创伤性脑组织匀浆对大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的影响

目的：骨髓间充质干细胞在脑组织匀浆诱导环境下可以转化为神经元样细胞，损伤脑组织匀浆的骨髓间充质干细胞培养液中，不仅有脑组织中提取的生长因子，而且有骨髓间充质干细胞分泌的多种生长因子，共同刺激骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化。实验观察了创伤后24 h和正常脑组织匀浆诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的差别。 方法：实验于2007-03/08在河北医科大学解剖教研室细胞培养中心完成。①实验材料：体质量100~150 g的健康SD大鼠由河北医科大学实验动物中心提供，4~6周龄,清洁级。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：取1只 SD大鼠，麻醉后分离股骨和胫骨，用培养基冲洗骨髓腔，离心弃上清液，加入含体积分数为0.10胎牛血清的L-DMEM培养基重悬，接种于培养瓶培养并传代，于倒置显微镜下观察细胞形态。采用Gruncr改良法制作中度脑损伤大鼠模型，取伤后 24 h和正常大鼠脑组织匀浆，对体外培养的第3代骨髓间充质干细胞进行诱导。③实验评估：在倒置显微镜下观察细胞形态学变化，并应用免疫细胞化学技术检测细胞内神经元特异性烯醇化酶的表达，比较创伤后和正常脑组织匀浆两组诱导率差别。 结果：骨髓间充质干细胞经创伤性脑组织匀浆培养基诱导24 h后，细胞的胞体变大，36 h后部分细胞分化，回缩成圆形或梭形，48 h后部分细胞可见两个或多个突起伸出，类似神经元。免疫细胞化学技术检测显示，创伤性脑组织匀浆培养基诱导组神经元特异性烯醇化酶阳性表达为（54.28±6.03）%，正常脑组织匀浆诱导分化率较前者低，神经元特异性烯醇化酶阳性表达为（32.76±3.25）%，细胞生长状态略差。 结论：脑组织匀浆可诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化，创伤性脑组织匀浆可明显促进其分化。     

骨髓间质干细胞治疗脑出血的研究进展

目的 骨髓间质干细胞在骨髓间质中含量丰富,具有很强的自我复制和分化能力.经过一系列提取与培养,其可通过脑室、动脉、静脉等不同途径移植于脑出血模型,从而为脑出血的治疗开辟新的路径.     

自体骨髓间充质干细胞心肌移植后的分化及存活*☆

背景：骨髓间充质干细胞移植入急性心肌梗死组织后是否能迁移、分化及存活,目前尚不清楚。 目的：观察兔骨髓间充质干细胞移植入急性心肌梗死组织后,在体内的迁移、分化及其存活。 方法：分离培养兔骨髓间充质干细胞,体外DAPI标记细胞。结扎兔左前降支制作急性心肌梗死模型,造模成功后30只新西兰大耳兔抽签法分为骨髓间充质干细胞组和对照组,每组15只。骨髓间充质干细胞组于冠状动脉结扎后1 h在梗死周边区用微量注射器分4点注射自体骨髓间充质干细胞。对照组于相同部位注射等量生理盐水。每点注射体积30 μL。分别于移植后10 min,3 d,4周时各组各处死5只动物。取心脏行冰冻切片,荧光显微镜观察DAPI标记骨髓间充质干细胞的分布情况;免疫荧光法检测标记细胞是否表达心肌特异性肌钙蛋白Ⅰ和α-肌动蛋白。 结果与结论：DAPI标记的骨髓间充质干细胞在兔急性心肌梗死模型心脏微环境中,蓝色细胞核分布广泛,呈椭圆形,似心肌细胞核,其排列方向与宿主心肌纤维方向一致,间接免疫荧光法检测胞浆心肌特异性蛋白肌钙蛋白Ⅰ、α-肌动蛋白均为阳性。说明缺血心肌内移植入骨髓间充质干细胞,可在局部微环境的刺激下向心肌细胞定向分化。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞的分化

背景：目前骨髓间充质干细胞已经应用于多种组织血管的修复,但涉及尿道血管组织的报道甚少。 目的：探讨体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为血管内皮细胞的可行性。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2007-07/2008-01在苏州大学附属儿童医院儿科研究所完成。 材料：清洁级4周龄SD大鼠4只,由苏州大学实验动物中心提供。作为诱导剂的血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞因子为Sigma公司产品。 方法：密度梯度离心法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,待细胞达80%~90%融合时消化传代。传至第3代,细胞按1×109 L-1密度接种,加入含血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞因子的DMEM培养基向血管内皮细胞诱导分化。 主要观察指标：MTT测定细胞生长曲线,免疫荧光法检测细胞表面CD44与Vimentin的表达,光学倒置显微镜下观察诱导后细胞形态变化,电镜观察细胞超微结构。 结果：骨髓间充质干细胞生长曲线呈倒“S”型,第3 代细胞表面CD44和Vimentin表达阳性率分别为89.3%和85.6%。向血管内皮细胞诱导1~3 d细胞呈梭形或纺锤形,7 d后变成不规则的圆形或椭圆形,胞浆淡染,胞核较大,核染色质粗,且部分细胞死亡,14 d后整瓶细胞呈漩涡状生长,21~25 d后细胞密集处呈内皮细胞特有的铺路石样排列。诱导后第21天,细胞浆内可见微管、微丝及W-P小体。 结论：血管内皮细胞生长因子与碱性成纤维细胞因子联合诱导条件下,骨髓间充质干细胞在体外可分化为血管内皮细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞分化成脂肪细胞的定向诱导**☆

背景：研究表明骨质疏松症可能是间充质干细胞分化失衡后过多地向脂肪细胞分化所致。因此,探讨骨髓间充质干细胞成脂分化的影响因素对骨质疏松症防治具有重要意义。 目的:分析骨髓间充质干细胞在体外定向分化为脂肪细胞的适宜诱导条件。 设计、时间及地点：以细胞为对象,重复观察测量实验,于2007-10/2008-07在广东医学院药理教研室完成。 材料：1月龄SD雄性大鼠由广东医学院实验动物中心提供。 方法:无菌条件下分离大鼠股骨,密度梯度离心法与贴壁培养法相结合分离、纯化骨髓间充质干细胞并在体外进行培养。第3代骨髓间充质干细胞完全汇合后,利用内含0.1 mmoL/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、0.1 mmoL/L吲哚美辛、1 μmoL/L地塞米松、不同浓度胰岛素及胎牛血清的DMEM定向诱导骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞。 主要观察指标：①倒置显微镜下观察骨髓间充质干细胞形态特征。②油红O染色检测骨髓间充质干细胞成脂肪分化情况。 结果: ①倒置显微镜下观察,传3代后可获得均一性较高的骨髓间充质干细胞。②体积分数为0.05和0.1胎牛血清均能获得较好的成脂分化效果,胎牛血清体积分数增至0.2反而抑制骨髓间充质干细胞成脂分化（P < 0.01）。③10 mg/L胰岛素可获得较好的成脂分化效果,胰岛素质量浓度提高到20,40 mg/L并不能增加骨髓间充质干细胞的成脂分化效果（P > 0.05）。④低糖（含葡萄糖1 g/L）和高糖（含葡萄糖4.5 g/L）DMEM对骨髓间充质干细胞的成脂分化无影响（P > 0.05）。 结论：骨髓间充质干细胞经内含0.1 mmoL/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、10 mg/L胰岛素、0.1 mmoL/L吲哚美辛、1 μmoL/L地塞米松、体积分数为0.1胎牛血清的DMEM分化诱导液定向诱导可获得较好的成脂分化效果。     

Radionuclide imaging of mesenchymal stem cells transplanted into spinal cord

In vivo tracking of stem cells implanted to spinal cord by radionuclide imaging was investigated. The high expression of transferrin receptor on human mesenchymal stem cells (hMSCs) was verified by flow cytometry, radioligand binding and immunofluorescence. Radiolabelled transferrin was chosen as a tracer for scintigraphic imaging of the hMSCs transplanted into spinal cord of rabbits. Comparative experiments with radiolabelled human serum albumin as tracer and PBS as graft as well as ex vivo autoradiography demonstrated the specific uptake of radiolabelled transferrin of hMSCs. hMSCs could be detected in vivo with radiolabelled transferrin targeting at cellular transferrin receptors at an early stage after transplantation into spinal cord.     

骨髓间充质干细胞向甲状腺细胞的分化☆

背景：特定环境下体外可定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞向甲状腺细胞分化。 目的：建立大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导为甲状腺细胞的实验方法。 方法：采用密度梯度法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,应用促甲状腺素和胰岛素诱导,以未诱导组为平行对照。利用倒置光学显微镜、透射电镜观察细胞分化过程的形态学变化,免疫荧光等检测方法研究成人骨髓间充质干细胞的分化情况。 结果与结论：诱导培养第7天可见分化细胞中有甲状腺细胞的特有基因如TSHr的表达,第9天检测到分化细胞中甲状腺细胞标记物TTF-1的表达;对照组未见变化。形态学与生物学证实了骨髓间充质干细胞可诱导培养为甲状腺细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞诱导分化及神经蛋白的动态表达

背景：现阶段骨髓间充质干细胞定向诱导分化为神经元样细胞的方法并不统一。 目的：探讨大鼠骨髓间充质干细胞体外向神经样细胞诱导分化的条件，及其定向分化过程中神经蛋白的动态表达。 设计、时间及地点：细胞形态学观察及蛋白分子水平检测，于2006-09/2007-01在苏州大学生命科学学院完成。 材料：清洁级SD大鼠2只。胎牛血清为杭州四季青产品，成纤维生长因子、丁羟基茴香醚为Sigma公司产品，二甲基亚砜为Amresco产品。 方法：Percoll法体外分离培养、扩增纯化大鼠骨髓间充质干细胞，调整细胞密度为5×107 L-1。设立2组，诱导组用含10%胎牛血清和10 μg/L成纤维生长因子的L-DMEM培养基预诱导24 h后，再以含2%二甲基亚砜和200 μmol/L丁羟基茴香醚的L-DMEM无血清培养基诱导1，3，5 h。对照组始终用含10%胎牛血清的L-DMEM进行培养。 主要观察指标：细胞形态学变化，免疫荧光染色鉴定神经细胞表型。 结果：预诱导24 h，胞体由原来的长梭形变成多角形或不规则形，伸出多个短棒状突起，可见2~3个核仁，细胞间漩涡状生长趋势消失，排列无规律；诱导1~3 h，细胞逐渐变圆，胞质收缩明显，折光性增强，双级或多极的突起互相连接呈网状；诱导5 h，突起出现一、二级分支。诱导1 h后部分细胞表达神经前体细胞表面抗原巢蛋白；3 h后巢蛋白达高峰，同时表达成熟神经元标志物神经元特异性烯醇化酶和微管蛋白；5 h后巢蛋白表达下降，神经元特异性烯醇化酶和微管蛋白达高峰。对照组细胞形态无明显变化，巢蛋白表达为阴性。 结论：在添加化学诱导剂之前先使用成纤维生长因子进行预诱导，能促进骨髓间充质干细胞向神经前体细胞和神经元转化，且在诱导分化过程中神经蛋白分子的表达顺序与神经细胞发育过程一致。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外培养及分化为神经干细胞的实验研究

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stemcells,MSCs)体外分化为神经干细胞(neural stemcells,NSCs)的可能性。方法取4～6周SD大鼠双侧股骨和胫骨骨髓细胞进行体外培养,通过传代得到纯化的MSCs后换用分化液诱导,通过形态学观察诱导后细胞形态变化,并用免疫荧光检测不同天数细胞nestin的表达率;NSCs分化实验对所诱导的NSC的分化潜能进行检测。结果MSCs诱导后的细胞nestin表达率随天数增加逐渐升高,1周后形成高表达nestin的神经干细胞球形细胞团;在含血清培养基中可自然分化为神经元和神经胶质样细胞。结论MSCs能于体外分化出神经干细胞,且具有进一步的分化能力,骨髓来源的神经干细胞将可能作为种子细胞用于神经系统疾病的治疗。     

大鼠脑出血后神经行为学和脑组织病理学改变的特点

目的观察大鼠脑尾壳核出血后不同时间点神经行为学和脑组织病理学的特点,为利用该模型研究脑出血的治疗措施提供参考依据。方法将成年SD大鼠随机分为正常组、假手术组和脑出血组;脑出血组大鼠通过立体定向术向脑内注入自体动脉血制成脑尾壳核出血模型,并按不同的再喂养时间(1d、3d、7d、14d、30d)分为5个亚组。采用神经功能评分和HE染色分别观察脑出血大鼠神经行为学和脑组织形态学的改变。结果与正常组和假手术组相比,脑出血组大鼠的神经行为学评分上升(1d和3d时P<0.05,7d、14d和30d时P>0.05)。脑出血后1～3d在尾壳核区域可见椭圆形或不规则血肿;7d出血灶内部分血细胞被吸收,血肿周围脑组织有胶质细胞增生;14d时出血区形成一个椭圆形或不规则囊腔;30d时病灶区仅存少量血细胞,出血周边区见胶质细胞进一步增多。结论脑出血后神经行为学的改变、血细胞的吸收及囊腔的形成与出血时间有关,此结果为选择时间窗治疗脑出血疾病提供了参考资料。     

抗坏血酸、β-甘油磷酸钠和地塞米松联合诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化*

背景：成骨细胞来源于骨髓中的间质干细胞,但骨髓间充质干细胞经过高度扩增后,细胞群会出现生长速率减慢等变化,并出现没有分裂倾向的扁平状细胞。 目的：进一步验证在一定诱导条件下,体外分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞的定向分化情况。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察,于2007-03/10在南方医科大学解剖实验室完成。 材料：4周龄SD大鼠3只,由南方医科大学实验动物中心提供。成骨诱导过程所使用的抗坏血酸、地塞米松、β-甘油磷酸钠为美国 Sigma公司产品。 方法：采用密度梯度离心+贴壁筛选法体外分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,融合后用EDTA及胰蛋白酶消化,按1∶3传代培养。取生长良好的第2代骨髓间充质干细胞,调整细胞数量为1×107 L-1,分为2组：对照组加入含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM-LG培养基,诱导组加入成骨诱导液进行培养,成骨诱导液为含50 mg/L抗坏血酸、0.1 μmmol/L地塞米松、0.5 mmol/Lβ-甘油磷酸钠、体积分数为0.1胎牛血清的DMEM-LG培养基。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞的生物学特性,成骨诱导前后细胞碱性磷酸酶活性,诱导后矿化结节的形成。 结果：刚接种的骨髓间充质干细胞呈圆形;原代培养24 h后大部分细胞贴壁生长,呈短梭形、三角形、多边形;72 h时贴壁细胞分裂增殖,逐渐呈长梭形;至第5天可见明显细胞集落形成;第9~10天细胞达80%以上融合;传代后细胞贴壁和增殖速度加快,呈有规则的方向性排列。与诱导前比较,骨髓间充质干细胞成骨诱导7 d后碱性磷酸酶活性明显提高（P < 0.05）。连续成骨诱导20 d后,诱导组可见多个散在分布的圆形不透明钙化结节,对照组未见矿化结节沉积。 结论：在抗坏血酸、β-甘油磷酸钠和地塞米松联合诱导下,大鼠骨髓间充质干细胞可定向分化为成骨细胞。     

三种因子联合诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化**

背景：间充质干细胞的生物学特性及影响分化调控因子的研究认为,体外原代培养的间充质干细胞自然分化为肝细胞的比例较低,选择一种合适的诱导剂提高其分化为肝细胞的比例尤为必要。 目的：以肝细胞生长因子、表皮生长因子及成纤维生长因子体外联合,验证其诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的可行性。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2007-08在潍坊医学院实验中心完成。 材料：Sprague-Dawley大鼠40只,由潍坊医学院实验动物中心提供。 方法：采用贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,取传至第3代细胞,设立2组：空白对照组加入含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养基;联合诱导组在此基础上,另加入10 µg/L成纤维生长因子、8 µg/L肝细胞生长因子、8 µg/L表皮生长因子。 主要观察指标：倒置显微镜观察诱导后细胞形态变化,免疫荧光染色观察甲胎蛋白及白蛋白的表达,PAS检测糖原的表达,靛青绿摄入情况,酶学检测谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶的水平。 结果：联合诱导组细胞呈多角形、卵圆形或圆形细胞的特征性改变,空白对照组骨髓间充质干细胞仍保持梭形或纺锤形。联合诱导组培养14 d可见白蛋白和甲胎蛋白免疫反应阳性细胞;诱导7 d时偶见PAS阳性细胞与靛青绿阳性细胞,随诱导时间延长,阳性细胞逐渐增多;诱导14 d时开始检测到谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶的合成,21 d达高峰,之后下降。上述各指标空白对照组细胞均呈阴性。 结论：成纤维生长因子、肝细胞生长因子与表皮生长因子体外联合应用,能够成功诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝样细胞的分化。     

成人骨髓间充质干细胞向甲状腺细胞的诱导分化

背景：促甲状腺素、胰岛素或类胰岛素生长因子等对甲状腺细胞的发育分化、特异基因的表达及功能的产生等起着重要作用,故实验模拟甲状腺的体内胚胎发生过程逐步加入以上刺激因子对骨髓间充质干细胞进一步诱导。 目的：探讨在特定环境下体外定向诱导成人骨髓间充质干细胞分化为甲状腺细胞的可行性。 方法：采用密度梯度法分离培养骨髓间充质干细胞,应用促甲状腺素、胰岛素等试剂进行诱导。利用倒置光学显微镜、透射电镜观察细胞分化过程的形态学变化,免疫荧光等检测方法研究成人骨髓间充质干细胞的分化情况。 结果与结论：诱导组培养第3天可见骨髓间充质干细胞由长梭形变为圆形、椭圆形或三角形,不规则形生长,边界欠清晰。从第8天开始可见贴壁的胚胎体逐渐呈扁平状。诱导培养第7天可见分化细胞中有甲状腺细胞的特有基因如TSHr的表达;第9天检测到分化细胞中甲状腺细胞标记物TTF-1的表达。结果初步表明骨髓间充质干细胞可以在体外诱导分化为甲状腺细胞,是研究甲状腺疾病组织工程治疗的理想种子细胞。     

骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脑内出血

目的研究自体骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对脑出血大鼠的运动功能改善效果,以及采用不同移植方法后细胞在受损脑组织中的分布规律。方法采用立体定向技术向纹状体内注射自体新鲜心室腔血液构建SD大鼠脑出血模型,30只雄性SD大鼠随机分为A组:自然恢复组(对照组);B组:尾静脉移植组;C组:立体定向移植组,于移植后7 d、14 d进行神经功能缺损评分,并在荧光显微镜下观察BMSCs存活、迁移和分布情况。结果 C组大鼠神经功能恢复优于B组,BMSCs均能够迁移分布至大鼠脑损伤区。结论 BMSCs移植对脑出血后大鼠神经功能的恢复具有明显的促进作用。立体定向移植组大鼠神经功能恢复优于尾静脉移植组。     

c/000枸杞多糖诱导大鼠MSCs分化神经元样细胞的实验研究

背景：近年研究表明，枸杞多糖具有很强的抗氧化作用，可以清除超氧阴离子（O2-•）和羟自由基（•OH），具备诱导剂的基本条件，但将其用作诱导剂的报道甚少。 目的：以枸杞多糖作为诱导剂，探讨其体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的可行性。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察，于2008-09/12在辽宁医学院解剖实验室完成。 材料：SD大鼠8只，由锦州医学院动物中心提供。枸杞多糖为宁夏杞瑞康有限公司产品。 方法：无菌条件下取出大鼠股骨，利用贴壁筛选法体外分离培养骨髓间充质干细胞。取生长状态良好的第2代细胞进行诱导实验，将1×107 L-1细胞悬液1 mL接种于预先放置盖玻片的24孔板内，每孔加入1 mL预诱导液(含枸杞多糖1 g/L、体积分数为15%胎牛血清的DMEM完全培养基)，置37 ℃、体积分数为5%的CO2孵箱内继续培养，24 h后更换诱导液(含1 g/L枸杞多糖的无血清DMEM培养基)，于上述CO2孵箱内诱导。并设立添加全反式维甲酸的阳性对照组，以及空白对照组。 主要观察指标：诱导过程中镜下动态观察细胞形态学变化。诱导第8，24 h采用免疫组织化学技术检测细胞内nestin，NF，GFAP的表达。 结果：骨髓间充质干细胞原代培养24 h大部分贴壁生长，第3天进入指数生长期，细胞增殖加速，7~9 d接近汇合。传代细胞较原代细胞生长加快，第3代细胞纯度较高且增殖活跃，传至12代细胞仍然存活。预诱导后骨髓间充质干细胞形态无明显变化，诱导4 h后细胞变凸，从胞体伸出突起；24 h后细胞突起明显，突起相互连接呈网状，表现出典型的神经细胞形态。免疫组织化学检测结果显示，诱导后细胞浆内nestin，NF均呈阳性表达，GFAP呈阴性。 结论：在体外枸杞多糖能够成功诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化神经元样细胞。     

兔骨髓间充质干细胞体外培养定向诱导分化为软骨细胞

背景：骨髓间充质干细胞具有分化为骨、软骨、肌腱、脂肪等组织的多分化潜能。 目的：体外培养兔骨髓间充质干细胞并定向诱导分化为软骨细胞,探讨体外诱导分化为软骨的方法和条件。 方法：取兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子体外培养后,取第3代细胞在培养基中添加不同质量浓度转化生长因子β1的软骨分化诱导剂,2周后倒置显微镜观察细胞形态,甲苯胺蓝染色,RT-PCR技术检测Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达。 结果与结论：可以从兔骨髓中培养出骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子能明显的促进骨髓间充质干细胞增殖。经软骨诱导分化后骨髓间充质干细胞呈软骨细胞形态,甲苯胺蓝染色阳性,Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达阳性。10 μg/L的转化生长因子β1诱导成软骨分化能力最强。     

骨髓间充质干细胞向纤维软骨细胞表型的诱导分化

背景：半月板损伤后自行修复能力有限，组织工程技术为半月板损伤后修复开辟了一条新的途径。骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能，有可能成为半月板组织工程理想的种子细胞。 目的：观察体外培养的猪骨髓间充质干细胞在诱导培养液作用下向纤维软骨细胞表型分化的可行性。 方法：采用全骨髓培养法分离培养猪骨髓间充质干细胞。取第3代的骨髓间充质干细胞，实验组以2.0×104/cm2细胞密度接种于24孔板，在含有转化生长因子β1、胰岛素样生长因子Ⅰ、地塞米松及抗坏血酸的DMEM-LG完全培养液中诱导分化，对照组以2.0×104/cm2细胞密度接种于24孔板，加入不含诱导因子的DMEM-LG完全培养液。在诱导第7，14，21天分别行甲苯胺蓝染色、免疫细胞化学染色检测其分化结果。 结果与结论：①第2代骨髓间充质干细胞的群体倍增时间最短约为2 d，第4代以后相对延长，为5~9 d。②诱导后的骨髓间充质干细胞由梭形向多角形、多边形转变。③实验组可见胞浆呈明显的紫蓝色，尤其细胞密集生长的区域蓝染较深，染色强度随诱导时间延长而增强。对照组的骨髓间充质干细胞只有核蓝染。④实验组和对照组Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色均阳性，各期染色无明显差异。对照组未见Ⅱ型胶原表达，实验组诱导14 d后可见Ⅱ型胶原能稳定的表达。提示骨髓间充质干细胞在体外诱导培养下可分泌纤维软骨细胞特征性细胞外基质，作为半月板组织工程种子细胞来源可行。     

骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞的定向分化☆

目的：神经反射通路的重建和再髓鞘化是影响脊髓损伤后恢复的一个关键性因素，而少突胶质细胞存活的多少直接影响轴突再生后髓鞘化。探讨骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞定向分化的可行性。 方法：实验于2006-09/2007-06在同济医院骨科实验室完成。①动物：2~4周龄清洁级SD大鼠5只，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法：大鼠颈脱臼法处死，无菌条件下取双侧股骨、胫骨，去除两端骨骺，暴露骨髓腔，用DMEM培养液反复冲洗，收集冲洗液，重悬细胞种植于25 cm2培养瓶中，培养体系中含DMEM、体积分数为0.1的胎牛血清、终浓度为2 mmol/L谷氨酰胺及100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素，采用贴壁法+胰蛋白酶消化法进行纯化。取培养至第4代的骨髓间充质干细胞，加入含有碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子、N2添加剂的无血清培养基进行诱导分化。③实验评估：观察诱导过程中骨髓间充质干细胞的形态学变化。半定量RT-PCR检测少突胶质细胞特异性标志物mRNA的表达。应用抗微管相关蛋白、抗神经纤维酸性蛋白、抗半乳糖脑苷脂、抗磷脂碱性蛋白抗体进行免疫细胞化学染色，检测骨髓间充质干细胞定向分化为少突胶质细胞的阳性率。 结果：①骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞诱导分化过程中的形态学变化：经诱导分化后，大部分骨髓间充质干细胞表现出少突胶质细胞的形态学特征，胞质向细胞核回缩，细胞突起向外延伸，折光性增强，随时间延长多个细胞突起相互连接形成典型的网状结构。②少突胶质细胞特异性标志物mRNA的表达：细胞诱导分化后可检测到磷脂碱性蛋白mRNA、半乳糖脑苷脂mRNA的特异性条带。③少突胶质细胞阳性率：在诱导分化条件下，半乳糖脑苷脂阳性率为65%，磷脂碱性蛋白阳性率为45%，微管相关蛋白2阳性率为10%。 结论：碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子与胰岛素样生长因子联合应用，能够有效促进骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞分化。     

体外定向诱导鹿茸间充质干细胞向软骨细胞的分化**☆

目的：间充质干细胞的诱导分化的研究多见于骨髓、脐血等组织,而在鹿茸组织中分离的间充质干细胞是否能诱导为软骨细胞目前尚不清楚。实验拟建立梅花鹿鹿茸生长中心间充质干细胞体外培养方法,观察转化生长因子β1体外诱导鹿茸间充质细胞分化为软骨细胞的可行性。 方法：实验于2006-03/2007-06在吉林大学畜牧兽医学院基础兽医研究室完成。①实验材料：4岁龄健康雄性梅花鹿由中国农科院左家特产研究所提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：于生长早期锯取梅花鹿鹿茸,在解剖显微镜下定位和切取间质层（突起部）,即为鹿茸间充质干细胞所在的组织层。Ⅰ型胶原酶消化法原代分离培养鹿茸生长中心间充质干细胞,锥虫蓝染色显示细胞活性达90%以上,将活性确定后的细胞液氮冻存。取第3代细胞,用含10%胎牛血清以及10 μg/L转化生长因子β1的条件培养基诱导培养。③实验评估：培养12 d 后于倒置显微镜下观察细胞形态,采用细胞化学及免疫细胞化学鉴定细胞。 结果：①鹿茸生长中心间充质干细胞的分离与培养：Ⅰ型胶原酶消化法培养可以获得均一的间充质干细胞,贴壁的间充质干细胞形态均匀,呈长梭形,克隆样生长,增殖迅速。②转化生长因子β1体外定向诱导鹿茸间充质细胞分化为软骨细胞：转化生长因子β1诱导分化的鹿茸间充质细胞生长迅速,诱导后细胞形态明显改变,呈典型的软骨细胞形态,甲苯胺蓝染色阳性,Ⅱ型胶原表达阳性。 结论：采用酶消化法可以从鹿茸生长中心间充质层中分离出间充质干细胞,在体外转化生长因子β1具有促进鹿茸生长中心间充质干细胞分化为软骨细胞的能力。     

羊水来源胎儿间充质干细胞向成骨细胞的诱导分化

背景：羊水细胞已广泛应用于与基因突变有关疾病的产前诊断，但目前关于羊水来源胎儿间充质干细胞的分离培养、细胞表面特征鉴定、细胞分化及其应用前景的文献并不多见。 目的：体外诱导孕中期羊水来源的胎儿间质干细胞向成骨细胞方向分化。 设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2005-08/2006-05在新华医院实验中心完成。 材料：10例羊水标本取自孕18~22周行产前诊断或流产的孕妇，取前均征得孕妇本人同意。 方法：采用机械手段挑取孕中期羊水细胞培养体系中的胎儿间充质干细胞集落，体外培养扩增。取第3代胎儿间充质干细胞，以100 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸和50 mg/L维生素C持续诱导14 d。 主要观察指标：免疫组化染色检测碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原的表达，Western Blot蛋白印记法检测Ⅰ型胶原蛋白的表达，Von Kossa染色法检测钙结节形成能力，激光共聚焦显微镜检测细胞骨架蛋白形成。 结果：分离出的胎儿间充质干细胞为CD44和HLA-ABC阳性，CD34、CD45、HLA-DR阴性，符合间充质干细胞特点。成骨诱导14 d后，细胞碱性磷酸酶染色阳性率达91%，Ⅰ型胶原阳性率达87%；表达Ⅰ型胶原蛋白；随诱导时间的延长钙结节逐渐增多、增大；镜下可见细胞胞质中的微丝呈绿色荧光，细胞周围的微丝形成致密的周围束。 结论：羊水来源的胎儿间充质干细胞可以分化为成骨细胞，且与典型的成骨细胞具有相似的形态学和生物学特征。