人前列腺特异性膜抗原cDNA的克隆、原核表达、鉴定和抗原初步纯化

目的　克隆中国人前列腺特异性膜抗原 (PSMA)cDNA全长 ,构建PSMA原核表达重组子。诱导PSMA原核表达 ,并对表达产物进行初步纯化。　方法　从前列腺癌患者组织中提取总RNA ,利用PSMAcDNA中的EcoRⅠ位点 ,将PSMA分为两段分别作RT PCR ,分别连接到pET 30a中 ,从而得到完整PSMAcDNA的原核表达重组子pET 30a PSMA ,并进行酶切鉴定与序列测定。确定序列正确后 ,利用IPTG诱导重组子表达 ,采用Ni NTAAgarose螯合层析柱对表达产物初步纯化 ,SDS PAGE和Western Blotting对表达产物和纯化产物进行鉴定。　结果　成功克隆到序列完全正确的人源PSMAcDNA ,诱导表达并初步纯化出PSMA蛋白 ,该蛋白具有较好的抗原性和特异性。　结论　此项研究为PSMA功能的研究及前列腺癌噬菌体抗体库的筛选提供了实验依据     

HBV表面抗原大蛋白与人胰腺突触角蛋白6之间的相互作用

目的 验证HBV表面抗原大蛋白(LHBs)与人胰腺突触角蛋白6 (STX6)在细胞内是否存在相互作用,为进一步研究HBV影响糖、脂代谢机制奠定研究基础.方法 构建真核表达质粒pACT-STX6,采用哺乳动物双杂交技术验证LHBs与STX6之间的相互作用.结果 实验组和各阴性对照组相对荧光素酶活性值均存在差异,且均具有显著统计学意义(P＜ 0.01).结论 LHBs与人胰腺STX6在胰腺细胞内存在相互作用.     

DOC-1基因的原核表达载体构建及其重组蛋白的表达纯化

目的：克隆DOC-1基因、构建原核表达载体并纯化出其重组蛋白。方法：从人胎脑组织中提取总RNA，经逆转录一聚合酶链式反应（RT—PCR）扩增DOC-1的CDS序列，再通过基因重组技术将该基因片段依次克隆到pMO18-T和pGEX-4T-1载体中，构建融合表达载体pGEX-4T-1-DOC-1，经酶切、测序鉴定后，用该重组质粒转化E．coliBL21，用IPTG诱导表达，Glutathlone Sepharose 4B柱亲和层析纯化重组蛋白。结果：电泳证实RT-PCR扩增产物与预期目的基因DOC-1长度一致，测序结果与GenBank公布的DOC-1基因序列完全一致，IPTG诱导后经SDS—PAGE电泳分析表明，在相对分子质量38000左右出现新的蛋白表达条带，经亲和层析柱纯化后得到高纯度的GST-p12重组蛋白。结论：成功构建了pGEX-4T-1-DOC-1原核表达载体，表达并纯化出GST-p12重组蛋白，为进一步研究p12^DOC-1蛋白打下了实验基础。     

Tat-Vp3融合蛋白在杆状病毒-昆虫细胞表达系统中的表达与纯化及其促凋亡功能的研究

目的：采用杆状病毒-昆虫细胞表达系统获取可溶性 His-Tat-Vp3融合蛋白,并观察其对细胞增殖和凋亡的影响。方法：构建重组质粒 pFastBacTM1-TAT-VP3,转化DH10Bac 感受态细胞,获得杆状病毒质粒,转染 Sf9昆虫细胞,得到重组杆状病毒,纯化并扩增该病毒。用最适滴度的病毒刺激 Sf9细胞以诱导 His-Tat-Vp3蛋白表达,经 SDS-PAGE和 Western bolt鉴定,获得分子质量约21 kDa 的融合蛋白。采用 MTT 实验与流式细胞技术检测500、1000、2000 nmol/L的融合蛋白抑制肿瘤细胞（HeLa细胞）增殖及促凋亡的活性。结果：通过昆虫表达系统成功表达及纯化出Tat-Vp3融合蛋白,其中1000、2000 nmol/L融合蛋白组可显著抑制肿瘤细胞的增殖,并提高细胞的凋亡率。结论：成功构建 His-TAT-VP3融合蛋白昆虫系统表达载体,在昆虫表达系统中可诱导性可溶性高表达,所获融合蛋白能显著抑制 H eLa细胞的增殖,并促进其凋亡。     

CD11a、CD11b和CD62L在原发性系膜增殖性肾小球肾炎肾组织中的表达

我们探讨CD11a（淋巴细胞功能相关抗原-1的α链）、CD11b（巨噬细胞分化抗原-1的α链）和CD62L（L-选择素，白细胞黏附分子-1）在原发性系膜增殖性肾小球肾炎（MsPGN）中肾组织的表达情况。     

左旋布比卡因和布比卡因对体外人中性粒细胞黏附分子CD11b表达的影响

目的评价左旋布比卡因和布比卡因对体外人中性粒细胞(PMN)黏附分子CD11b表达的影响。方法健康志愿者12名,男性、女性各6名,体重55～68kg,年龄20～25岁。每名健康志愿者取8份(每份0.2ml)血样,分别随机接受不同处理:0.2ml血样+10μl磷酸盐缓冲液,37℃孵育60 min(对照组,Ⅰ组);Ⅱ组、Ⅲ组在Ⅰ组基础上分别加入血小板活化因子(PAF)、趋化寡肽(FMLP);Ⅳ组在Ⅰ组基础上加PAF,37℃孵育5min后加FMLP;Ⅴa组、Ⅴb组和Ⅴc组在Ⅳ组基础上加入布比卡因10μl,浓度分别为1×10~(-6)、1×10~(-5)和1×10~(-4)mol/L;Ⅵ组在Ⅳ组基础上加入左旋布比卡因10μl(终浓度为1×10~(-4)mol/L)。FMLP和PAF终浓度均为1×10~(-6)mol/L。测定PMN黏附分子CD11b的表达。结果与Ⅰ组比较,Ⅱ组CD11b表达差异无统计学意义(P>0.05),Ⅲ组、Ⅳ组CD11b表达上调;Ⅳ组高于Ⅲ组(P<0.01)。与Ⅳ组和Ⅴa组比较,Ⅴb组、Ⅴc组和Ⅵ组CD11b表达下调;Ⅴc组低于Ⅴb组(P<0.05或0.01);Ⅴc组与Ⅵ组差异无统计学意义(P>0.05)。结论布比卡因可抑制PAF和FMLP诱导PMN黏附分子CD11b的表达,且呈浓度依赖性;左旋布比卡因和布比卡因对PMN黏附分子CD11b表达的抑制作用无差异。     

大鼠肝星状细胞的原代分离、培养与鉴定

目的:介绍一种合理、实用、便捷的肝星状细胞(HSCs)原代培养方法.方法:对SD大鼠进行肝脏原位灌注、酶消化,并进行间质细胞密度梯度离心.使用20%、35%和50%三层Percoll密度梯度分离纯化HSCs,分析其纯度、活力,并根据原代和传代HSCs的特征进行鉴定.结果:每只鼠肝HSCs原代培养得率为(1.5~2)×107个细胞,纯度为(97±2)%,细胞活力为(98±0.6)%.原代和传代HSCs都表达Desmin,只有传代7 d的HSCs表达α-SMA.电镜见细胞浆内大量脂滴.结论:本方法简单、实用、方便,所得结果优于其他方法.     

新基因BC047440原核表达载体构建及其重组蛋白的表达纯化

目的 构建肝癌相关新基因BC047440原核表达载体,表达并纯化出其重组蛋白.方法 从HepG2细胞中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增BC047440cDNA,克隆进质粒pMD19-T,转化E.coliDH5α,测序正确后,酶切目的基因片段,插入质粒pET-28a(+),转化E.coliBL21,IPTG诱导蛋白表达,Ni-NTA柱亲和层析纯化重组蛋白.结果 电泳证实RT-PCR扩增产物与预期目的基因BC047440长度一致.RT-PCR纯化产物与载体pMD19-T连接后,经蓝白斑筛选,挑出5个白色菌落做酶切鉴定,其中2个菌落被证实为阳性克隆.测定其基因序列,结果显示与Genbank公布的BC047440基因序列完全一致.将BC047440cDNA插入质粒pET-28a(+),转化E.coliBL21,培养过夜后,挑选7个白色菌落做酶切鉴定,证实均为阳性克隆.IPTG诱导其中一个克隆表达蛋白,SDS-PAGE电泳分析表明,在相对分子质量23000左右出现新的蛋白表达条带,诱导4h后表达蛋白量最多,占菌体总蛋白的22.3%.将诱导3h的菌体超声破碎后,Ni柱亲和层析,50和125mmol/L咪唑洗脱液SDS-PAGE电泳显示出清晰的单一条带.结论 成功构建BC047440基因原核表达载体,表达并纯化出重组蛋白,为深入研究其临床应用打下基础.     

结核分枝杆菌抗原ESAT-6和CFP-10及rCFP10-ESAT6融合基因在大肠埃希菌中的表达及比较

目的 构建结核早期分泌抗原靶分子(ESAT-6)、培养滤液蛋白10(CFP-10)及重组CFP10-ESAT6(rCFP10-ESAT6)融合蛋白的原核表达载体,获得纯化蛋白并比较三者表达特点.方法 应用聚合酶链反应(PCR)技术,扩增ESAT-6、CFP-10基因片段,融合PCR技术扩增rCFP10-ESAT6片段,分别连接到pGEM-T载体,测序正确后插入原核表达载体pET-32a(+)或 pET-28a(+)中,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,亲和层析法纯化3种蛋白;十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、Western blot分析验证目的蛋白的抗原特异性.结果 pET-32a(+)-ESAT6融合蛋白以包涵体形式表达,分子量为31 kD,目的蛋白约占菌体总蛋白的42%;pET-32a(+)-CFP10、pET-28a(+)-CFP10-ESAT6重组蛋白以可溶性形式表达,分子量分别为33 kD和28 kD,目的蛋白分别占菌体总蛋白的73%和48%;Western blot证实其均具有良好的抗原性.亲和层析法获得了纯度较高的重组蛋白.结论 利用大肠埃希菌BL21(DE3)成功表达了具有良好抗原性的ESAT-6、CFP-10融合蛋白及rCFP10-ESAT6重组蛋白,为深入研究其免疫原性和生物学特性奠定了基础.