能力,在酶标仪490 nm处测出光密度(OD)值.结果 对照组和实验组均表现出DCs典型形态学特征,实验组CD80、CD83、CD1α、HLA-DR表达增加,混合淋巴细胞反应中实验组反映T淋巴细胞增殖效应强度的OD值高于对照组.结论 L-arg可促进DCs成熟,增加DCs表型的表达,并提高DCs的抗原提呈能力.     

三阴乳腺癌疫苗刺激T淋巴细胞增殖免疫效应观察

目的:利用细胞融合技术制备外周血来源树突状细胞(DC)和三阴乳腺癌细胞(MDA-MB-231)全抗原肿瘤疫苗,观察其刺激同源T淋巴细胞增殖作用。方法:从健康人的外周血中分离培养树突状细胞,利用电融合技术,将DC和三阴乳腺癌细胞融合;用荧光显微镜观察融合疫苗的形态;用流式细胞仪进行融合疫苗的表型鉴定;用CCK-8试剂盒测定融合疫苗刺激同源异体T淋巴细胞增殖效应。结果:成功分离培养DC,其表面高表达DC的分子标记CD11c、CD86、HLA-DR;融合疫苗的形态不规则,其表面共同表达DC和三阴乳腺癌的标记分子;T淋巴增殖实验证明融合疫苗具有很强的免疫刺激活性。结论:电融合技术成功诱导DC和三阴乳腺癌细胞融合,全抗原融合疫苗体外实验可显著增强同源T淋巴细胞增殖。     

丝裂霉素诱导的肝癌细胞凋亡致敏树突状细胞

目的：建立丝裂霉素诱导癌细胞凋亡致敏从人外周血诱导扩增的树突状细胞的方法。 设计：以癌细胞凋亡致敏树突状细胞为观察对象的随机对照实验。 单位：解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所，解放军军事医学科学院放射医学研究所。 材料：实验于1998-04／1999-05在解放军军事医学科学院放射医学研究所完成。细胞株为QBC939胆管癌细胞株．药物为抗肿瘤药物丝裂霉素。 方法：从正常人外周血分离获得单核细胞，加入50μg／L重组人粒细胞集落刺激因子，1000U／mL白细胞介素4，隔天一次，共4次，培养第3天，加入丝裂霉素诱导凋亡的胆管癌细胞，再继续体外培养4d后，用树突细胞富集柱收集树突状细胞。 主要观察指标：①培养的树突状细胞的鉴定。②树突状细胞和坏死胆管癌细胞以及正常培养的胆管癌细胞共培养，观察其吞噬凋亡小体负载抗原。③检测不同密度的树突状细胞（1&;#215;10^3／孔，5&;#215;10^3／孔，1&;#215;10^4／孔）的免疫刺激活性及负载抗原后的免疫刺激活性，以单核细胞作对照组。 结果：①培养、扩增得到的树突状细胞高表达共刺激分子B7和CD1a，表面具有典型不规则突起。②丝裂霉素诱导癌细胞凋亡形成的凋亡小体被树突状细胞捕捉、吞噬。③负载抗原的树突状细胞其激发同种异体T淋巴细胞增殖的能力进一步增强。 结论：丝裂霉素诱导癌细胞凋亡可以致敏重组人粒细胞集落刺激因子加重组人白细胞介素4从人外周血单核细胞诱导、扩增出的树突状细胞，树突状细胞可以有效提呈凋亡胆管癌细胞的抗原，可望成为有效的肿瘤抗原致敏树突状细胞的新途径。     

脐带血树突状细胞的体外诱导及其特征鉴定

目的:探讨在体外无需预先分离CD34 造血祖细胞即可有效诱导脐带血单个核细胞而获得脐带血树突状细胞的方法,并对人脐带血树突状细胞的生物学功能进行鉴定。方法:实验于2003-12/2004-10在吉林省肿瘤防治研究所完成。健康孕妇正常胎儿脐带血由吉林省妇幼保健院提供,孕妇签署知情同意书。无菌采集健康孕妇正常胎儿脐带血50mL左右,肝素抗凝。生理盐水稀释后加入甲基纤维素使终浓度为1g/L,室温沉降45min,取上层富含细胞的血浆层,1500r/min离心10min,弃上清,沉淀加两倍体积的生理盐水稀释,以1∶1体积叠加于淋巴细胞分层液上,分离出脐带血中的单个核细胞,体外培养24h后去除悬浮细胞,加入粒细胞-巨噬集落刺激因子、白细胞介素4联合刺激脐带血单个核细胞分化为脐带血树突状细胞。在光镜和透射电镜下观察培养的脐带血树突状细胞的形态学特征。碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶桥联法测量脐带血树突状细胞表面分子CD1α、人类白细胞抗原-DR的表达水平。四甲基偶氮唑蓝法测定不同细胞密度的树突状细胞刺激同种T淋巴细胞增殖的能力。结果:①不同诱导时间体外培养的脐带血树突状细胞形态学观察:倒置显微镜下,淋巴细胞经细胞因子诱导后第3d聚集成均匀散布的细胞聚体,部分细胞变形,胞体拉长;第7d可见不明显突起,细胞形态不规则,呈疏松贴壁生长或悬浮生长;14d集落样生长,具有典型的树突状细胞形态。透射电镜下可见树突状细胞呈不规则形,细胞表面粗糙,突起明显;细胞核呈肾形或马蹄形,核浆比增大;胞浆中富含线粒体,较少溶酶体。②细胞因子诱导前后脐血淋巴细胞表型的变化:诱导前脐带血淋巴细胞表面不表达CD1α,诱导后CD1α的表达上升为(22.00±4.36)%;人类白细胞抗原-DR由诱导前的(3.67±2.08)%表达上升为(61.67±7.02)%。③脐带血树突状细胞对T淋巴细胞增殖能力的影响:脐带血树突状细胞具有明显刺激同种T淋巴细胞增殖的功能,且其数量的不同对T淋巴细胞的刺激能力亦不同。脐带血树突状细胞与淋巴细胞比值为1∶10时平均刺激指数为3.95,比值为1∶100时平均刺激指数为2.16。结论:采取粒细胞-巨噬集落刺激因子、白细胞介素-4联合刺激可成功诱导出形态典型、纯度较高的脐带血树突状细胞,且体外培养后具有明显的刺激同种T淋巴细胞增殖的能力。     

脐带血树突状细胞的体外诱导及其特征鉴定

目的：探讨在体外无需预先分离CD34^＋造血祖细胞即可有效诱导脐带血单个核细胞而获得脐带血树突状细胞的方法，并对人脐带血树突状细胞的生物学功能进行鉴定。方法：实验于2003—12／2004—10在吉林省肿瘸防治研究所完成。健康孕妇正常胎儿脐带血由吉林省妇幼保健院提供，孕妇签署知情同意书。无菌采集健康孕妇正常胎儿脐带血50mL左右，肝素抗凝。生理盐水稀释后加入甲基纤维素使终浓度为1g／L，室温沉降45min，取上层富含细胞的血浆层，1500r／min离心10min，弃上清，沉淀加两倍体积的生理盐水稀释，以1：1体积叠加于淋巴细胞分层液上，分离出脐带血中的单个核细胞，体外培养24h后去除悬浮细胞，加入粒细胞-巨噬集落刺激因子、白细胞介素4联合刺激脐带血单个核细胞分化为脐带血树突状细胞。在光镜和透射电镜下观察培养的脐带血树突状细胞的形态学特征。碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶桥联法测量脐带血树突状细胞表面分子CD1α、人类白细胞抗原-DR的表达水平。四甲基偶氮唑蓝法测定不同细胞密度的树突状细胞刺激同种T淋巴细胞增殖的能力。结果：①不同诱导时间体外培养的脐带血树突状细胞形态学观察：倒置显微镜下，淋巴细胞经细胞因子诱导后第3d聚集成均匀散布的细胞聚体，部分细胞变形，胞体拉长；第7d可见不明显突起，细胞形态不规则，呈疏松贴壁生长或悬浮生长；14d集落样生长，具有典型的树突状细胞形态。透射电镜下可见树突状细胞呈不规则形，细胞表面粗糙，突起明显；细胞核呈肾形或马蹄形，核浆比增大；胞浆中富含线粒体，较少溶酶体。②细胞因子诱导前后脐血淋巴细胞表型的变化：诱导前脐带血淋巴细胞表面不表达CD1α，诱导后CD1α的表达上升为（22．00&;#177;4．36）％；人类白细胞抗原-DR由诱导前的（3．67&;#177;2．08）％表达上升为（61．67&;#177;7．02）％。③脐带血树突状细胞对T淋巴细胞增殖能力的影响：脐带血树突状细胞具有明显刺激同种T淋巴细胞增殖的功能，且其数量的不同对T淋巴细胞的刺激能力亦不同。脐带血树突状细胞与淋巴细胞比值为1：10对平均刺激指数为3．95，比值为1：100时平均刺激指数为2．16。结论：采取粒细胞-巨噬集落刺激因子、白细胞介素-H4联合刺激可成功诱导出形态典型、纯度较高的脐带血树突状细胞，且体外培养后具有明显的刺激同种T淋巴细胞增殖的能力。     

TNF-α促进树突状细胞分化成熟的实验研究

本研究探讨不同浓度肿瘤坏死因子α(TNF-α)对人外周血单个核细胞来源树突状细胞(MNC-derived den-dritic cells,MNCDC)分化成熟的影响。采集正常健康成人外周血30 ml,以Thomas法分离外周血单个核细胞(PBMNC),用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白介素-4(rhIL-4)于体外联合诱导培养8天,并于培养第5天加入不同浓度的rhTNF-α共同培养;用流式细胞术检测DC膜表面的HLA-DR、CD83和CD1a表达,用MTT法检测DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力。结果表明,不同浓度的TNF-α能不同程度地刺激DC表达HLA-DR、CD83和CD1a,增强DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力。结论:TNF-α能够显著增强外周血单个核细胞来源DC的分化和成熟,不同浓度TNF-α能不同程度地刺激MNCDC功能成熟,TNF-α浓度为20ng/ml时刺激DC分化成熟的作用最强。     

α-干扰素诱导外周血单核细胞向树突状细胞分化

背景：研究表明，树突状细胞接受刺激的性质和微环境及其起源是决定免疫反应中初始CD4^＋T细胞发生Th1或Th2应答的关键因素，树突状细胞是否成熟对其功能的发挥影响很大。 目的：观察广泛应用的细胞因子α-干扰素对人外周血单核细胞向树突状细胞分化成熟的影响。 设计、时间及地点：细胞水平的观察对照实验，于2007-05／12在深圳市人民医院临床医学研究中心实验室完成。 材料：取10名健康成人志愿者的外周血。 方法：采集外周血10mL，肝素抗凝，常规淋巴细胞分离液分离单核细胞，然后将单核细胞与粒-巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素4体外培养7d。分3组进行树突状细胞培养，对照组不加α-干扰素；100U／L α-干扰素组于培养第5天加入100U／L的α-干扰素；300U／Lα-干扰素组于培养第5天加入300U／L的α-干扰素。主要观察指标：培养第7天用流式细胞术检测树突状细胞膜表面CD83和MHC—DR表达水平；应用四氮唑盐法测定树突状细胞刺激同种异体T细胞增殖的能力：采用酶联免疫吸附法检测树突状细胞培养上清中白细胞介素12p40＋p70含量。 结果：100，300U／Lα-干扰素组中CD83^＋和MHC—DR^＋树突状细胞的数量、刺激同种异体T细胞增殖的能力及培养上清液中白细胞介素12p40＋p70水平均显著高于对照组（P〈0．01），并以300U／Lα-干扰素组作用更强。 结论：α-干扰素可以有效促进单核细胞源树突状细胞的功能成熟，并呈剂量依赖效应。