深低温保存角膜缘干细胞活性实验研究

目的：评价深低温冷冻保存兔眼角膜缘干细胞活性。方法：１２只（１２眼）新西兰白兔，制备２ｍｍ周边角膜和２ｍｍ球结膜的环形浅层角膜缘植片及解膜干细胞缺乏眼表疾病模型。角膜缘植片通过程序温仪程序降温后－１９６℃深低温保存，３０天和６０天后行角膜缘自体移植。组化及免疫组化证实深低温保存的角膜缘干细胞活性。结果：角膜干细胞缺乏导致角膜上皮愈合延迟，上皮结膜化，ＰＡＳ染色阳性，ＡＥ５染色弱阳性；基质水肿，角膜     

深低温保存角膜缘干细胞移植治疗眼表疾病初步研究

目的:应用深低温保存的角膜缘干细胞同种异体移植治疗眼表疾病.方法:新鲜供体取穿透性移植片后剩下的角膜缘干细胞行程序降温,深低温保存,4例5眼临床眼表疾病应用深低温保存的角膜缘干细胞移植片行同种异体移植.结果:5眼角膜上皮修复且稳定,上皮平均愈合时间为7.6±5.7天,无感染、排斥等不良反应,除1眼视力无改变外,其余4眼视力均有不同程度提高.结论:深低温保存法能够将穿透性角膜移植剩下的角膜缘干细胞重新利用,为临床角膜缘干细胞移植治疗眼表疾病提供了可利用的材料.     

兔角膜缘干细胞的体外培养和生物学特性观察

目的 探讨兔角膜缘干细胞的体外培养方法并观察其生物学特性。方法 采用消化培养法，分2组培养，1组为消化并过滤后的角膜缘干细胞培养组，另1组为消化后未过滤的带组织块培养组，均用含20％胎牛血清的培养液培养，待细胞长成良好单层后消化传代，分别观察记录细胞在原代和传代培养时的生长特性并行HE染色观察。结果 过滤组角膜缘干细胞在培养24h后开始贴壁生长，7～10d形成良好单层，细胞以圆形或椭圆形为主，核较大，呈原始细胞特征，传代培养时见细胞体积逐渐增大，核变小，成纤维细胞少见；带组织块培养组原代培养时与过滤组无明显差异，传代时则见成纤维细胞渐增多，至第3代时占主导并抑制了角膜缘干细胞的生长。结论 采用消化培养法可成功培养出兔角膜缘干细胞，培养时应滤除组织块以减少成纤维细胞的影响。     

角膜缘干细胞体外培养的研究进展

<正>角膜上皮细胞具有自我更新的能力,眼表的正常结构和功能的维持有赖于角膜缘干细胞的不断分化、增殖、移行来完成。随着眼表疾病研究有突破性进展,角膜缘干细胞在眼表中的重要性越来越受到人们的重视,角膜缘干细胞体外培养的研究也日渐增多。笔者现就角膜缘干细胞的体外培养与临床应用作     

不同来源人角膜缘干细胞的体外培养研究

目的探讨胎儿和成人角膜缘干细胞的体外培养方法并观察其生物学特性。方法应用消化培养法对胎儿和成人角膜缘上皮组织分别进行体外培养,观察记录培养细胞的生长特性并计算其克隆形成率(colony-form-ing efficiency,CFE)。对胎儿和成人角膜缘组织及培养细胞采用一系列单克隆抗体进行免疫酶细胞化学染色检测;并用扫描电镜观察原代细胞的表面状况。结果胎儿角膜缘干细胞原代培养时生长旺盛,8~10 d达到生长高峰,CFE为(26.18±4.75)%,传代时保持高增殖速率;成人角膜缘干细胞原代培养时生长不及胎儿细胞旺盛,6~8d达到生长高峰,CFE为(15.45±3.88)%,随着传代次数增加其增殖能力明显下降;两种细胞原代培养时CFE值差异有显著性(t=6.78,P<0.001)。免疫酶细胞化学染色见培养前胎儿角膜缘组织基底层有多量AE5阴性、AE1和PCNA阳性细胞,并见较多HLA-DR阳性细胞;胎儿原代培养细胞绝大部分AE5和HLA-DR染色阴性,AE1和PCNA阳性;传代培养至第3代时AE5阴性细胞仍占大部分;成人角膜缘组织及培养细胞染色结果则见上述干细胞特征细胞数量比例较低,而HLA-DR染色结果相似。扫描电镜观察胎儿原代细胞以球形或短圆柱形为主,表面多突起和微绒毛,成人原代细胞形态相似,但直径较大。结论采用消化培养法可成功培养出具有高增殖力等干细胞特性的胎儿角膜缘干细胞,其抗原性较培养前明显降低,且其生物学特性显著优于成人角膜缘干细胞,是一种新的优越的角膜缘干细胞来源,将在临床眼表重建中展现广阔的应用前景。     

深低温保存兔角膜神经形态的观察

采用氯化金染色、乙醛酸诱发荧光（ＧＩＦ）和乙酰胆碱酯酶染色（ＡＣｈＥＳ）技术分析对兔深低温保存角膜中总体神经、肾上腺能和乙酰胆碱能神经形态进行系统观察。结果表明，深低温保存角膜的氯化金染色和ＡＣｈＥＳ神经形态与正常角膜神经相一致，但ＧＩＦ却为阴性。提示在光镜下，深低温保存角膜过程对角膜神经不造成形态损害。     

人胎儿角膜缘干细胞的体外培养及鉴定

目的 探讨人胎儿角膜缘干细胞的体外培养及鉴定方法。方法 应用消化培养法对人胎儿角膜缘上皮组织进行体外培养并观察记录培养细胞的生长特性；对胎儿角膜缘组织及培养细胞采用一系列单克隆抗体进行免疫酶细胞化学染色检测；并用扫描电镜观察原代细胞的表面状况。结果 胎儿角膜缘上皮细胞原代培养时生长旺盛，传代培养时保持高增殖速率。免疫酶细胞化学染色见培养前胎儿角膜缘组织基底层有多量AE5阴性、AE1和PCNA阳性细胞，并见较多HLA-DR阳性细胞；原代细胞绝大部分AE5和HLA-DR染色阴性，AEI和PCNA阳性；传代培养至第3代时AE5阴性细胞仍占大部分；扫描电镜观察原代细胞以球形或短圆柱形为主，表面多突起和微绒毛。结论 采用消化培养法可成功培养出具有高增殖力和低抗原性的人胎儿角膜缘干细胞．为临床眼表重建开辟了新的思路。     

兔角膜缘干细胞的体外原代培养和生物学鉴定

目的 建立兔角膜缘干细胞体外培养方法,观察其生物学特性。方法 用含20％胎牛血清1640培养液对兔角膜缘干细胞进行体外培养,倒置显微镜观察培养细胞体外生长的形态,电镜观察培养细胞的超微结构并进行免疫细胞化学和间接免疫荧光鉴定。结果 植块48～72h细胞开始贴壁生长,7～10d形成良好的单层,细胞呈圆形、卵圆形或多边形,类似角膜上皮细胞;电镜下,可见细胞表面有许多微绒毛,细胞间有桥粒连接,胞质丰富,胞质细胞器较多,含有线粒体等结构;免疫细胞化学和间接免疫荧光染色显示,培养第8天少量细胞角蛋白K3(AE5)免疫反应呈阳性,细胞质被染色,培养第14天和第21天,较多细胞．AE5免疫反应阳性。结论 含20％胎牛血清1640培养液能作为角膜缘干细胞培养的基础液。应用组织培养方法获得的原代培养细胞具有与正常角膜缘干细胞相一致的生物学特性。     

深低温保存兔角膜神经形态的观察

采用氯化金染色、乙醛酸诱发荧光（ＧＩＦ）和乙酰胆碱酯酶染色（ＡＣｈＥＳ）技术分别对兔深低温保存角膜中总体神经、肾上腺能和乙酰胆碱能神经形态进行系统观察。结果表明，深低温保存角膜的氯化金染色和ＡＣｈＥＳ神经形态与正常角膜神经相一致，但ＧＩＦ却为阴性。提示在光镜下，深低温保存角膜过程对角膜神经不造成形态损害。     

兔角膜缘干细胞的体外培养、鉴定及形态学特点

目的 体外培养兔角膜缘干细胞(limbal stem cells,LSCs),观察其生物学特性.方法 用含20%胎牛血清DMEM:F12(1:1)培养基对兔LSCs进行体外培养,倒置显微镜及HE染色观察培养细胞体外生长的形态,免疫细胞化学AE5和P63染色鉴定并进行图像分析,透射电镜观察超微结构特点.结果 培养2～3 d细胞从组织块游出,6～8 d形成良好的单层,细胞多呈圆形或卵圆形.电镜观察,培养7 d LSCs呈卵圆形,表面有少量微绒毛突起;胞质内细胞器少,核大,核仁明显,核浆比例大,部分细胞可见双核现象.免疫组化观察,培养第7天,大量细胞AE5免疫反应染色呈阴性,阳性细胞数量较少,大量细胞P63免疫反应染色呈阳性;培养第14天,AE5阳性细胞数明显增多,免疫反应染色增强,阳性细胞的平均灰度值显著降低(7 d:184.30±9.85,14 d:133.36±25.00,P<0.01).P63免疫反应阳性细胞数第14天与第7天相比明显减少,而阳性细胞的平均灰度值显著增高(7 d:108.13±17.96,14 d:177.59±7.86,P<0.01).结论 应用组织培养方法获得的原始细胞具有与体内正常LSCs相一致的形态特征;培养第7天为LSCs生长的峰值期.     

兔骨髓间充质干细胞的提取与体外培养

目的 通过提取兔骨髓中间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)并加以纯化，在体外培养条件下研究其增殖及生长特性。方法 从骨髓中提取间充质干细胞，体外培养扩增，再以相差显微镜、电镜观察并绘制生长曲线。结果 原代培养及传代培养显示，兔自体骨髓间充质干细胞具有活跃的增殖倍增能力；骨髓间充质干细胞内细胞器与其生物活性变化相一致。结论 骨髓间充质干细胞体外培养成功，为今后利用自体间充质干细胞通过组织工程学方法修复软骨、骨、肌肉系统的组织缺损奠定了基础。     

小鼠骨髓间质干细胞的体外培养与多向分化潜能的鉴定

 【目的】 建立小鼠骨髓间质干细胞(MSC)体外培养?纯化?扩增方法,并进行体外定向诱导条件下的多向分化潜能鉴定?【方法】 取3～18月雄性C57BL/6J小鼠(共48只)骨髓细胞,贴壁培养后,用免疫磁珠法纯化,观察纯化后的细胞形态,对3?10?20代的MSC进行细胞生长曲线绘制;并检测细胞在不同诱导条件下向成骨细胞?脂肪细胞?肌肉细胞的分化能力?【结果】 小鼠MSC在体外可以诱导成成骨细胞?脂肪细胞?肌肉细胞?MSC连续传代培养达30代以上,细胞的形态?抗原表达无改变,并保持多向分化潜能?【结论】 该方法获得的MSC具有高度增殖?多向分化潜能?生物学特性稳定的特点?     

兔骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为心肌细胞的实验研究

目的体外诱导兔骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）向心肌细胞分化,进一步证实其多向分化特性.方法分离、培养兔的MSCs,将第5代的MSCs在体外经5-氮胞苷诱导4周后,进行免疫组化鉴定和电镜观察.结果5-氮胞苷诱导MSCs4周,部分细胞表达肌钙蛋白T（troponin T）,电镜观察到肌丝形成.结论MSCs是存在于骨髓中的多能干细胞,在体外经5-氮胞苷诱导可转化为心肌细胞.     

兔骨髓基质干细胞体外培养的生物学特性

目的：分离培养兔骨髓基质干细胞并探讨其体外生物学特性。方法：通过梯度密度离心法分离兔骨髓基质干细胞,体外培养、扩增,观察细胞的大体形态和超微结构;通过绘制细胞生长曲线、四甲基谷氮唑盐（MTT）实验来研究细胞的增殖能力和代谢活性。结果：兔骨髓基质干细胞呈梭形,胞浆内有丰富的粗面内质网和线粒体,具有很强的增殖能力和代谢活性。结论：本实验方法取材方便,能较容易地获得大量的兔骨髓基质干细胞。     

兔晶状体前囊膜为角膜缘干细胞培养载体的初步研究

目的研究兔晶状体前囊膜作为干细胞移植载体治疗角膜缘干细胞缺乏的潜在用途。方法用组织块培养法将兔角膜缘干细胞分别种植于兔晶状体前囊膜上（分为同种自体种植和同种异体种植组）和同种自体兔角膜基质上,采用细胞计数和台盼蓝染色鉴定细胞活力,分别于种植的第2、4、8和12d观察在其上的生长情况。实验所得数据采用（±S）表示,采用SPSS13.0软件对资料进行分析。结果晶状体前囊膜自体组和异体组角膜缘干细胞计数和细胞活力检测差别无统计学意义。自体组和异体组与基质组对比时发现,除自体组第8d（P=0.000）和异体组的第2d（P=0.023）差别有统计学意义外,余各d都无统计学意义。结论兔晶状体前囊膜可作为角膜缘干细胞移植的载体。     

人骨髓间充质干细胞体外优化条件的研究

目的通过比较5种不同体外培养人骨髓问充质干细胞（hMSCs）条件，找到一种能在质和量上均能满足需要的体外培养条件。方法使用Percoll-Paque液（1．073g／ml）分离人骨髓血，采用DMEM＋15%的小牛血清、人体白蛋白、人血清、脐带血清及MesenCult培养基，在相同培养条件下，动态观察hMSCs的生长状况、细胞数量变化，通过流式细胞仪检测细胞的纯化状况。结果5种培养条件在一定时相内均能获得较为纯化的hMSCs，但在生长速度和纯化率上存在一定的差异。结论Mesen Cult是一种较为优秀的hMSCs培养基．胎儿脐带血清培养也能在短期内获得足量纯化的hMSCs．人血清的使用还需要做进一步的研究。