兔骨髓基质细胞的生物学特性及植人心肌后的存活状况

目的：观察兔骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells，MSCs)的部分生物学特性及植人心肌后的存活状况。方法：密度梯度离心与贴壁粘附得到高纯度的兔下肢骨MSCs，建立体外培养体系，光镜、电镜、细胞周期等观察其生物学特性，4^ ，6-二脒基-2-苯吲哚(4^ ，6-dia midino-2-phenylindone，DAPI)标记培养的MSCs，植人心肌后检测植入细胞在6周内不同时相点的存活状况。结果：体外培养的MSCs显示良好的贴壁扩增生长能力，88％的培养细胞为静止期细胞，96.4％细胞为活细胞，电镜证明培养细胞显示幼稚细胞的结构。标记的MSCs植人心肌后至少生存6周并且植入细胞扩散融合于植入区宿主心肌中。结论：体外培养的MSCs显示幼稚细胞形态，标记的培养MSCs植人心肌后可以长期存活并扩散融合于宿主心肌。     

骨髓间质干细胞移植后心肌梗死区的超微结构变化

目的观察骨髓间质干细胞(MSCs)移植后心肌梗死区的超微结构变化,探讨MSCs移植治疗急性心肌梗死(AMI)的可能机制。方法于冠状动脉左前降支结扎后1～2h,将5-溴脱氧尿核苷(BrdU)标记的MSCs注射至心肌梗死区,6周后采用免疫组化法鉴定宿主心肌内存活的MSCs,于透射电镜下观察心肌梗死区的超微结构。结果MSCs组梗死心肌内可见BrdU阳性细胞。电镜下,MSCs组可见幼稚的细胞:胞核大,染色质颗粒细而均匀,以常染色质为主,可见由肌微丝刚形成的小肌原节和发育程度不同的肌原纤维,部分与正常心肌形成缝隙连接。和MSCs组比较,AMI组可见肌纤维断裂、坏死严重,线粒体肿胀,内有黑色绒球状颗粒。结论MSCs移植能减轻心肌细胞坏死,并有可能通过分化为心肌细胞来修复梗死心肌。     

人脐带间充质干细胞经体内定植并向心肌样细胞分化的研究

目的探讨人脐带间充质干细胞(MSCs)移植到大鼠心肌后能否存活并向心肌样细胞分化,为心肌细胞的移植探索新的细胞来源。方法从人脐带华尔通氏胶分离、培养MSCs,检测人脐带来源的MSCs的细胞表面标记。用5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)标记人脐带间充质干细胞,标记细胞移植到梗塞大鼠心肌,观察移植后2周细胞能否存活,移植细胞能否向心肌样细胞分化,表达心肌细胞标记物troponinI及troponinT。结果人脐带间充质干细胞移植到心肌梗塞模型大鼠心肌后细胞能存活,并表达心肌细胞标记物troponinI及troponinT。结论人脐带间充质干细胞移植至体内能存活并分化为心肌样细胞,人脐带间充质干细胞可能作为心肌细胞移植的来源。     

兔骨髓间充质干细胞体外分离培养及冻存研究

目的:寻求体外培养、冻存、复苏兔骨髓间充质干细胞(mensechymalstemcells,MSCs)的方法,为兔MSCs进一步的实验研究打下基础。方法:取新西兰白兔胫骨穿刺获取骨髓液,以贴壁筛选法分离、纯化、培养和扩增获得MSCs,并行液氮冻存,通过倒置显微镜观察其生物学表现。结果:MSCs为贴壁生长,形态为均匀成纤维细胞样,增殖能力强,传代及冻存后细胞仍然保持其生物学特性。结论:MSCs可采取贴壁筛选法进行较好的纯化和扩增,并可长期保存于液氮中,在一定的条件下可复苏存活。     

兔骨髓间充质干细胞的Gd-DTPA标记及MRI体外示踪

目的探讨兔MSCs磁性标记及MRI体外示踪的可行性。方法培养分离兔MSCs,以PEI-FluoR为载体,体外对MSCs进行双标记。标记后行荧光镜、电镜观察及生物学性状检测。应用1.5TMRI仪,对标记细胞进行SE序列T1WI及T2WI扫描及T1-mapping测量T1时间,并观察MRI上能显示标记MSCs的最小数目及标记后正常传代后MRI监测的持久性。结果MSCs双标记后,标记效率为80%,细胞内可见荧光物质,电镜下Gd颗粒位于胞浆内。标记后24h内标记细胞与未标记细胞间台盼蓝拒染率、标记后5d内标记细胞与未标记细胞的MTT吸光度值差异无统计学意义。标记细胞凋亡指数为0.40%,未标记细胞为0.19%。未标记及标记细胞T1WI平均信号强度及T1时间分别为2166±167、(2445±21)ms,3162±350、(1404±129)ms(t=6.91、29.87,P<0.005)。体外MRI上可监测到最低1×104个标记细胞,并可持续显示第3代标记细胞。结论应用多聚胺载体对兔MSCs进行Gd-DTPA及荧光双标记安全、有效;MRI能示踪体外双标记的干细胞。     

外环境对骨髓间充质干细胞分化成心肌样细胞的影响

目的:研究外环境对骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)定向分化成心肌样细胞的影响。方法:取SD大鼠骨髓,通过贴壁法进行MSCs培养,经过多次传代后获得较纯的MSCs。用5-氮胞苷进行诱导分化,显微镜下观察其形态变化,通过RT-PCR鉴定心肌特异基因心房利尿肽和脑钠肽表达。实验分Ⅰ组为在玻片上的5-氮胞苷干预的MSCs移入到心肌细胞培养环境中;Ⅱ组为5-氮胞苷干预的MSCs;Ⅲ组为玻片上未用5-氮胞苷干预的MSCs移入到心肌细胞培养环境中;Ⅳ组为未用5-氮胞苷干预的MSCs。显微镜下观察4组形态变化,并通过免疫组化鉴别结蛋白和心肌肌钙蛋白I(cardiactroponinI,cTnI)表达及其出现时间的早晚。结果:RT-PCR显示诱导6周后有心房利钠肽,脑钠肽的表达。Ⅱ组MSCs诱导后10d可见细胞由原来扁平多角形变成长梭状,15d后部分细胞胞体明显增粗,可见到有些细胞间有融合样情况发生,20d左右类似肌管样细胞出现;而Ⅰ组在17d左右可以看到类似肌管样细胞;Ⅲ,Ⅳ组未见上述形态改变。免疫组化表明Ⅲ,Ⅳ组未见阳性细胞出现;Ⅰ,Ⅱ组可见阳性结果,且Ⅰ组阳性结果出现的比Ⅱ组更早。结论:MSCs在体外的化学诱导物条件下可以诱导分化成心肌样细胞,心肌细胞培养环境对其定向分化成心肌样细胞有促进作用。     

心肌内注射碱性成纤维细胞生长因子对兔骨髓间充质干细胞自体移植的影响

目的:了解骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)在心肌梗死的缺血心肌微环境中转化为心肌细胞并改善心功能的可行性,及同时心肌内注射碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)对此过程的影响。方法:将21只兔结扎左前降支制作急性心肌梗死模型,骨穿抽取骨髓,分离培养扩增MSCs。随机分成3组,术后2周进行心肌梗死瘢痕内移植5-溴脱氧尿嘧啶(bromodeoxyuridine,BrdU)标记的MSCs(加或不加bFGF)(MSCs组、MSCs+bFGF组),对照组注射培养基。心肌梗死手术前、手术后3d及移植后4周做超声心动图检测心功能,处死动物取左室标本作冷冻切片,采用免疫荧光法鉴定植入细胞,并检测VIII因子相关抗原以测量毛细血管密度。结果:两细胞移植组左室切片中均可见BrdU染色阳性细胞即植入细胞。对照组未见BrdU染色阳性细胞。VIII因子阳性内皮细胞计数表明MSCs组及MSCs+bFGF组毛细血管密度分别为每高倍视野29±8和31±6,显著高于对照组(21±5)(F=11.971,P<0.01),超声心动图检测证实MSCs组及MSCs+bFGF组移植后4周射血分数显著大于对照组(F=5.850,P<0.05),两细胞移植组间上述各项差异无显著性意义(P>0.05)。结论:缺血心肌内注射MSCs可依赖组织微环境转化为心肌细胞修复梗死心肌,促进血管新生从而改善心功能,可     

诊断超声联合微泡增强骨髓间充质干细胞归巢兔缺血心肌的研究

目的 探讨诊断超声联合微泡对经静脉移植兔骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)归巢缺血心肌的靶向能力.方法 采用密度梯度离心与贴壁法培养兔BM-MSCs,用DAPI标记细胞.完全结扎冠状动脉左前降支(LAD)法建立兔心肌梗死模型.将分离培养的BM-MSCs经静脉途径移植人心肌梗死兔体内.根据移植时是否介入超声与微泡分成单纯静脉移植MSCs组与超声辐照+微泡+MSCs组,移植后48 h荧光显微镜下观察缺血梗死区域及其周围的荧光标记阳性细胞数目,并对两组进行计数和统计学分析.HE染色观察局部缺血心肌的病理学改变.透射电镜观察心肌血管及内皮细胞情况.结果 荧光显微镜下显示超声辐照+微泡+细胞组较单纯静脉细胞移植组阳性细胞分布更为密集.单纯静脉细胞移植组与超声辐照+微泡+细胞组阳性细胞个数分别为(146.8±18.78)个和(213.2±26.5)个,差异有统计学意义(P<0.01).HE染色结果显示超声+微泡+细胞组缺血心肌及周围区心肌组织间隙可见红细胞成分漏出,而单纯细胞组无此发现.透射电镜显示在超声联合微泡的介导下,心肌血管内皮细胞间隔增大,血浆成分渗出.结论 超声联合微泡经静脉移植MSCs后能增加MSCs在缺血及周围区心肌的聚集与归巢,增强其靶向性.     

外环境对骨髓间充质干细胞分化成心肌样细胞的影响

目的：研究外环境对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)定向分化成心肌样细胞的影响。方法：取SD大鼠骨髓，通过贴壁法进行MSCs培养，经过多次传代后获得较纯的MSCs。用59氮胞苷进行诱导分化，显微镜下观察其形态变化，通过RT-PCR鉴定心肌特异基因心房利尿肽和脑钠肽表达。实验分I组为在玻片上的5-氮胞苷干预的MSCs移人到心肌细胞培养环境中；Ⅱ组为5-氮胞苷干预的MSCs；Ⅲ组为玻片上未用5-氮胞苷干预的MSCs移入到心肌细胞培养环境中；Ⅳ组为未用5-氮胞苷干预的MSCs。显微镜下观察4组形态变化，并通过免疫组化鉴别结蛋白和心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin，cTnI)表达及其出现时间的早晚。结果：RT-PCR显示诱导6周后有心房利钠肽，脑钠肽的表达。Ⅱ组MSCs诱导后10d可见细胞由原来扁平多角形变成长梭状，15d后部分细胞胞体明显增粗，可见到有些细胞间有融合样情况发生，20d左右类似肌管样细胞出现；而I组在17d左右可以看到类似肌管样细胞；Ⅲ，Ⅳ组未见上述形态改变。免疫组化表明Ⅲ，Ⅳ组未见阳性细胞出现；I，Ⅱ组可见阳性结果，且I组阳性结果出现的比Ⅱ组更早。结论：MSCs在体外的化学诱导物条件下可以诱导分化成心肌样细胞，心肌细胞培养环境对其定向分化成心肌样细胞有促进作用。     

自体骨髓间充质干细胞心肌移植后的分化及存活

背景:骨髓间充质干细胞移植入急性心肌梗死组织后是否能迁移、分化及存活,目前尚不清楚.目的:观察兔骨髓间充质干细胞移植入急性心肌梗死组织后,在体内的迁移、分化及其存活.方法:分离培养兔骨髓间充质干细胞,体外DAPI标记细胞.结扎兔左前降支制作急性心肌梗死模型,造模成功后30只新西兰大耳兔抽签法分为骨髓间充质干细胞组和对照组,每组15只.骨髓间充质干细胞组于冠状动脉结扎后1 h在梗死周边区用微量注射器分4点注射自体骨髓间充质干细胞.对照组于相同部位注射等量生理盐水.每点注射体积30 μL.分别于移植后10 min,3 d,4周时各组各处死5只动物.取心脏行冰冻切片,荧光显微镜观察DAPI标记骨髓间充质干细胞的分布情况;免疫荧光法检测标记细胞是否表达心肌特异性肌钙蛋白Ⅰ和α-肌动蛋白.结果与结论:DAPI标记的骨髓间充质干细胞在兔急性心肌梗死模型心脏微环境中,蓝色细胞核分布广泛,呈椭圆形,似心肌细胞核,其排列方向与宿主心肌纤维方向一致,间接免疫荧光法检测胞浆心肌特异性蛋白肌钙蛋白Ⅰ、α-肌动蛋白均为阳性.说明缺血心肌内移植入骨髓间充质干细胞,可在局部微环境的刺激下向心肌细胞定向分化.