NK4蛋白在大肠杆菌中的表达及其纯化与活性研究

目的通过构建NK4基因的重组原核表达载体,规模化制备NK4蛋白。方法将NK4基因插入载体pET-26b(+),构建重组原核表达载体pET-26b(+)-NK4,并转化E.coli Rosseta(DE3)。IPTG诱导转化菌表达NK4蛋白,然后采用Ni-NTA树脂亲和层析进行纯化。观察复性后NK4蛋白对Hela细胞的生物学性状的影响,评价制备的NK4蛋白的生物活性。结果NK4基因重组原核表达载体pET-26b(+)-NK4获成功构建。转化pET-26b(+)-NK4的E.coli Rosseta(DE3)以包涵体形式大量表达目的蛋白,占菌体总蛋白的42%。经Ni-NTA树脂亲和层析纯化后NK4蛋白纯度约为95%,并经Western blot证实。NK4蛋白行稀释复性后可抑制Hela细胞的贴壁、迁徙并促进其凋亡。结论成功构建NK4基因的重组原核表达载体pET-26b(+)-NK4,并可在E.coli Rosseta(DE3)表达。制备的NK4保留了其生物学活性。     

凝血因子ⅩⅢ A亚基mRNA大片段缺失所致遗传性凝血因子ⅩⅢ缺乏症的分子机制研究北大核心CSCD

目的 研究凝血因子ⅩⅢ（FⅩⅢ）A亚基mRNA DelCD 11-279大片段缺失引起遗传性FⅩⅢ缺乏症的分子致病机制.方法 构建正常人、先证者母亲FⅩⅢA亚基mRNA表达质粒pET-22b（＋）/FⅩⅢA和先证者FⅩⅢA亚基mRNA DelCD 11-279大片段缺失的表达质粒pET-22b（＋）/FⅩⅢA-Del,转化大肠杆菌BL21,SDS-PAGE和Western blot法检测FⅩⅢA亚基蛋白的表达,Ni-NTA树脂结合柱纯化FⅩⅢA亚基蛋白质,EZ-LinkTM5-（Biotinamido） Pentylamine掺入法检测纯化FⅩⅢA亚基蛋白质活性.结果 pET-22b（＋）/FⅩⅢA和pET-22b（＋）/FⅩⅢA-Del经酶切及PCR鉴定构建成功,转化大肠杆菌BL21,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导后获特异高效表达,SDS-PAGE显示重组蛋白质的相对分子质量分别为83 200和51 900,用Ni-NTA树脂结合柱分离得到纯化蛋白质,Western blot方法分析表明重组的蛋白质是人FⅩⅢA亚基蛋白,先证者及其母亲的纯化FⅩⅢA亚基蛋白活性分别为正常人的0、95.87％.结论 FⅩⅢA亚基mRNA DelCD 11-279大片段缺失导致编码截短的464个氨基酸的无活性FⅩⅢA亚基蛋白是先证者遗传性FⅩⅢ缺乏症的分子机制之一.     

人BIGH3基因克隆表达对兔角膜基质细胞黏附和迁移的影响

背景:BIGH3蛋白位于角膜上皮和基质层,在基质层高表达,先前研究已经发现BIGH3蛋白能促进角膜上皮创伤愈合,为此进一步探讨其对角膜基质创伤愈合的影响.目的:构建人BIGH3基因的原核表达载体,观察其对角膜细胞与细胞外基质黏附和迁移的作用.方法:PCR扩增BIGH3基因的ORF阅读框,并通过Kpn Ⅰ和Sal Ⅰ插入到原核表达载体pET32a(+)中.经PCR、酶切和序列测定方法鉴定重组质粒.将重组质粒转入BL21(DE3)表达,IPTG诱导表达人BIGH3融合蛋白,并进行SDS-PAGE电泳分析和Western blot检测分析:以Ni-NTA树脂对蛋白纯化与复性,作用于体外培养的兔角膜细胞,用MTT法分析其对细胞与细胞外基质黏附的影响,采用改良的Boyden微孔膜双槽法观察BIGH3蛋白对角膜细胞迁移的影响.结果与结论:重组质粒经PCR、酶切与DNA测序证实插入了pET32a(+)载体中.通过IPTG诱导,成功的表达融合蛋白在包涵体中,经SDS-PAGE电泳分析,出现了一条新生的蛋白条带,Western blot也证实了该蛋白具有与BIGH3抗体特异性的结合能力.MTT法和Boyden微孔膜双槽法分别证明所表达的BIGH3融合蛋白可促兔角膜细胞黏附和迁移.成功构建了人BIGH3重组融合蛋白表达质粒,纯化了该基因的原核表达产物,并通过重组融合蛋白BIGH3能促进兔角膜细胞与细胞外基质黏附及迁移,而验证了重组BIGH3蛋白的活性.     

日本血吸虫候选疫苗原肌球蛋白的表达载体构建、原核表达及免疫原性研究

目的 将日本血吸虫原肌球蛋白基因(tropomyosin)克隆到原核表达载体pET-28a(+)裁体上,在BL-21(DE3)型大肠埃希菌中表达其产物,并对其进行免疫原性分析.方法 从日本血吸虫的Expressed Sequence Tag(EST)文库中筛选出包含tropomyosin全长基因的EST,然后用高保真酶PCR扩增,构建到pET-280(+)裁体上,最终在BL-21(DE3)型大肠埃希菌中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IFTG)诱导表达.表达的his-tropomyosin融合蛋白用镍螯舍树脂蛋白纯化柱(Ni-NTA resin)亲和层析纯化,得到纯度较高的tropomyosin后,通过Western Blotting技术,用感染日本血吸虫的兔血清作为天然抗体来研究tropomyosi的免疫原性.结果 pET-28a(+)-tropomyosin重组质粒在BL-21(DE3)型大肠埃希菌中成功表达,使用SDS-PAGE分析得到实际Mr约为40 000的his-tropomyosin融合蛋白,Ni-NTA resin的纯化效果很明显,获得的相对纯的目的 蛋白经过Western BIotting方法 检潮显示:tropomyosin融合蛋白能够与感染日本血吸虫6 w的兔血清有较强的免疫反应.结论 Tropomyosin能够在BL-21(DE3)型大肠埃希菌中高效表达,且抗原免疫原性强,日本血吸虫感染的兔血清能够识别体外表达的tropomyosin,具有与天然的tropomyosin相同的免疫原性.     

Tat融合蛋白表达载体TAT-c-Myc的克隆化及蛋白表达研究

目的构建重组表达载体TAT-c-Myc,在E.coli BL21中高效表达并纯化融合蛋白。方法经PCR获得编码人c-Myc的全基因序列,含有设计的限制性酶切位点的产物连接到含有TAT转导结构的原核表达载体PET-28b-TAT-V2上,得到重组表达载体TAT-c-Myc,转化大肠杆菌,应用IPTG诱导TAT-c-Myc融合蛋白的表达。表达产物用SDS-PAGE鉴定,亲和层析柱纯化,并应用Western blot检测蛋白的特异性,融合蛋白转导人皮肤成纤维(HSF)细胞的效果应用免疫荧光检测。结果成功构建了TAT-c-Myc融合蛋白的原核表达载体,在诱导下获得了高效表达。Western blot检测提示融合蛋白有良好的特异性。免疫荧光检测提示融合蛋白具有快速转导入HSF细胞内的能力。结论为进一步的通过蛋白转导方式诱导多能干细胞提供了物质基础。     

基因重组降钙素原蛋白在大肠杆菌中的克隆表达及纯化

目的构建降钙素原（PCT）基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达,以获取高产量、低成本、高纯度的PCT蛋白。方法按人的全长PCT cDNA序列,设计引物用标准的聚合酶链反应（PCR）法全基因合成步骤合成扣除信号肽外PCT的片段,应用基因重组技术将该片段克隆到质粒pET21a（＋）中,进行限制性内切酶酶切分析和DNA测序鉴定。将重组质粒转化大肠杆菌E．coli（DH5α）,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达后,用镍-氮三乙酸（Ni-NTA）亲和层析纯化获取蛋白,用十二烷基硫酸-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹（Western blot）的方法鉴定。结果扩增出的人PCT片段于原核表达载体中克隆,经酶切和核酸测序鉴定,得到正确的重组质粒pET-PCT,并在大肠杆菌中得以表达。纯化后的蛋白经考马氏亮蓝染色呈单一条带;用抗PCT的抗体进行Western blot分析证明目的蛋白有反应性。结论本研究成功构建了表达基因重组人PCT的原核表达载体,基因重组人PCT蛋白在大肠杆菌中获得了表达和纯化,为进一步获取高纯度、高效价的单克隆抗体和开展临床检测提供了必要的条件。     

抗AEG-1单链可变区抗体的原核表达及纯化

目的构建抗星形细胞上调基因1(AEG-1)单链可变区抗体(V23)的原核表达载体,并对表达蛋白进行纯化及免疫活性检测。方法应用Primer5软件设计针对抗AEG-1单链可变区抗体基因序列的引物,构建PRsetC/V23原核表达质粒,经限制性内切酶Pst1酶切以及DNA测序鉴定正确后,将原核表达质粒导入大肠杆菌BL21中,构建含V23基因的原核表达工程茵。经IPTG诱导后,用带His标签的磁珠纯化目的蛋白,SDS-PAGE电泳检测目的蛋白含量,Western blot及ELISA检测抗AEG-1单链可变区抗体的免疫活性。结果构建的原核表达质粒PRsetC/V23经单酶切和测序分析显示,构建的V23基因与设计序列100%一致。IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳显示在31×103处出现一条明显蛋白条带,Western blot检测在80×103处出现AEG-1特异反应条带,ELISA检测显示阳性结果。结论成功构建了PRsetC/V23原核表达质粒及V23原核表达工程茵,该工程茵可表达抗AEG-1单链可变区抗体蛋白,且该蛋白具有良好的免疫活性。     

Flt3配体胞外域的原核表达纯化及对脐血CD34+细胞的扩增作用

背景:Fms 样酪氨酸激酶3配体(Flt3配体)是一种重要的生长因子,通过激活特定的酪氨酸激酶受体,调控造血细胞的生长、生存和/或分化,具有促进造血干细胞体外扩增的应用潜力.目的:构建pET32a(+)-hFLext原核表达载体,表达、纯化hFLext蛋白,观察其对脐血CD34+细胞的扩增作用.方法:克隆hFLext,构建pET32a(+)-hFLext重组表达载体.转化大肠杆菌 BL21,IPTG诱导蛋白表达,镍珠亲合层析纯化蛋白.磁珠分选脐血CD34+细胞,单独加入hFLext或联合干细胞因子、血小板生成素孵育1周,观察体外扩增作用.结果与结论:成功克隆hFLext,并构建了pET32a(+)-hFLext重组表达载体.在大肠杆菌BL21成功表达Trx-hFLext融合蛋白,经8 mol/L尿素变性包涵体蛋白,逐步透析复性,镍珠亲合层析纯化蛋白,成功获得高纯度的Trx-hFLext融合蛋白.Trx-hFLext融合蛋白不仅具有维持及轻度刺激CD34+细胞体外扩增的作用,并且与干细胞因子及血小板生成素具有协同作用,为造血干/祖细胞体外扩增研究奠定了基础.     

重组人胱抑素C在大肠杆菌中的表达及纯化

目的研究构建人胱抑素C(Cys C)的重组表达质粒及其在大肠杆菌中的表达和纯化。方法采用反转录-聚合酶链反应从人肝组织中获取Cys C cDNA,并将其插入到pET-28a(+)质粒中,重组质粒pET-28a-CysC转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)pLysS,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达可溶性CysC。重组CysC采用Ni2+-NTA系统进行层析纯化。结果核酸序列测定与预期一致,CysC表达水平达到146mg/L,约占菌体总可溶性蛋白的13.5%,表达产物用SDS-PAGE鉴定,其相对分子质量为13.3×103,经纯化后蛋白纯度达90%。结论成功构建Cys C原核表达系统和蛋白纯化,为制备抗体以及研制Cys C免疫纳米微球测定试剂奠定了基础。     

淋病奈瑟菌孔蛋白PorB的原核表达及其在疫苗血清学检测中的初步应用

目的克隆并表达淋病奈瑟菌孔蛋白Por B,以重组蛋白为抗原,间接ELISA检测免疫血清的抗体水平。方法利用PCR从淋病奈瑟菌WHO株基因组中扩增出Por B的基因,克隆入原核表达载体p ET-30a中,构建出重组表达质粒p ET30aPor B,并转化大肠杆菌BL21(DE3)中,异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。表达的蛋白进行SDS-PAGE分析,Western blot检测其反应原性。以纯化的重组蛋白r Por B作为检测抗原建立间接ELISA方法,用于检测淋病疫苗p VAX1-Por B免疫小鼠后的血清抗体水平。结果 PCR扩增得到淋病奈瑟菌孔蛋白Por B基因,表达的重组蛋白r Por B相对分子质量约40 k D,经Ni-NTA亲和层析纯化后的r Por B在SDS-PAGE中显示单一条带,Western blot证明纯化后的r Por B可与淋病奈瑟菌免疫血清特异性结合,具有良好的免疫反应性。间接ELISA结果表明,淋病疫苗p VAX1-Por B免疫小鼠血清Por B特异性抗体滴度为1∶200。结论成功构建了重组原核表达质粒p ET30a-Por B,Por B在大肠杆菌中获得表达。以纯化的r Por B为检测抗原,间接ELISA可以用于淋病疫苗免疫效果的评价。该研究为淋病奈瑟菌感染诊断、疫苗的研究奠定了基础。     

mica基因的克隆及其在原核系统中的表达

本研究构建mica基因原核表达系统并纯化MICA蛋白。利用外周血标本提取RNA,经RT-PCR获取mica基因cDNA。将mica cDNA经TOPO克隆连接构建克隆载体,然后将克隆重组载体和原核表达载体pET-28a经双酶切后进行连接构建重组表达载体,进而转染宿主菌E.coliBL21DE3进行表达。利用亲和层析的Ni-NTASpin纯化重组的MICA蛋白。结果表明:带有重组质粒pET-28a-mica的宿主菌经IPTG诱导表达后,以可溶性形式大量表达重组的MICA蛋白,经Ni-NTA Spin纯化后得到重组的MICA蛋白。结论:本研究构建了mica基因原核表达系统并纯化了MICA蛋白,为探讨MICA与移植免疫的关系奠定了基础。     

登革病毒1型E蛋白的原核细胞表达及多克隆抗体的制备

目的构建登革病毒1型（DENV-1）E蛋白的原核细胞表达载体并进行原核细胞表达,并制备其多克隆抗体。方法利用聚合酶链反应（PCR）扩增DENV-1E蛋白序列,经酶切后将其插入原核细胞表达载体pET-32a（＋）,构建重组质粒pET-32-D1-E。重组质粒转化E.Coli Rosetta（DE3）感受态细胞,目的蛋白经异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,纯化后采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）初步分析蛋白表达情况,并用纯化后的表达蛋白免疫家兔,制备该蛋白的多克隆抗血清,用间接酶联免疫吸附测定（ELISA）检测抗体的效价,Western blot检测抗体的特异性。结果成功构建了pET-32-D1-E原核细胞表达重组质粒,DENV-1E蛋白获得高效表达;纯化后的重组蛋白免疫家兔获得的特异性抗血清效价为1∶25 600,Western blot证实其特异性良好。结论成功构建了DENV-1E蛋白的原核细胞表达载体,并制备了可用于DENV快速检测的高效多克隆抗体。     

去乙酰化酶SIRT5的原核表达及多克隆抗体的制备

目的克隆小鼠的Sirt5基因,及制备SIRT5多克隆抗体。方法提取小鼠肝细胞总RNA进行RT-PCR,PCR法扩增Sirt5基因,将此基因克隆至pET-28a载体,转化E.coli BL21（DE3）,经异丙-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达后,利用Ni 2＋-NTA亲和层析柱纯化;纯化的目的蛋白免疫Bal/c小鼠后,收获血清并鉴定。结果成功构建了Sirt5原核表达载体,并能在宿主菌E.coli BL21（DE3）中高效表达;利用纯化的蛋白制备了理想的多克隆抗体。结论利用分子克隆技术,获得了高纯度的SIRT5蛋白并制备了多克隆抗体,为进一步研究奠定了基础。     

梅毒螺旋体硫氧还原蛋白TP0100的原核表达和鉴定

目的构建梅毒硫氧还原蛋白TP0100基因的原核表达载体,在大肠埃希菌中表达重组蛋白,并评价其在梅毒血清学诊断中的价值。方法构建pET-28b-TP0100重组表达质粒,转化大肠埃希菌BL21（DE3）后诱导表达。经镍柱纯化,重组蛋白通过质谱和Western blot进行鉴定。以重组蛋白为抗原建立酶联免疫吸附试验（ELISA）间接法,并检测临床收集的梅毒血清。结果成功构建表达载体pET-28b-TP0100,测序结果表明质粒中的插入序列与GenBank中TP0100的基因序列相同。重组蛋白表达约占菌体总蛋白的40%,相对分子质量约为23×103。质谱和Western blot分别证实重组蛋白的酶解片段来自于TP0100蛋白,重组蛋白能与梅毒TPPA阳性血清发生特异性反应。ELISA检测20份梅毒螺旋体明胶凝集试验（TPPA）阳性血清和20份TPPA阴性血清,与TPPA方法的符合率分别为95%（19/20）和100%（20/20）。结论重组硫氧还原蛋白TP0100能够与梅毒患者阳性血清发生特异性反应,是一个潜在的梅毒血清学诊断抗原。     

霍乱弧菌甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因mtlD的克隆表达

目的克隆表达霍乱弧菌甘露醇特异性磷酸烯醇式丙酮酸依赖的磷酸转移酶系统操纵子中的甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因mtlD。方法以测序株N16961染色体为模板,聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增mtlD基因,扩增产物经NdeⅠ和XhoⅠ酶切后克隆入表达载体pET-30a。0.1 mmol/L IPTG诱导表达,超声裂解上清经Ni柱亲和层析纯化,比色法测定酶活性。结果 mtlD基因成功克隆入表达载体pET-30a,在宿主菌BL21中诱导表达,利用Ni亲和层析柱获得较高纯度的羧基端带His标签的MtlD蛋白,并具有酶活性。结论表达纯化了有活性的霍乱弧菌甘露醇-1-磷酸脱氢酶,为进一步的功能研究打下了基础。     

HBoV VP1-U蛋白抗原的表达纯化

目的人博卡病毒（HBoV）是近几年发现的一种导致人支气管炎的病原体,本研究旨在表达纯化其VP1衣壳蛋白独有区（VP1-U）抗原,为免疫学诊断治疗奠定基础。方法优化HBoV VP1-U DNA密码子,以适应大肠杆菌原核表达密码子亲嗜性。将密码子优化改造的DNA序列克隆到pET30a（＋）原核表达载体,C末端融合表达组氨酸亲和纯化标签。LB培养基增菌,IPTG诱导表达。采用自行设计的纯化缓冲液体系,镍株亲和纯化,超滤浓缩。结果VP1-U蛋白表达效率约为50%,纯化活性蛋白浓度为3.3mg/ml。结论经过密码子优化,合理设计工艺流程,原核表达系统可以高效表达纯化VP1-U活性蛋白抗原。     

人精子特异性乳酸脱氢酶在大肠杆菌中的表达及其初步应用

目的 构建人精子特异性乳酸脱氢酶(hLDH-CA)的原核表达载体,在大肠杆菌中进行表达,将重组hLDH-CA应用于抗精子抗体(ASA)的检测.方法 以人睾丸TripIEx cDNA文库为模板,PCR扩增hLDH-CA编码序列.PCR产物经Hind Ⅲ-Xho I酶切后,克隆至表达载体pET-28a(+)中,在E.coli BL21(DE3)中诱导His-Tag融合的重组蛋白表达.用免疫印迹、酶活性测定等方法鉴定表达产物.以纯化的重组hLDH-CA为基质,建立检测ASA的ELISA方法.结果 构建了hLDH-C4原核表达载体pET-28a(+).hLDHC.在IPTG的诱导下,重组菌可高效表达相对分子质量35 000的产物,与预期大小相符.免疫印迹显示,重组蛋白可被抗His-Tag单克隆抗体和兔抗人LDH-C4抗体识别.重组菌在IPTG诱导后,其裂菌液的乳酸脱氢酶活性是诱导前的11.2倍.用基于hLDH-C4抗原的间接ELISA法,在一组不育症患者中检测血清抗hLDH-CA抗体,阳性率达30.51%.结论 成功地克隆了hLDH-C4编码序列,并在E.coli BL21(DE3)中获得高效的表达,重组hLDH-C4在ASA检测中得到初步应用.     

MgPa重组蛋白在生殖支原体血清学诊断中的应用

[目的]表达、纯化生殖支原体 （Mycoplasma genitalium,Mg） 黏附蛋白（MgPa）优势表位基因（MgPa＇,1075-1364aa）,探讨MgPa＇重组蛋白在Mg血清学诊断中的应用.[方法]IPTG诱导表达重组质粒pET-30a（＋）/MgPa＇,SDS-PAGE和免疫印迹鉴定表达结果;Ni-NTA亲和层析法纯化重组蛋白,间接酶联免疫吸附试验（Enzyme link immunosorbent assay,ELISA）检测人血清中特异性IgG抗体.[结果]SDS-PAGE检测诱导产物显示有一分子量约为37 000的特异蛋白带,免疫印迹检测其只与Mg抗血清发生特异反应;在311例有临床症状性传播疾病（STD）患者中用PCR法筛查出Mg阳性42例,阳性率13.5%（42/311）.重组蛋白用作ELISA包被抗原检测Mg阴阳性血清,重组蛋白能和Mg感染者阳性血清特异性结合,重组蛋白有良好的免疫反应性.[结论]表达的MgPa＇重组蛋白具有较好的免疫反应活性,可望用于生殖支原体的血清学诊断.