负载TGF-β1微球的壳聚糖-丝素支架复合骨髓间充质干细胞修复兔关节软骨缺损的实验研究

目的研制负载转化生长因子β1（transforming growth factor—β1,TGF—B。）壳聚糖微球的壳聚糖-丝素支架复合骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）体外构建组织工程软骨,观察将其移植修复兔膝关节软骨缺损的效果。方法通过密度梯度离心法及贴壁培养法分离纯化MSCs,以抗兔CD14、CD44等单抗采用流式细胞仪进行MSCs表面抗原鉴定,获得纯化的MSCs。采用乳化交联法获得包裹TGF—B,壳聚糖缓释微球,并将该微球负载在冷冻干燥获得的壳聚糖一丝素支架上。将培养的MSCs种植到支架上,体外构建组织工程软骨,移植到兔关节软骨缺损处。移植空白支架的为实验对照组,移植体外构建的组织工程软骨为实验组。主要观察指标,流式检测的MSCs细胞表面标记情况,微球的形态,支架与细胞共培养后电镜下情况,支架移植后的兔关节修复情况及组织学检查。结果流式检测MSCs第4代及第9代细胞的CD14及CD44表面抗原的表达情况发现两代MSCsCD14表达基本呈阴性,CD44表达呈阳性,符合间充质干细胞的特性。扫描电镜观察所制备的微球基本呈球形,表面光滑,直径约为1μm,大小较均一,分散度好。细胞在壳聚糖-丝素三维支架上生长状态良好,电镜观察,可见支架孔隙内有细胞黏附生长。移植治疗后发现实验组修复明显好于对照组,实验组术后3个月实验组已经有较硬的类软骨组织填充修复,切片显示有软骨细胞规则排列,甲苯胺蓝染色为阳性,而对照组仅为纤维组织修复,切片显示为纤维组织或纤维软骨组织修复,软骨细胞排列紊乱,甲苯胺蓝染色阴性或弱阳性。结论负载TGF—β1壳聚糖微球的壳聚糖-丝素支架复合骨髓间充质干细胞体外复合培养后移植治疗修复兔膝关节软骨缺损,具有较好的疗效。     

兔骨髓间充质干细胞定向诱导移植修复关节软骨的实验研究

目的：通过诱导兔骨髓间充质干细胞（MSCs）,观察干细胞向软骨细胞的分化效果。方法：纯化兔骨髓间充质干细胞;用含转化生长因子β1的诱导液培养骨髓间充质干细胞;以MTT测定诱导细胞的增殖活性;免疫组化检测Ⅱ型胶原蛋白的表达;诱导后的细胞移植于白兔膝关节内,X线摄片观察软骨修复形成情况。结果：诱导液可有效诱导MSCs向软骨细胞表型转化,且骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化所需的特异性细胞外基质——Ⅱ型胶原明显升高,移植后效果明显。结论：兔骨髓间充质干细胞定向诱导后移植修复关节软骨是有效的。因此骨髓间充质干细胞有可能成为软骨组织工程较理想的种子细胞来源。     

体外诱导骨髓间充质干细胞构建纤维蛋白胶软骨模块

目的:探讨体外构建骨髓间充质干细胞、改良纤维蛋白胶及生长因子的组织工程软骨模块的可行性。方法:分离兔骨髓间充质干细胞,种植在改良纤维蛋白胶支架内。实验组培养液中加入TGF-β1和BMP-6,对照组未加入诱导因子。体外进行形态组织学观察。1、2、3和4周取材作Masson染色、Ⅱ型胶原染色和扫描电镜观察。结果:细胞在支架上贴附,增殖。实验组中Masson染色可见胞浆及细胞周围有胶原形成;Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。结论:TGF-β1和BMP-6可诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化,在改良纤维蛋白胶支架内体外成功构建组织工程软骨模块。     

β-磷酸三钙-脱细胞软骨支架复合兔BMSCs修复膝关节软骨缺损的实验研究

目的观察纳米磷酸三钙人工骨(β-TCP)、转化生长因子-β(TGF-β)、胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)、脱细胞耳软骨(DC)复合软骨细胞修复关节软骨缺损的效果。方法获取新西兰大白兔骨髓间充质干细胞(BMSCs),培养并体外诱导成软骨细胞,取异体兔耳软骨进行脱细胞处理,与β-TCP形成复合支架作为载体接种软骨细胞,加入TGF-β和IGF-I修复膝关节软骨缺损。实验动物(n=18)分为3组,实验组(n=8)复合支架加入TGF-β和IGF-I,对照组(n=6)仅以复合支架修复缺损,空白组(n=4)不加入任何修复材料。结果 BMSCs在体外生长稳定,增殖能力强,可被诱导为软骨细胞。软骨支架脱细胞完整,软骨陷窝排列有序,复合物植入缺损后第20周,实验组缺损内充填白色半透明新生软骨组织,色泽与正常软骨相似,与周围正常软骨连接良好。结论β-TCP-DC复合支架有较多的孔隙结构,降解速度快,组织相容性及细胞黏附性好,是组织工程修复关节软骨理想的种子细胞载体。     

鹿茸多肽对兔骨髓间充质干细胞移植修复关节软骨缺损的影响

为探讨经鹿茸多肽诱导的兔自体骨髓间充质干细胞-胶原膜支架(MCMG)复合物修复兔膝关节软骨缺损的效果,抽取兔骨髓液经体外分离、培养获得兔MSCs.选用健康的新西兰大白兔27只,随机分成A、B、C 3组.A组以未经诱导的自体MSCs-MCMG复合物修复兔膝关节软骨缺损;B组以经TGF-β1诱导后的自体MSCs-MCMG复合物修复兔膝关节软骨缺损;C组以经鹿茸多肽诱导后的自体MSCs-MCMG复合物修复兔膝关节软骨缺损.分别于术后2、4、8周取材,行HE、甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色观察各组兔膝关节软骨缺损修复情况.结果显示术后8周,C组修复软骨缺损的效果无论从大体标本观察或是组织学检查都与B组的修复效果相当,而且C组与B组修复效果明显优于A组.说明经鹿茸多肽诱导的兔自体MSCs-MCMG复合物移植可提高兔膝关节软骨缺损的修复质量.     

丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石骨组织工程支架材料的体外细胞毒性评价

目的 探讨丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石生物支架与兔骨髓间充质干细胞的体外细胞毒性.方法 采用丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石构建的生物支架与兔骨髓间充质干细胞体外共培养,用材料的细胞毒性、细胞黏附率、细胞增殖活力指标以MTT法、倒置显微镜及电镜观察来评价.结果 细胞在支架材料上黏附、生长良好,分裂增殖活跃,细胞毒性检测CTG均为0级,实验组与时照组细胞黏附率比较无统计学差异（P＞0.05）,实验组与对照组细胞增殖活力随着时间增加,细胞在支架增殖速度增快.第1、3、5、7天实验组与对照组比较有统计学差异（P＜0.05）.扫描电镜观察发现细胞培养7天后生长良好,分裂正常,与支架材料黏附紧密.结论 支架材料对细胞无毒性,具有很好的细胞相容性.     

间充质源性软骨种子细胞与脱细胞软骨复合培养构建软骨组织

目的兔外周血间充质源性软骨种子细胞与同种异体脱细胞软骨体外复合培养,构建新型软骨组织,为临床修复器官缺损及再造提供实验基础。方法提取兔外周血间充质干细胞,行体外诱导培养14 d获得软骨种子细胞,显微镜下观察细胞生长特性,制作细胞爬片行甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色。联合去垢剂—酶法获得兔脱细胞肋软骨支架,软骨种子细胞与同种异体脱细胞软骨支架体外复合培养7 d获得复合软骨,脱细胞软骨及复合软骨固定后行扫描电镜观察及组织学HE、甲苯胺蓝染色。结果兔外周血间充质干细胞体外诱导培养14 d,胞浆内较多软骨细胞特异性Ⅱ型胶原分泌;兔脱细胞软骨呈乳白色,结构完整、孔隙均匀,仍保存大量酸性黏多糖及胶原成分,其孔隙率(61.31±8.45)%,孔径长度(32.80±5.15)μm。支架与软骨细胞黏附良好,并伴有多量基质分泌。结论间充质源性软骨种子细胞与同种异体脱细胞软骨体外复合培养可构建新型软骨组织,本研究为临床修复器官缺损及再造提供了实验依据。     

人骨髓间充质干细胞体外成软骨诱导研究

目的:研究人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在体外培养过程中的增殖和成软骨分化现象和规律。方法:以密度梯度离心法分离健康成人髂骨MSCs,观察体外培养过程中细胞形态、生长和增殖现象。取第三代细胞给予地塞米松,维生素C和不同剂量转化生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)行成软骨细胞诱导。3周后行阿利新蓝及甲苯胺蓝染色蛋白多糖,免疫荧光检测II型胶原,阿利新蓝比色法检测葡萄糖氨基聚糖。结果:体外培养条件下MSCs生长旺盛。在TGF-β1作用下MSCs向软骨骨细胞分化,TGF-β110μg/L组软骨细胞标志物表达最强。结论:MSCs有旺盛的增殖能力。MSCs在一定诱导条件下可以向软骨细胞分化,转化生长因子β1(TGF-β1)是诱导MSCs向软骨分化的关键性因素,10μg/L是其最佳诱导剂量。     

水凝胶材料复合物修复软骨缺损的组织学评鉴

目的探讨水凝胶材料复合物对兔膝关节软骨全层缺损的修复。方法35只（70个关节）青紫蓝兔随机分为4组,实验组A组（n=20）：纤维蛋白凝胶＋骨髓间充质干细胞＋转化生民因子-β1;对照组B组（n=20）：纤维蛋白凝胶＋骨髓间充质干细胞;对照组CgH（n=20）：纤维蛋白凝胶＋转化生长因子-β1;空白对照组D组（n=10）：单纯钻孔。自大转子处抽取骨髓,密度梯度离心法分离间充质干细胞并行体外培养扩增,依分组将复合物分别填充到软骨缺损处,12周后取标本,进行大体及HE染色组织学观察,行甲苯胺蓝染色,Ⅱ型胶原免疫组化染色鉴定修复组织的性质,并行改良Pineda法半定量评分后统计学处理。结果12周后见：实验组缺损由类透明软骨或透明软骨修复,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,甲苯胺蓝异染性明显,修复面较平整光滑;而对照组则以纤维软骨及纤维组织修复,Ⅱ型胶原免疫组化染色阴性。改良Pineda法半定量组织学评分实验组总分平均为6．50,较对照组差异有显著性（P〈0．05）。结论水凝胶材料复合物移植到兔关节软骨缺损处,能够生成透明软骨而修复软骨缺损。     

人脐带问充质干细胞在胶原支架材料体外复合培养的生物学特性研究

目的：观察体外人脐带间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）黏附胶原蛋白支架条件下的干细胞免疫表型及成骨特性的变化,为复合载体移植提供实验依据。方法：将人脐带间充质干细胞静态接种于胶原蛋白支架上,经体外培养两周后,检测细胞在胶原蛋白材料中的干细胞CD44、CD105、HLA-DR、Ⅰ型胶原表达,观察细胞特性变化。结果：细胞在支架上有较好的粘附,CD 44、CD105、Ⅰ型胶原表达阳性,HLA-DR表达阴性。结论：混合培养中人脐带MSCs不仅与胶原蛋白有较好的组织相容性,且细胞在支架上培养仍保持了其干细胞的特点,Ⅰ型胶原表达阳性,提示具有潜在的成骨能力,为人脐带间充质干细胞组织工程体外预制提供实验基础。 更多还原     

负载转化生长因子β3微球的壳聚糖三维支架的制备

目的 探讨制备负载转化生长因子β3微球的壳聚糖三维支架的可行性.方法 利用冻干法制备壳聚糖三维支架,扫描电镜观察并测定其水结合率及孔隙率.利用乳化交联法制备负载转化生长因子β3的壳聚糖微球,检测负载微球的体外缓释情况及吸水膨胀率.制作负载转化生长因子β3微球的壳聚糖三维支架,扫描电镜观察支架形态特征.结果 壳聚糖三维支架孔隙较为一致,孔隙直径(180.4±35.3)μm,孔隙率(83.2±0.6)％,与水的结合能力为(123±5)％.电镜观察微球表面光滑,分散性好,粒径(28.5 ±5.1)μm.对壳聚糖微球体外缓慢释放TGF-β3连续监测7d,总释放率为(46.2±0.3)％.负载TGF1-β3微球的壳聚糖三维支架观察见微球在支架中分布均匀.结论 负载TGF-β3微球的壳聚糖三维支架的制备技术成熟,理化性质稳定,微球缓释TGF-β3效果理想,可作为理想的组织工程材料.     

骨髓间充质干细胞构建组织工程半月板软骨种子细胞

目的使用特定细胞因子刺激诱导分离扩增后的兔骨髓间充质干细胞（Mesenchynml stem cells,MSCs）,在体外试验中使其分化为软骨细胞,为后续构建工程化半月板研究提供种子细胞,探讨兔MSCs重建半月板组织的可行性和有效性。方法用碱性成纤维细胞生长因子（Basic fibroblast growth factor,bFGF）和转化生长因子β1（Transforming growth factor-βl,TGF-β1）协同刺激已分离并经体外传代培养扩增的兔MSCs,通过倒置细胞显微镜观察及免疫组化检测,证明其已经向软骨细胞系分化。结果用bFGF和TGF-β1协同刺激已分离并经体外扩增的兔MSCs后,细胞生长速度增快,免疫组织化学检测提示向软骨细胞系分化。结论兔MSCs可向软骨细胞分化;bFGF和TGF-β1能加快MSCs的体外增殖并促使其向软骨细胞系分化,可为构建工程化半月板提供理想的自体来源种子细胞。     

转化生长因子β_1基因修饰的间充质干细胞/仿生基质材料的体外复合培养

目的 探讨转化生长因子β_1(TGF-β_1)基因转染对间充质干细胞(MSCs)增殖分化的影响,评价涂覆多聚赖氨酸(PLYS)的聚DL乳酸(PDLLA) 仿生基质材料能否作为关节软骨组织工程学研究的支架材料。方法 将组织工程学与分子生物学有机结合,体外将具有多重生物学效应的TGF-β_1基因转入关节软骨组织工程首选种子细胞--间充质干细胞（MSCs）,并与表面涂覆PLYS的PDLLA可降解三维多孔基质材料体外复合培养。以单纯空载体转染MSCs为对照,通过扫描电镜等方法观察种子细胞的粘附、增殖及分化等情况。结果 基质材料孔隙率为88%,其中孔径为150～200μm的有效孔占80%。所有细胞均能很好地粘附于基质材料上,其中TGF-β_1基因修饰的MSCs增殖分化活性明显优于对照组。结论 利用分子组织工程学原理可使TGF-β_1持续高效发挥作用,使提高关节软骨缺损的修复质量和远期疗效成为可能。涂覆PLYS的PDLLA仿生基质材料不仅具有良好的生物相容性和结构相容性,而且具有更好的表面相容性和生物学活性,在一定程度上解决了细胞-基质材料之间存在的界面不相容问题,是关节软骨缺损修复的良好基质材料。     

骨髓间充质干细胞复合壳聚糖凝胶体外构建可注射组织工程软骨

目的：探讨壳聚糖/β-甘油磷酸钠凝胶用作骨髓间充质干细胞的载体体外构建可注射型组织工程软骨的有效性和可行性。方法：骨髓间充质干细胞与壳聚糖/β-甘油磷酸钠制成注射型细胞/凝胶复合物并行体外成软骨诱导培养,通过倒置显微镜、扫描电镜和组织学检查等观察细胞在凝胶内黏附、生长、增殖、向软骨细胞分化及形成软骨样组织等情况。结果：在体外成软骨培养条件下,壳聚糖凝胶支持骨髓间充质干细胞生长、增殖、向软骨细胞分化并形成软骨样组织。结论：骨髓间充质干细胞/壳聚糖/β-甘油磷酸钠凝胶复合物,有望用作可注射型组织工程软骨修复软骨缺损。     

脂质体介导胰岛素样生长因子-1基因修饰骨髓间充质干细胞成软骨分化

目的脂质体介导IGF-1目的基因转染骨髓间充质干细胞（MSCS），并研究对MSCS成软骨分化的特异性细胞外基质的影响。方法以密度梯度离心结合全骨髓培养法获得纯化骨髓间充质干细胞（MSCs），经流式细胞仪检测，细胞表面标志CD29和CD44表达阳性，但是CD14和CD45表达阴性。采用脂质体介导法将重组真核表达质粒pcDNA3．1-IGF-1转染MSCs，对转染后骨髓间充质干细胞的Ⅱ型胶原（ColⅡ）的表达行Western blot检测。结果获得纯度较高的兔骨髓间充质干细胞（MSCs）；脂质体为介导将全长兔IGF-1目的基因导入MSCs，Western blot鉴定转染成功，转染后的MSCs较未转染MSCs成软骨分化特异性细胞外基质ColⅡ、蛋白表达明显增强。结论以脂质体介导法可以将IGF-1目的基因转染骨髓间充质干细胞，转染后成软骨分化的特异性细胞外基质增多。     

透明质酸诱导骨髓间充质干细胞治疗骨性关节炎软骨分化研究进展

骨关节炎(OA)是以关节软骨变性、骨质增生为特征的退行性关节病,患病率、致残率高.目前缺乏有效的治疗措施,对患者生活质量和社会经济有很大的影响.骨髓间充质干细胞(MSCs)属于多能干细胞,易从体外提取,增殖能力强,免疫源性低,已经成为一个再生医学重要的细胞来源,特别是对于软骨修复.OA滑膜存在MSCs归巢有关黏附因子,提示MSCs在OA软骨修复中有重要作用.体外透明质酸(HA)和自体滑膜液培养诱导间充质干细胞获得了与TGF-β相似的分化软骨细胞结果,为在体试验奠定基础.亦有报道MSCs治疗OA会加重骨赘的形成.     

低频脉冲磁场对兔膝关节软骨缺损修复作用的实验研究

目的:研究低频脉冲磁场在间充质干细胞和双层PLGA支架构建复合体修复兔骨软骨缺损过程的作用。方法:用密度梯度离心法和贴壁培养法获得5月龄兔骨髓来源间充质干细胞,在体外培养并进行分化诱导后作为种子细胞复合双层PLGA构建成复合体植入兔膝股骨髁间设计骨软骨缺损模型,全过程施加低频脉冲磁场干预,于第24周取材,进行大体观察、组织学检查和病理评分。结果:诱导MSCs+支架+2.0A·m-1脉冲电磁场刺激组在术后又继续进行脉冲电磁场照射后,兔膝关节骨软骨创伤修复明显加快,统计学分析各组单项评价指标得分差异有显著性(P<0．05),与自体骨软骨移植组相当。结论:在适当低频脉冲磁场作用下,诱导MSCs+双层PLGA支架能较好地修复兔膝关节骨软骨创伤。     

壳聚糖制作组织工程软骨支架的研究

目的:探讨在动物体内,利用新型生物材料壳聚糖制作软骨组织的可行性。方法:在体外,将培养的兔关节软骨细胞,种植于多聚赖氨酸包埋的壳聚糖支架上。体外培养4周,对组织工程软骨进行标本观察,HE染色,检测软骨内DNA含量。结果:制备的复合支架成形良好,交联后的机械强度明显提高。结论:壳聚糖适合细胞的贴附生长,可作为间充质干细胞的载体。     

壳聚糖制作组织工程软骨支架的研究

目的：探讨在动物体内,利用新型生物材料壳聚糖制作软骨组织的可行性。方法：在体外,将培养的兔关节软骨细胞,种植于多聚赖氨酸包埋的壳聚糖支架上。体外培养4周,对组织工程软骨进行标本观察,HE染色,检测软骨内DNA含量。结果：制备的复合支架成形良好,交联后的机械强度明显提高。结论：壳聚糖适合细胞的贴附生长,可作为间充质干细胞的载体。     

TGF-β1壳聚糖缓释微球的制备和体外检测

[目的]通过制备新型的转化生长因子-β1(TGF-β1)缓释系统,并对其载药、体外释药及降解特性进行检测,评估应用生物可降解壳聚糖微球作为TGF-β1控制释放载体的可行性.[方法]应用三聚磷酸钠(TPP)作为交联剂,以乳化交联法制备具有控制释放功能的负载TGF-β1的壳聚糖微球;以牛血清白蛋白(BSA)作为模板蛋白,应用相同的方法制备负载BSA的微球.应用扫描电镜、微镜粒度分、药物包封率测定、体外药物释放动力学检测等方法分析微球的特性.[结果]制备的微球球形良好,球体表面光滑,具有较高的TGF-β1包封效率90.1%).持续7 d的药物释放试验表明,BSA与TGF-β1两种蛋白均可以从微球中缓慢释放,其中TGF-β1的释放率低于BSA的释放率.溶菌酶溶液降解作用下,4周的体外降解过程中,可见微球质量持续下降并伴有明显的微球形貌改变.[结论]应用乳化交联法可制备负载TGF-β1的壳聚糖缓释微球.这种新型药物控制释放系统在细胞因子的控制释放及软骨组织工程中有潜在的应用价值.