热刺激预处理对复极化诱导的小脑颗粒神经元凋亡的保护作用

【目的】热刺激预处理诱导热休克蛋白表达 ,观察它对复极化诱导的小脑颗粒神经元凋亡是否具有保护作用。【方法】热刺激处理诱导热休克蛋白产生 ,复极化诱导体外培养的小脑颗粒神经元凋亡 ,FDA荧光染色计算细胞存活率 ,相差显微镜分析细胞形态 ,Hoechst332 5 8染色分析核形态 ,琼脂糖凝胶电泳分析DNA片段 ,Westernblotting检测HSP70 表达。【结果】小脑颗粒神经元在去极化条件 (2 5mmol/LKCl)下生长良好 ,复极化 (5mmol/LKCl )后 2 0h ,相差显微镜下神经元胞体缩小 ,突起断裂。Hoechst 332 5 8染色见核固缩和凋亡小体。琼脂糖凝胶电泳出现细胞凋亡的典型生化特征—DNA梯状条带。预先对小脑颗粒神经元进行热刺激处理 (4 4℃ )不同时间 (6 0min ,90min)再复极化 ,神经元凋亡数明显减少 ,且随热处理时间延长 ,保护作用增强。Westernblotting结果 :随热刺激 (4 4℃ )处理时间延长 ,HSP70 表达量逐渐增加。【结论】热刺激预处理对复极化诱导的小脑颗粒神经元凋亡具有保护作用。这一保护作用可能涉及HSP70 。     

p38 MAPK抑制剂通过抑制JNK活性抑制培养的小脑颗粒神经元凋亡

【目的】研究特异性p38分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）抑制剂SB203580对低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡的作用。【方法】把体外培养的小脑颗粒神经元从含去极化浓度钾离子（KCl25mmol*L-1）的培养基中转移至低钾培养基（KCl5mmol*L-1）中诱导神经元凋亡。凝胶电泳分析DNA片段,SAPK/JNK分析盒测定c-JunN-末端蛋白激酶(JNK)活性。【结果】低钾诱导小脑颗粒神经元的具有典型形态学和生化特征的凋亡。特异性的p38MAPK抑制剂SB203580通过抑制细胞凋亡,促进低钾环境中培养的小脑颗粒神经元存活。这种保护作用具有浓度依赖性。培养于低钾环境中的颗粒神经元,c-Jun表达和磷酸化水平升高了,且激活了JNK活性。当小脑颗粒神经元生长在含SB20358025μmol*L-1的低钾培养基中,c-Jun表达、磷酸化水平和JNK活性都明显降低。【结论】SB203580抑制JNK活性,降低c-Jun的磷酸化而对低钾培养的小脑颗粒神经元具有保护作用。     

JNK抑制剂SP600125对低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡的保护作用

【目的】研究特异性c-Jun氨基末端激酶(JNK)抑制剂SP600125对低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡的保护作用。【方法】把体外培养的小脑颗粒神经元从含去极化浓度钾离子(KCl 25mmol／L)的培养基中转移至低钾培养基(KCl 5mmol／L)中诱导神经元凋亡。以Western blot法检测JNK和c-Jun的磷酸化水平。【结果】低钾(KCl 5mmol／L)磷酸化并激活JNK，诱导c-Jun磷酸化和小脑颗粒神经元凋亡。SP600125通过抑制c-Jun磷酸化而浓度依赖性地促进低钾环境中培养的小脑颗粒神经元的存活。其保护作用的半数有效量(ED50)为1．01μmol／L。【结论】SP600125通过特异性地抑制JNK活性而对低钾培养的小脑颗粒神经元具有保护作用；提示JNK是介导低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡的关键激酶，它可能可以作为干扰神经元凋亡的药物的作用靶点。     

LY294002对热预处理抗低钾诱导的大鼠小脑颗粒神经元凋亡的影响

【目的】观察磷酸肌醇3位羟基激酶(PI3-K)的特异性阻断剂LY294002对热预处理抗低钾诱导的大鼠小脑颗粒神经元(CGN)凋亡的影响。探讨磷酸肌醇3位羟基激酶/AKT(PI3-K/AKT)信号转导通路是否参与了热预处理的保护作用及其机制。【方法】以低钾诱导的大鼠小脑颗粒神经元凋亡为模型。用相差显微镜观察形态学,DNA琼脂糖凝胶电泳和Hoechst33258核染色分析神经元凋亡,二乙酸荧光素(FDA)染色法检测细胞的存活率。蛋白质印迹(Westernblot)法检测蛋白的表达。【结果】热预处理(44℃,1h)可以保护低钾诱导的CGN的凋亡,使神经元存活率由(33.2±4.1)%上升至(76.1±5.6)%(P <0.01),核染色出现的核固缩和凋亡小体减少,DNA凝胶电泳DNA梯状条带明显减弱。LY294002(20μmol/L)可以明显抑制热预处理的保护作用,使神经元的存活率降至(37.4±3.5)%(P<0.01),核染色出现的核固缩和凋亡小体,DNA凝胶电泳出现梯状条带。热预处理可使HSP70、磷酸化AKT增高。LY294002可以抑制磷酸化AKT(p-AKT)的增加,而对HSP70则无明显影响。【结论】在低钾诱导CGN凋亡的模型中,LY294002可以抑制热预处理的抗凋亡作用,并可抑制p鄄AKT的增加,显示PI3鄄K/AKT信号转导通路参与了热预处理的保护作用,但该抑制作用可能不是通过抑制热休克蛋白(HSP)70的表达引起。     

氨甲酰胆碱对多巴胺诱导的小脑颗粒细胞凋亡的保护机制

【目的】研究多巴胺诱导小脑颗粒神经元凋亡的分子机制,以及胆碱受体激动剂氨甲酰胆碱对多巴胺诱导凋亡的作用。【方法】在培养的小脑颗粒神经元建立多巴胺凋亡模型。用相差显微镜观察形态学,DNA凝胶电泳和Hoechst33258核染色分析神经元凋亡,细胞的存活率用二乙酸荧光素（FDA）染色法检测。采用Westernblot分析细胞外信号调控的蛋白激酶（ERK）激活情况。【结果】多巴胺可诱导小脑颗粒神经元凋亡,并可持续激活ERK,二者均可被氨甲酰胆碱和PD98059抑制。氨甲酰胆碱对神经元的保护作用及对ERK激活的抑制作用可被阿托品阻断。【结论】多巴胺在小脑颗粒神经元诱导凋亡可能是通过持续激活ERK介导的。氨甲酰胆碱通过激活M胆碱受体,继而抑制了ERK的激活,从而起到对神经元的保护作用。     

JNK抑制剂SP600125对低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡的保护作用

[目的]研究特异性c-Jun氨基末端激酶(JNK)抑制剂SP600125对低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡的保护作用。[方法]把体外培养的小脑颗粒神经元从含去极化浓度钾离子(KCl 25mmol/L)的培养基中转移至低钾培养基(KCl 5mmol/L)中诱导神经元凋亡。以Western blot法检测JNK和c-Jun的磷酸化水平。[结果]低钾(KCl 5 mmol/L)磷酸化并激活JNK,诱导c-Jun磷酸化和小脑颗粒神经元凋亡。SP600125通过抑制c-Jun磷酸化而浓度依赖性地促进低钾环境中培养的小脑颗粒神经元的存活。其保护作用的半数有效量(ED_(50))为1.01μmol/L。[结论]SP600125通过特异性地抑制JNK活性而对低钾培养的小脑颗粒神经元具有保护作用;提示JNK是介导低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡的关键激酶,它可能可以作为干扰神经元凋亡的药物的作用靶点。     

铜对低钾诱导大鼠小脑颗粒神经元凋亡的保护作用

【目的】探讨铜体外抗低钾诱导大鼠小脑颗粒神经元（CGNs）凋亡作用及其机制。【方法】体外培养乳鼠的CGNs并用去极化诱导凋亡模型；噻唑兰（MTT）法检测细胞存活率；相差显微镜及Hoechst 33258染色分别观察细胞及其核形态学变化；流式细胞仪（FCM）检测亚二倍体峰。【结果】1-40μmol／L的铜可抗低钾所致的大鼠CGNs凋亡，明显提高CGNs的存活率。铜（20μmol/L）显著减少低钾所致的大鼠CGNs胞体皱缩、细胞核固缩和亚二倍体峰等凋亡特征。铜的神经保护作用可以持续72h以上。磷脂酰肌醇3-激酶（P13-K）抑制剂LY294002可阻断铜的保护作用。【结论】一定浓度范围的铜对低钾所致的大鼠CGNs凋亡有保护作用，P13-K／Akt信号传导通路可能参与其保护作用。     

分泌型磷脂酶 A2非酶活性依赖的神经元保护作用

【目的】鉴定中华眼镜蛇(Najanajaatra)蛇毒中的神经保护因子,研究其抗神经元凋亡作用机制。【方法】连续柱层析法分离、纯化蛇毒神经保护因子。用EdmanN-末端测序法取得蛋白质一级序列,BLAST软件进行蛋白质鉴定。使用低钾诱导体外培养小脑颗粒神经元凋亡模型,研究其神经元保护作用。【结果】从中华眼镜蛇蛇毒中分离出一种,可浓度依赖性地抑制低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡。神经保护因子(Cobravenomneu-ronalprotectivefactor,CVNPF)此神经保护因子N-末端20个氨基酸序列为NLYQFKNMIQCTVPSRSWWD-,BLAST序列同源比对确定该保护因子为中华眼镜蛇分泌型磷脂酶A2(secretedphospholipaseA2,sPLA2)。进一步发现来源于蜂毒、莫桑比克眼镜蛇(Njajanajamossambica)蛇毒、西部菱斑响尾蛇(Crotalusatroxalso)蛇毒的sPLA2也对小脑颗粒神经元具有保护作用;其作用不为磷脂酶A2酶活性抑制剂7,7-Dimethyleicosadienoicacid(DEDA)和Manoalide阻断。【结论】CVNPF属于sPLA2。多种sPLA2可以抗神经元凋亡,其保护机制与磷脂酶A2的酶活性无关。     

热刺激预处理对复极化诱导的小脑颗粒神经元凋亡的保护作用

[目的]热刺激预处理诱导热休克蛋白表达，观察它对复极化诱导的小脑颗粒神经元凋亡是否具有保护作用。[方法]热刺激处理诱导休克蛋白产生，复极化诱导体外培养的小脑颗粒神经元凋亡，FDA荧光染色计算细胞存活率，相差显微镜分析细胞形态，Hoechst33258染色分析核形态，琼脂糖凝胶电泳分析DNA片段，Western blotting检测HSP70表达。[结果]小脑颗粒神经元在去极化条件(25mmol/LKCl)下生长良好，复极化（5mmol/LKCl)后20h，相差显微镜下神经元胞体缩小，突起断裂，Hoechst33258染色见核固缩和凋亡小体，琼脂糖凝胶电泳出现细胞凋亡的典型生化特征-DNA梯状条带，预先对小脑颗粒神经元进行热刺激处理（44℃）不同时间（60min,90min)再复极化，神经元凋亡数明显减少，且随热处理时间延长，保护作用增强，Western bloting结果：随热刺激（44℃）处理时间延长，HSP70表达量逐渐增加。[结论]热刺激预处理对复极化诱导的小脑颗粒神经元凋亡具有保护作用。这一保护作用可能涉及HSP70。     

铜对低钾诱导大鼠小脑颗粒神经元凋亡的保护作用

 【目的】探讨铜体外抗低钾诱导大鼠小脑颗粒神经元（CGNs）凋亡作用及其机制。【方法】体外培养乳鼠的CGNs并用去极化诱导凋亡模型；噻唑兰（MTT）法检测细胞存活率；相差显微镜及Hoechst 33258染色分别观察细胞及其核形态学变化；流式细胞仪（FCM）检测亚二倍体峰。【结果】1~40 μmol/L的铜可抗低钾所致的大鼠CGNs凋亡，明显提高CGNs的存活率。铜（20 μmol/L）显著减少低钾所致的大鼠CGNs胞体皱缩、细胞核固缩和亚二倍体峰等凋亡特征。铜的神经保护作用可以持续72 h以上。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinane，PI3-K）抑制剂LY294002可阻断铜的保护作用。【结论】首次发现，一定浓度范围的铜对低钾所致的大鼠CGNs凋亡有保护作用，PI3-K/ Akt信号传导通路可能参与其保护作用。     

茶碱对小脑颗粒神经元凋亡的保护作用及其作用机理

为探讨茶碱对神经元凋亡的影响及其作用机理,建立小脑颗粒神经元的低钾凋亡模型,用ＤＮＡ凝胶电泳、ＦＤＡ染色和放射免疫等方法,发现经不同浓度茶碱（１～２０ｍｍｏｌ／Ｌ）处理,低钾培养的小脑颗粒神经元存活率相应提高２２％～１００％,量效关系有高度显著性（Ｐ＜０．０１）,ＥＣ５０＝２．９７ｍｍｏｌ／Ｌ;经茶碱（２０ｍｍｏｌ／Ｌ）处理的细胞,其ＤＮＡ凝胶电泳带没有“梯子”状分布;与不同浓度茶碱（５～８０ｍｍｏｌ／Ｌ）在ＣＯ２培养箱孵育１５ｍｉｎ,小脑颗粒神经元内ｃＡＭＰ均升高,且是剂量依赖性的。认为茶碱对撤去极化浓度氯化钾诱发小脑颗粒神经元的凋亡有保护作用,此作用产生除与其升高小脑颗粒神经元内ｃＡＭＰ有关外,还有其它机理。     

胆红素诱导大鼠小脑颗粒神经元凋亡的研究

目的从细胞与分子水平探讨胆红素神经毒性的机制。方法采用原代培养的大鼠小脑颗粒和大脑皮质神经元,观察胆红素对其毒性的影响。并用ＤＮＡ染色及琼脂糖凝胶电泳法确定胆红素诱导神经元死亡时的形态学及生物化学改变的特征。结果胆红素在０～１７μｍｏｌ／Ｌ的浓度下,选择性地、剂量与时间依赖性地诱导小脑颗粒神经元死亡,呈现凋亡的特征为：核染色质浓缩与ＤＮＡ双链断裂成小片段;在凝胶电泳图上呈“梯形”样改变;用ＲＮＡ和蛋白质合成抑制剂预处理神经元,可阻断其死亡。说明胆红素诱导小脑神经元死亡的过程需要蛋白质的合成。而此浓度的胆红素对大脑皮质神经元的毒性明显低于小脑神经元。结论胆红素可以选择性地诱导小脑颗粒神经元凋亡。     

缺血再灌注引起神经元凋亡及褪黑素抗凋亡的机制

目的 探讨模拟缺血再灌注引起神经元凋亡的途径和褪黑素(melatonin，MT)抗凋亡的作用机制。方法 用原代培养的SD乳鼠小脑颗粒细胞建立以缺氧缺糖模拟缺血再灌注模型，并加不同浓度的MT(10^-5、10^-7、10^-9mol／L)孵育。采用荧光比色法检测其线粒体跨膜电位及细胞内的活性氧；用Western blot及ELISA分别检测线粒体和胞质中的细胞色素C；比色法检测胞质中Caspase-3的活性。结果 在模拟缺血再灌注小脑颗粒细胞模型中，细胞内的活性氧在缺氧缺糖后明显增加；线粒体跨膜电位降低并随再灌注时间延长而加重；线粒体释放入胞质的细胞色素C增加，胞质的Caspase-3活性增加；MT可显著减少活性氧和抑制线粒体释放细胞色素C，抑制线粒体跨膜电位的降低，并呈一定剂量依赖性。结论 ①缺血再灌注引起的神经元凋亡部分是通过线粒体凋亡途径；②MT可通过抗氧化作用和阻止线粒体凋亡而抑制模拟缺血再灌注诱导的小脑颗粒细胞凋亡。     

白藜芦醇诱导佐剂性关节炎大鼠滑膜细胞凋亡

目的：探讨白藜芦醇对佐剂性关节炎( AA)大鼠滑膜细胞增殖和凋亡的影响。方法0．1 ml弗氏完全佐剂注射SD大鼠左后足跖皮内复制AA模型,28 d后,采用组织块培养法分离、培养大鼠踝关节滑膜细胞, CCK-8法检测白藜芦醇对滑膜细胞增殖的影响;Hoechst 33258荧光染色、琼脂糖凝胶电泳观察滑膜细胞凋亡情况。结果 CCK-8法表明白藜芦醇可以抑制滑膜细胞增殖,并且呈剂量依赖性趋势;高浓度白藜芦醇(20、50μmol/L )能诱导滑膜细胞凋亡, Ho-echst 33258染色观察到细胞核出现凋亡小体,电泳呈现出阶梯状条带。结论白藜芦醇可能会通过抑制AA大鼠滑膜细胞的增生,促进滑膜细胞的凋亡而达到治疗类风湿性关节炎的作用。     

氯通道阻断剂对NMDA诱导培养海马神经元凋亡的保护作用

NMDA受体的激活在缺血性脑损伤神经元死亡中起重要作用。本研究利用NMDA诱导大鼠培养海马神经元凋亡．模拟建立缺血性脑损伤的细胞模型,观察了3种氯通道阻断剂对神经元凋亡的保护作用。离体培养12d的SD大鼠海马神经元．在NMDA处理前和处理后使用氯通道阻断剂,对神经元的存活率影响不同,仅NMDA处理前给药才有保护作用。SITS对NMDA诱导神经元凋亡的保护作用最强并有浓度依赖性．D1DS次之,NPPB没有明显的保护作用。结果表明．SITS和D1DS可阻断NMDA的毒性效应．作用机制可能与NMDA的效应和氯通道活动均被阻断有关。     

针对病毒性心肌炎的细胞凋亡研究

目的 探讨柯萨奇病毒致细胞死亡时是否存在凋亡，以及凋亡百分率。方法 柯萨奇病毒感染心肌细胞和HeLa细胞以后，应用TUNEL原位标记、DNALadder、Hoechst3325B染色和Annexin—V／PI染色观察细胞凋亡发生情况；并通过流式细胞仪分析细胞凋亡发生率。结果 Hoechst33258染色发现病毒感染后的细胞核出现强亮度的蓝色荧光，可观察到凋亡细胞的典型变化；Armexin—V／PI染色可见HeLa细胞膜显强绿色荧光。细胞核显强红色荧光；感染组细胞DNA出现阶梯状条带影。通过流式细胞仪检测被PI染色的细胞DNA．发现病毒感染组出现凋亡峰，凋亡率为49．5％。结论 柯萨奇病毒致病毒性心肌炎时细胞不仅存在凋亡，而且是细胞主要死亡形式。     

藁本内酯对低钾大鼠小脑颗粒神经元凋亡的保护作用

目的 探讨藁本内酯(ligustilide, LIG)对原代培养小脑颗粒神经元细胞(cerebellar granule neurons, CGN）低钾性凋亡的影响。方法 建立低钾诱导体外培养新生大鼠CGN凋亡模型,将CGN分为对照组、模型组、CGP54626+LIG组及LIG组,分别进行给药处理;采用噻唑兰 (MTT) 法检测各组细胞存活率,Western blot检测胰岛素样生长因子1（IGF-1）信号通路中主要效应分子IGF-1R、Akt、ERK1/2、CREB及caspase 3的蛋白表达水平。 结果 LIG（2.5~20 μmol/L） 可浓度依赖性抑制大鼠 CGN的低钾性凋亡、提高其存活率; 20 μmol/L LIG 可显著上调IGF-1R、Akt、ERK1/2 和CREB 的磷酸化水平,下调 cleaved-caspase 3 的表达水平;同时,LIG上述效应均可被γ-氨基丁酸代谢型受体（GABAB）的选择性拮抗剂 CGP54626 所阻断。结论 LIG 对低钾所致大鼠CGN凋亡有保护作用,其机制可能与激活GABAB受体及其下游的 IGF-1 信号通路有关。