幽门螺杆菌蛋白质组双向电泳图谱的构建及其相关技术体系的建立

目的:建立针对幽门螺杆菌蛋白质组学研究的双向电泳及其相关技术体系。方法:分别采用冻融兼Urea-CHAPS-DDT-SB3-10裂解提取法和超声兼Urea-CHAPS-DDT-SB3-10裂解提取法提取Hp菌体蛋白,取100μg菌体蛋白利用固相pH梯度等电聚焦双向电泳,对硝酸银染色后获得的双向电泳图谱进行图像分析。结果:冻融兼Urea-CHAPS-DTT-SB3-10裂解液一步提取法获得573±29个蛋白斑点,超声兼Urea-CHAPS-DTT-SB3-10裂解液一步提取法获得921±23个蛋白斑点。结论:超声兼Urea-CHAPS-DDT-SB3-10菌体蛋白提取法提高了双向电泳的分辨率,进而可增强生物质谱鉴定蛋白质的准确度。     

人急性早幼粒HL60细胞双向电泳条件的优化

目的:比较不同蛋白提取方式和不同电泳条件下HI60细胞全蛋白的双向电泳结果,寻找新的针对HL60细胞省时高效的双向电泳条件.方法:分别采用标准蛋白提取,三氯乙酸/丙酮沉淀和超声破碎三种不同蛋白提取方法,在传统双向电泳和改良双向电泳条件下做对比,并做蛋白点数和凝胶重复性分析.结果:在传统等电聚焦条件下,双向电泳凝胶图谱两端均出现大量横纹和阴影,分离效果较差.采用改良双向电泳条件后,三种蛋白提取方法的蛋白分离效果均明显改善,重复性提高,并且省时、可靠.其中,标准蛋白提取优于三氯乙酸/丙酮沉淀和超声破碎两种蛋白提取方法,蛋白点数即可达到(1102±7)个,重复性为(74.8±6.4)%,基本满足后续蛋白点的筛选和比对.三氯乙酸/丙酮沉淀法可造成部分蛋白损失,仅能分离出(844±15)个蛋白点.超声破碎法虽然使得蛋白点数明显增多,但可重复性明显下降,还不足40%.结论:采用标准蛋白提取法和改良的电泳条件,可以省时、高效地分离HL60细胞全蛋白.     

大鼠皮质双向电泳样品制备方法的优化

目的 优化大鼠皮质双向电泳样品制备方法．初步建立双向电泳条件．提高电泳分辨率和重复性。方法 分别应用三氯乙酸／丙酮沉淀法、超速离心法及改良超速离心法制备电泳样品．并比较各处理方法对电泳的影响。改良超速离心法即将混合了匀浆液Ⅱ的匀浆物4C放置过夜后再进行后续处理。结果 改良超速离心法所制备的电泳样品．不仅可以减少蛋白的降解．还可以增加蛋白的溶解性．从而获得分辨率较高、重复性较好的双向电泳图谱。结论 改良超速离心法更适于制备来源于中枢神经系统双向电泳样品。     

脾肾虚型重症肌无力患者血清双向电泳图谱的建立及分析

目的:建立脾肾虚型重症肌无力患者血清蛋白质双向电泳图谱,观察脾肾虚型重症肌无力患者与正常人血清蛋白质差异表达情况。方法:采用反复冻融法抽提血清蛋白质,以优化的双向电泳技术分离血清蛋白质,建立脾肾虚型重症肌无力患者与正常人血清蛋白质双向电泳图谱,并采用二维电泳图谱专用软件对所得结果进行图谱分析。采用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法对两组间比较所得目标蛋白质点进行质谱鉴定。结果:通过双向电泳,建立血清蛋白质双向电泳图谱,选取具有明显差异的蛋白点21个进行质谱鉴定,共鉴定出8种蛋白质。结论:通过蛋白质组技术快速建立脾肾虚型重症肌无力患者血清蛋白表达图谱及质谱分析,可为进一步研究其发病机制及治疗手段提供实验基础。     

适于人表皮组织蛋白质组分析的双向电泳技术

 【目的】 建立适于人表皮组织的双向电泳技术,并应用质谱技术对人表皮组织蛋白质组进行初步分析?【方法】 利用组织匀浆法制备人表皮组织总蛋白?固相pH 梯度胶条进行双向电泳?PDQuest 7.4软件比较和分析电泳图谱,利用质谱技术鉴定部分蛋白斑点?【结果】 成功建立了适用于人表皮组织蛋白质组分析的双向电泳技术,获得和比较了人表皮组织双向电泳四种染色图谱?人表皮组织的蛋白质在pH5～8范围内分布均匀,分子量集中在15～100 ku之间?银染图谱获得的蛋白斑点数为586±14;对质谱兼容的几种染色方法进行比较分析,结果表明Neuhoff 胶体考染更适合于人表皮组织蛋白质的双向电泳分析,其在上样量为350 μg时蛋白斑点数达394±9,匹配率为85.53%?利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术成功获得了Neuhoff 胶体考染的两个蛋白斑点的肽质量指纹图谱,并鉴定为Caspase 14 前体和27 ku热激蛋白1?【结论】建立的表皮组织双向电泳技术及其图谱可为皮肤蛋白质组学研究提供参考,为人皮肤蛋白质组学平台的构建奠定良好基础?     

膜蛋白双向电泳技术在软骨细胞相关研究中的应用

目的 探索应用双向电泳技术研究人类关节软骨细胞膜蛋白蛋白组学的可行性及膜蛋白双向电泳与总蛋白电泳技术的互补性.方法 取材膝关节软骨组织,应用Ⅱ型胶原酶/透明质酸酶DMEM溶液消化法分离软骨细胞,分别提取总蛋白和膜蛋白,进行双向电泳研究,观察膜蛋白所生成2-DE电泳凝胶的图像质量,并对比膜蛋白与总蛋白双向电泳凝胶图像之间蛋白点分布的差异和互补性.结果 膜蛋白双向电泳可获得较高质量的电泳图像,每张胶图可识别412.3±13.5个蛋白点,蛋白点主要分布在等电点PH5.0-9.0的偏碱性区域.总蛋白双向电泳凝胶可识别564.31±5.9个蛋白点,蛋白点主要分布在等电点PH3.0-7.0的偏酸性区域.结论 软骨细胞膜蛋白双向电泳可产生高质量的凝胶图像,其分离蛋白质的等电点分布区域与总蛋白双向电泳技术形成互补,可为软骨细胞为样本的相关疾病病因学研究提供更多的信息.     

TCA/丙酮沉淀对脑脊液标本中蛋白质双向电泳的影响分析

目的探讨三氯乙酸（TCA）/丙酮沉淀对脑脊液标本中蛋白质双向电泳结果的影响,为脑脊液标本中蛋白检测提供参考。方法采用丙酮沉淀法及TCA/丙酮沉淀法沉淀脑脊液标本中蛋白质,并进行双向电泳实验,观察两种沉淀方法蛋白双向电泳蛋白点数目及形态。结果TCA/丙酮沉淀标本后双线电泳图谱蛋白点342个,蛋白点形态呈点状、边缘清晰,丙酮沉淀标本双向电泳图谱蛋白位点276个,多呈条带状,边缘不清晰,TCA/丙酮沉淀法双向电泳图谱蛋白点数及清晰度高于丙酮沉淀法。结论TCA/丙酮沉淀法能够增加脑脊液标本蛋白沉淀效果,提高脑脊液标本中蛋白双向电泳的灵敏度。     

双向电泳两种凝胶染色方法的比较

目的比较肾脏蛋白质双向电泳凝胶银染色法与考马斯亮蓝G-250染色方法的染色效果。方法利用蛋白质固相pH梯度双向电泳技术分离SD大鼠肾脏组织蛋白,应用银染色和考马斯亮蓝G-250染色两种染色方法,及ImageMaster 2D5．0凝胶分析软件对凝胶进行染色分析。结果银染后的可见蛋白点比考马斯亮蓝染色法多,银染色法与考马斯亮蓝染色法平均匹配率为49．42％。结论银染法比考马斯亮蓝染色法的灵敏度高。     

志贺菌全菌蛋白质双向电泳技术的建立

目的:建立针对志贺菌全菌蛋白质组学研究的双向电泳及其相关技术体系.方法:采用超声兼尿素-3-[(3-胆酰胺丙基)-乙二胺]-1-丙磺酸(CHAPS)-二硫苏糖醇(DTT)裂解法提取临床分离志贺菌全菌蛋白,利用固相pH梯度等电聚焦对全菌蛋白进行双向电泳,银染后获得的双向电泳图谱进行Image Master 2D Platinum软件分析,并对实验条件进行调整优化. 结果:成功构建了高重复性的志贺菌全菌蛋白质双向电泳图谱,共获得946±37个蛋白质斑点, pI值主要集中在4.94～7.23之间.结论:通过相关条件的调整优化提高了双向电泳的分辨率,为后续志贺菌蛋白质组学研究奠定了基础.     

温莪术蛋白双向电泳技术的建立

目的：建立温莪术的双向电泳技术（2-DE）体系。方法：采用TCA／丙酮沉降法提取蛋白,并用超迷离心去除杂质。采用固相pH胶条在IPGphor TM Ⅲ等电聚焦系统上进行等电聚焦,采用Bio-Rad电泳仪进行SDS-PAGE电泳,以银染法染色。结果：得到了上百个点的双向电泳图谱。结论：本研究成功建立了温莪术蛋白双向电泳技术体系。     

2型糖尿病患者唾液双向电泳图谱的建立和分析

目的:建立2型糖尿病患者唾液蛋白质双向电泳图谱,观察2型糖尿病患者与正常人唾液蛋白质差异表达情况.方法:以优化的双向电泳技术分离唾液蛋白质,银染后用专业软件进行分析,建立2型糖尿病患者与正常人唾液蛋白质双向电泳图谱,并采用二维电泳图谱专用软件对所得结果进行图谱分析.采用基质辅助激光解吸电离一飞行时间质谱法对两组间比较所得目标蛋白质点进行质谱鉴定.结果:分别建立了正常人和2型糖尿病患者唾液蛋白质双向电泳图谱.结论:对比正常人和2型糖尿病患者唾液蛋白质图谱,鉴定出7种差异蛋白,为进一步研究其发病机制及治疗手段提供实验基础.     

人支气管上皮蛋白质样品制备方法及其癌变各阶段组织2-DE图谱的建立

目的： 改良、优化支气管上皮组织的蛋白质样品制备方法,建立人支气管上皮癌变过程各阶段组织的2-DE图谱,为识别鉴定肺鳞癌癌变相关蛋白质奠定基础。方法：收集、筛选人支气管正常上皮、鳞状化生、不典型增生和上皮浸润癌组织标本。改良的脱氧胆酸-三氯醋酸(deoxycholate-trichloroaetic acid,DOC-TCA)法提纯支气管上皮总蛋白质,应用固相pH梯度双向凝胶电泳分离各阶段组织的总蛋白质,凝胶经银染显色后,用ImageMaster 2D软件分析双向电泳图谱。结果：应用改良的DOC-TCA法提纯的支气管上皮总蛋白质进行双向电泳,可获得分辨率高、重复性好的人支气管上皮组织的双向电泳图谱。正常上皮、鳞状化生、不典型增生和浸润癌4种组织凝胶的蛋白质点数依次为1 190±63,1 227±69,1 272±71,1 326±82。选取同例鳞状上皮化生组织进行3次重复性检测,3块凝胶的平均蛋白质点数为1 216 ±75 ,平均匹配点数为1 082±67,匹配率达 89.3% , 且3块胶在蛋白质点位置上有较好的重复性,不同胶间蛋白质点在IEF方向的偏差为（0.835±0.247） mm ,在SDS-PAGE方向上的偏差为（0.921±0.104） mm。结论：改良的DOC-TCA沉淀法是一种较好的支气管上皮组织蛋白质样品制备法,初步建立了分辨率较高且重复性好的人支气管上皮癌变各阶段组织的双向凝胶电泳图谱。     

鱼腥草叶片总蛋白的提取及双向电泳体系的建立

[目的]比较鱼腥草叶片蛋白质提取方法,建立适用于鱼腥草蛋白质组双向电泳分析方法.[方法]以鱼腥草叶片为材料,分别采用凯基试剂盒、三氯乙酸/丙酮沉淀法、尿素/硫脲提取法及酚法4种方法提取鱼腥草叶片总蛋白,使用Bradford 法测定蛋白质浓度,计算蛋白提取率,并对所提取的蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及双向电泳(2-DE)分析,所得2-DE凝胶图片采用PDQuest软件进行分析.[结果]4种方法的提取率分别为2.90、2.55、3.90、3.80 mg/g,分别检测到186、153、356、315个蛋白点,酚法提取蛋白质的2-DE图谱效果较好,结果的重复性较好.[结论]不同方法提取鱼腥草叶片总蛋白的2-DE结果存在差异,以酚法提取的2-DE效果较好,适用于鱼腥草叶片蛋白质组分析.     

健康人和乙肝患者血清蛋白质双向电泳图谱比较

比较健康人和乙肝患者血清中蛋白质双向电泳图谱的差异。方法通过双向电泳技术对健康人和乙肝患者血清中蛋白质进行双向电泳分离,并对这2种血清蛋白质双向电泳图谱进行对比。结果从健康人和乙肝患者血清中共得到8个显著的差异点。其中在乙肝患者血清中表达量上调有5个点,表达量下调有1个点,乙肝患者血清中新出现2个点。结论健康人和乙肝患者血清蛋白质双向电泳图谱有一定的差异,这些差异点可为进一步筛选乙肝患者血清中具有医学价值的蛋白质提供新的途径。     

CD34+造血干/祖细胞蛋白质组双向电泳图谱的建立

目的探讨骨髓(BM)和动员后外周血(MPB)CD34 细胞的蛋白质差异表达情况。方法应用免疫磁珠法分离、纯化正常人骨髓和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员后外周血单个核细胞(MNCs)中的CD34 细胞,冻融法提取CD34 细胞的全细胞蛋白质进行双向电泳,并对电泳结果进行图像分析。结果纯化后CD34 细胞的平均纯度为(92.33±2.65)%;每次纯化获得的CD34 细胞数平均为(1.12±0.42)×106个。优化的双向电泳技术获得较为理想的蛋白质组图谱,显示出不同来源的CD34 细胞存在不同的蛋白质表达。结论免疫磁珠联合双向电泳适用于造血干/祖细胞的蛋白质组研究,骨髓和动员后外周血CD34 细胞的蛋白质表达存在差异。     

大鼠肾脏组织蛋白质组双向电泳分离体系的建立

目的:建立大鼠肾脏组织蛋白质组双向电泳分离体系。方法:提取大鼠肾脏组织的样品蛋白,按标准条件对蛋白质进行双向电泳分离,并对各个关键因素进行优化。结果:最终选择的裂解液配方是1%TBP,4%CHAPS,0.2%Bio-Lyte,40mmol/LTris,8mol/L尿素,2mol/L硫脲;使用pH 4～7的IPG胶条进行被动水化上样,等电聚焦采用缓慢升压模式,电泳参数根据Bio-Rad公司的预设方案进行调整;改良硝酸银法进行蛋白质斑点染色。从而获得了满意的蛋白质组双向电泳图谱。结论:成功建立具有较高分辨率和重复性的大鼠肾脏组织蛋白质组双向电泳分离体系,为后续实验研究提供有力的技术保障。     

裸小鼠诸器官及血清蛋白的双向电泳图

用微型双向电泳技术研究裸小鼠血清以及脑、心、肝、肺、脾、肾、胃、肠和肌肉等9种器官的可溶性蛋白组成。结果表明裸小鼠9种器官水溶性蛋白的双向电泳图互不相同。比较裸鼠、人及小白鼠三者血清蛋白的双向电泳图,发现裸小鼠血清中免疫球蛋白的含量较人及小白鼠少,提示裸小鼠不仅有细胞免疫缺陷,而且体液免疫亦可能较低下。     

日本血吸虫雌雄成虫可溶性蛋白组分的双向电泳分析

目的：分析日本血吸虫雌雄成虫可溶性蛋白组分。方法：双向电泳法。结果：用双向电泳分析雌雄虫体多肽斑点分别有310个和290个，匹配的蛋白点为51个。日本血吸虫雌雄成虫可溶性蛋白中存在一些共同多肽斑点，但不同的多肽斑点较多。结论：日本血吸虫雌雄成虫可溶性蛋白组分存在较大差异，值得进一步研究。     

尖吻蝮蛇毒素组双向电泳和二维液相色谱研究

目的：初步研究尖吻蝮蛇蛇毒的蛋白质组分及其活性。方法：利用双向电泳和二维色谱（IEX＋HPLC）分析尖吻蝮蛇蛇毒蛋白质组，并制备分离样品研究蛇毒中酶和毒素活性。结果：双向电泳分离检测得到128种蛋白质，其中24种蛋白质丰度较高，73种为酸性蛋白质，加种为碱性蛋白质。二维色谱展现58种蛋白质，其中26种蛋白质丰度较高。初步活性研究表明，尖吻蝮蛇蛇毒蛋白质多数属于丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶和磷脂酶A2家族，部分蛋白质可能属于去整合素家族。结论：双向电泳和二维色谱相互结合．有效分析了尖吻蝮蛇毒的蛋白盾组成和生物活性．     

家兔急性脊髓损伤脊髓蛋白质组研究

目的:通过在Allen法基础上,采用自制击打器建立了不同程度急性脊髓损伤动物模型,并对其进行蛋白质组学研究。方法:在原有技术基础上,以IPG等电聚焦为第一向、垂直SDS PAGE为第二向,对脊髓蛋白质样品提取、等电聚焦上样量、等电聚焦电泳参数、SDS PAGE、SDS胶染色及保存进行了研究和实验条件优化,建立和优化了脊髓蛋白质组分析的双向电泳的技术。结果:本实验在国内首先成功建立了正常和损伤脊髓蛋白质组双向电泳图谱,该图谱能够从蛋白质水平上直接反映脊髓损伤所引发的脊髓蛋白质组变化的全貌。并识别和鉴定出部分差异表达的蛋白质,为阐明急性脊髓损伤后损伤和修复的机制奠立了初步基础,提供了实验依据。结论:应用改良Allen氏法成功建立了不同程度急性脊髓损伤动物模型。建立和优化了脊髓蛋白质组分析的双向电泳的技术,成功建立了分辨率高、重复性好的正常和损伤脊髓蛋白质组双向电泳图谱。