骨髓基质细胞分泌物促进PC12细胞的分化和存活

目的体外检测骨髓基质细胞分泌物对PC12细胞的活性作用，并探讨其产生的可能机制。方法收集培养至第4代第7天的SD大鼠MSCs培养上清，按不同的体积百分比浓度加入到PC12细胞培养体系中，在倒置相差显微镜下观察1d和4d的细胞形态学改变；用丙二酸钠对PC12细胞造成氧化应激损伤，同时加入不同体积百分比浓度的MSCs培养上清，采用MTT法测定24h后的细胞活性。结果有突细胞／总细胞数、最长突起长度随培养时间及MSC培养上清体积百分比的增加而增加：PC12细胞氧化损伤后．加入一定浓度MSC培养上清组的PC12细胞活性较未加入组增高，差异有显著性。结论MSCs能够合成和分泌具有神经营养活性的物质，该物质能诱导PC12细胞分化并减轻氧化应激对PC12细胞的损伤。     

齐拉西酮对PC12细胞的保护作用

目的探讨齐拉西酮对神经生长因子(nerve growth factor,NGF)诱导的PC12细胞活性的影响及其可能的机制。方法以NGF诱导后的PC12细胞作为细胞模型,分为不同剂量齐拉西酮组(5μM、10μM、20μM、50μM)和对照组(含5%胎牛血清的DMEM培养基)分别培养24h。采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测PC12细胞活性,免疫细胞化学观察细胞形态学改变以及蛋白质印迹法(Western blotting)检测磷酸化细胞外信号调节激酶(phosphorylated extracellular single-regulated kinase,pERK)1/2的表达水平。结果仅20μM、10μM齐拉西酮组的PC12细胞活性分别与对照组的差异有统计学意义(P0.05);免疫细胞化学观察同样显示,仅10μM、20μM齐拉西酮组的pERK1/2的表达水平分别与对照组的差异有统计学意义(P0.05),20μM齐拉西酮组与其它齐拉西酮组的差异也均有统计学意义(P0.01)。Western blotting进一步证实了该结果。结论齐拉西酮能提高PC12细胞的活性,并上调pERK1/2的表达。提示齐拉西酮可能通过保护神经元活性发挥作用,而这种作用可能是通过细胞外信号调节激酶途径实现的。     

骨髓基质干细胞与受损PC12细胞的共育体系减少PC12的凋亡

目的 建立体外骨髓基质干细胞(MSCs)与Aβ1-40损伤PC12的共育体系,探讨共育体系抑制Aβ1-40致PC12凋亡的效应与可能机制.方法 分别培养MSCs与PC12,以Aβ1-40刺激PC12后,用转移筛网转移PC12.实验分A组正常培养的PC12+MSCs共育;B组Aβ1-40刺激的PC12+MSCs共育;C组正常PC12的培养上清+MSCs;D组受损PC12上清+MSCs;E组普通1640培养的MSCs.用PI和Annexin-V进行细胞的双染凋亡检测及电镜检测PC12凋亡,以ELISA方法检测各组中上清液的TGF-β、NGF、BDNF、bFGF含量.结果 骨髓基质干细胞与Aβ1-40损伤PC12共育组即B组凋亡细胞数最少(B组46.17%±8.28%,对照组86.39%±9.34%,F=61.637,P＜0.01),ELISA结果显示各组均能检测到bFGF,B组上清中bFGF分泌最高[B组(598.76±41.32)pg/ml,对照组(296.43±47.86)pg/ml,F=24.15,P＜0.01)],各组均检测到TGF-β、NGF和BDNF分泌,但差异无统计学意义.结论 MSCs与Aβ1-40刺激的PC12的共育体系能减少受损PC12的凋亡.     

脑脊液对体外培养骨髓基质细胞生长的影响

目的 观察脑脊液对体外培养的骨髓基质细胞的影响并探讨颅内移植骨髓基质细胞的可能性。方法 分离BALB/C小鼠的骨髓细胞进行体外培养，然后将贴壁的骨髓细胞传代，在含不同比例脑脊液的培养基中培养，观察其生长情况。结果 在含不同比例脑脊液的培养基中生长的骨髓基质细胞形态相似，呈多角形、梭形以及圆形；各组骨髓基质细胞计数差异无显性意义(P＞0．05)。结论 骨髓基质细胞在50％(体积百分浓度)的脑脊液培养基中仍可继续生长、增殖，提示这种细胞对生长环境有高度的适应性。     

骨髓基质细胞修复中枢神经系统损伤的作用及机制

骨髓基质细胞（bone marrow stromal cell，BMSC）是骨髓内造血干细胞以外的非造血干细胞。通常又称作间质干细胞（mesenchymal stem cell），非造血干细胞（nonhematopoietic stem cell）及成纤维细胞集落形成单位（colony—forming—unit of fibroblast），其概念是由德国病理学家Cohnhein于1867年首先提出的，距今已有130多年的历史。BMSC的概念一经提出即受到了人们普遍的重视。人们对BMSC的研究产生了浓厚的兴趣。近十年来，BMSC更成了生命科学领域研究的热点。国外每年都有近200篇关于BMSC的研究报告。本文对BMSC修复中枢神经系统损伤的作用及机制进行综述。     

体外培养骨髓基质细胞向成骨细胞的分化

背景：目前如何有效地诱导骨髓基质细胞向成骨细胞转化，建立稳定的体外培养诱导模式，研究诱导条件的作用机制是骨组织工程研究的重点。 目的：建立一种兔骨髓基质细胞向成骨细胞分化的体外培养体系，观察其成骨过程。 设计：对比观察。 材料：4~8周龄新西兰大白兔，雌雄不拘，用于骨髓基质细胞的原代与传代培养。 方法：将兔股骨骨髓基质细胞进行原代培养，待细胞铺满瓶底近80%后，加入2.5 g/L胰蛋白酶消化传代培养。取生长良好的对数期第2代细胞，以1×108 L-1的细胞浓度接种于预置盖玻片的6孔培养板内。细胞分为2组，实验组使用条件诱导培养基(RPMI 1640标准培养基加入地塞米松10-8 mol/L，β-甘油磷酸钠10 mmol/L，维生素C 50 μg/L)，对照组继续使用标准培养基。两组细胞持续培养(常规两三天换液1次)进行细胞成骨分化观察。 主要观察指标：倒置相差显微镜观察细胞生长及形态变化；苏木精-伊红染色、碱性磷酸酶染色、Ⅰ型胶原免疫组织化学染色、钙结节染色及扫描电镜观察骨髓基质细胞形态变化。 结果：经诱导培养的细胞，在体外逐渐转化、增殖、分泌细胞外基质、最终形成了矿化基质。苏木精-伊红染色显示实验组传代细胞在接近融合为单层时形态多为梭形，多角形等。胞浆内可见颗粒；碱性磷酸酶染色可见实验组传代细胞染色呈强阳性，阳性率达83.2%，并能大量分泌Ⅰ型胶原；对照组仅有个别细胞染色呈阳性。四环素染色观察实验组骨髓基质细胞形成金黄色钙结节，甚至是骨样组织，与典型成骨细胞的生物学特性相似。扫描电镜观察实验组培养的传代细胞已接近融合为单层，细胞呈梭形或多角形表现，细胞表面及细胞间可见钙盐结晶沉积。 结论：实验所建立的兔骨髓基质细胞体外诱导成骨转化体系，能够培养出生长活跃，增殖迅速，稳定、多量向成骨细胞转化的骨髓基质细胞培养模式，所培养的细胞可作为成骨细胞的一种来源，为构建组织工程化骨提供种子细胞。     

氧化损伤星形细胞与骨髓基质细胞混合培养的形态学研究

目的 观察氧化损伤星形细胞与骨髓基质细胞(MSCs)混合培养时星形细胞恢复及存活的形态学变化,以进一步探讨MSCs修复脑损伤的机制.方法 将氧化损伤后的第2代星形细胞与第3代MSCs混合培养作为实验组,分别取上述两种细胞在相同条件下单独培养作为对照组.光镜及电镜观察损伤星形细胞的恢复及存活情况.结果 实验组损伤星形细胞的恢复及两种细胞的存活情况明显优于对照组.结论 将损伤星形细胞与MSCs混合培养可以促进星形细胞恢复,并提高两种细胞的存活能力.MSCs修复脑损伤机制可能与其促进损伤星形细胞恢复、减少星形细胞死亡有关.     

联合应用骨髓基质细胞与bcl-2基因对脑缺血大鼠的神经保护作用

目的 探讨联合应用骨髓基质细胞(MSC)与bcl-2基因对大鼠脑缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡和细胞色素C蛋白表达的影响.方法 采用改良线栓法制成大脑中动脉闭塞大鼠模型.将30只Wistar大鼠随机分为空白对照组、MSC组及MSC+bcl-2组3组,每组10只.MSC+bcl-2组于大鼠脑缺血再灌注3 h后经颈动脉注入pLXSN-bcl-2质粒,MSC组及MSC+bcl-2组于大鼠脑缺血再灌注24 h后经尾静脉植入MSC.各组于再灌注后7 d进行神经功能评分,采用免疫组化法检测脑组织细胞色素C蛋白表达,通过TUNEL法检测细胞凋亡情况.结果 再灌注7 d后,MSC组和MSC+bcl-2组大鼠神经功能缺损评分明显低于空白对照组(P<0.05),MSC+bcl-2组大鼠神经功能评分明显低于MSC组(P<0.05);MSC组和MSC+bcl-2组大鼠细胞色素C免疫反应阳性细胞较空白对照组明显减少(P<0.05),MSC+bcl-2组大鼠细胞色素C免疫反应阳性细胞较MSC组明显减少(P<0.05);空白对照组大鼠缺血侧凋亡细胞明显多于MSC组和MSC+bcl-2组(P<0.05),MSC+bcl-2组大鼠凋亡细胞明显少于MSC组(P<0.05).结论 MSC和bcl-2基因联合治疗脑缺血大鼠可下调其组织细胞色素C表达及抑制神经细胞凋亡,促进大鼠神经功能恢复.     

兔骨髓基质细胞的体外培养及鉴定

背景：骨髓基质细胞的分离纯化、细胞培养、细胞标记、诱导因子、基因转染对细胞生物学影响、细胞载体构建及细胞复合物回植时间的选择等尚处于实验研究阶段。 目的：摸索一种较为简便且可有效获得骨髓基质细胞的体外培养方法。 设计、时间及地点：细胞学体外实验，于2006-06/2007-01在中国科学院北京基因组研究所完成。 材料：SPF级6周龄新西兰大白兔8只，由中国科学院遗传发育研究所实验动物中心提供。 方法：无菌条件下抽取兔骨髓1 mL，D-Hanks液稀释后，离心弃上清，DMEM培养基重悬，制备单细胞悬液，叠加在密度为1.077的等体积淋巴细胞分离液的液面上，离心后取界面云雾状的单个核细胞层，用含有20%胎牛血清的DMEM培养基重悬。以1×10/cm2接种后贴壁法纯化细胞，待70%~80%长满单层后消化传代。 主要观察指标：倒置显微镜下观察细胞生长情况，锥虫蓝染色计数活细胞，苏木精-伊红染色对细胞进行鉴定，MTT法检测细胞活性，观察传代培养的细胞冻存后复苏情况。 结果：接种24 h后细胞开始贴壁，呈短梭形或三角形，且有长短不等的细胞突起；3 d后贴壁细胞开始分裂增殖，部分区域形成细胞团簇；1周后大部分细胞呈成纤维状散落在培养瓶底生长；传代后细胞均匀分布，形态呈细长梭形，并沿一定方向排列，1 mL骨髓基质细胞悬液传3代后的贴壁细胞数可达5×106~1×107数量级。骨髓基质细胞成活率约为90%，经鉴定为单核细胞，接种后1~6 d细胞持续旺盛生长，至第8天细胞活性最高，随后生长活性下降。复苏冻存56 d的细胞，其生长良好，增长迅速。 结论：以淋巴细胞分离液梯度离心后可获得纯度较高的骨髓基质单核细胞，经体外扩增培养能够得到足够数量的种子细胞，冻存复苏后细胞活性无变化。     

骨髓基质细胞对血管性痴呆大鼠的保护作用

目的 观察BMSCs移植对老化血管性痴呆大鼠模型认知功能的改善情况.方法 对皮下注射4周D-半乳糖(D-gal)的大鼠行双血管结扎术(2VO),术后24 h移植BMSCs入侧脑室下区(SVZ).6周后行水迷宫检测,比较各组大鼠认知功能改变情况,同时行免疫荧光组织化学染色,观察BMSCs向神经元转化情况.结果 D-gal加2VO大鼠在水迷宫中所行距离及所花时间均较对正常大鼠明显增加,差异有统计学意义(P＜0.05),提示D-gal加2VO大鼠认知功能有明显缺损,符合老化血管性痴呆大鼠特征.移植6周后BMSCs围绕侧脑室周边分布,有1%的细胞分化为胶质细胞,2%的细胞分化为神经元.同时观察到移植BMSCs 6周后大鼠在水迷宫中所行距离及所花时间较老化血管性痴呆大鼠明显减少,差异有统计学意义(P＜0.05),但泳动速度没有明显差异(P＞0.05).结论 D-gal皮下注射加2VO模型能导致明显的认知功能缺损,而BMSCs移植能显著改善这种认知功能损害,考虑与BMSCs能促进宿主脑内神经功能重塑有关.

Abstract：

Objective To evaluate whether bone marrow stromal cells (BMSCs) transplantation can improve the cognitive function of aged rats with vascular dementia. Methods Thirty rats were equally ramdomized into normal control group and 4 treatment groups; the 4 treatment groups received subcutaneous injection of D-galactose (D-gal) for 4 weeks; and then, two-vessel occlusion (2VO) was performed in 3 of the treatment groups; and 24 h after 2VO, D-gal+2VO+saline group and D-gal+2VO+BMSCs group were subjected to stereotactic injection of normal saline and BMSCs into the subventricular zone (SVZ), respectively. The cognitive function was examined by Morris water maze test 6 weeks after stereotactic injection; immunofluorescence staining was employed to observe the transplantation ratio of BMSCs to neurons. Results Increased times and distances during Morris water maze in rats of the D-gal+2VO group, D-gal+2VO+saline group and D-gal+2VO+BMSCs group were noted as compared with those in the controls, indicating that the cognitive function of rats in these 3 groups was obviously impaired; these rats had the characteristics of having vascular dementia.Transplanted BMSCs in the D-gal+2VO+BMSCs group distributed around the lateral ventricles, and acquired the phenotypes of neurons (2%) and astrocyte (1%) 6 weeks after the transplantation. In addition, compared with that in rats of the D-gal+2VO group and D-gal+2VO+saline group, the cognitive dysfunction of rats in the D-gal+2VO+BMSCs group was improved (needing less time and swimming shorter distance, no difference in speed of swimming). Conclusion The D-gal injection plus 2VO can result in cognitive dysfunction of rats, and the engrafted BMSCs may exhibit the beneficial effect on cognitive function.Neural function remolding caused by interaction between BMSCs and host brain may be responsible for the function improvement     

PC12细胞基础状态氧化蛋白质表达谱

目的绘制基础状态下PC12细胞氧化蛋白质的表达谱,期望为以PC12细胞为模型的实验研究提供基本理论依据。方法采用2D凝胶电泳和westernblot技术相结合的方法获得氧化修饰的蛋白点,运用MALDI-TOF质谱鉴定出被氧化的蛋白质。结果PC12细胞总蛋白中共有91个蛋白点发生氧化修饰,运用MALDI-TOF质谱鉴定出19个氧化蛋白质。结论处于基础状态的PC12细胞存在蛋白质的氧化修饰,可以为病理条件下的氧化损伤研究提供可靠的参照系统。     

氧化损伤星形胶质细胞与骨髓基质细胞共培养的实验研究

目的 观察氧化损伤星形胶质细胞与骨髓基质细胞(BMSCs)共培养时细胞损伤恢复及存活能力的改变,以进一步探讨BMSCs修复脑损伤的机制.方法 过氧化氢(H2O2)损伤体外培养的星形胶质细胞,与BMSCs共培养后光镜下观察细胞生存情况.分别在培养后第1、3天取细胞培养液应用EuSA试剂盒测定碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)以及表皮生长因子(EGF)的分泌水平,并与氧化损伤星形胶质细胞单独培养组和BMSCs单独培养组进行比较.结果 培养后3 d和7 d,共培养组星形胶质细胞的恢复及两种细胞的存活情况明显优于单独培养组.培养后1 d和3 d,共培养组细胞培养液中NGF、BDNF以及bFGF的浓度明显高于两个单独培养组之和,但是共培养组培养液中EGF的浓度明显低于两个单独培养组之和.结论 氧化损伤星形胶质细胞和BMSCs共培养能够提高星形胶质细胞的存活能力,增加NGF、BDNF以及bFGF的分泌水平.BMSCs移植修复脑损伤的功能可能部分是通过促进损伤星形胶质细胞恢复、减少星形胶质细胞死亡、增加神经营养和生长因子分泌完成.     

体外培养人体脂肪基质细胞和骨髓基质细胞的成骨活性对比

背景：目前组织工程骨构建研究中的种子细胞主要来源于骨、骨膜、骨髓及骨外组织,近年来的研究多集中于骨髓基质细胞。而脂肪中基质细胞的发现,有望取代骨髓基质细胞。 目的：观察体外培养脂肪基质细胞与骨髓基质细胞的生物学特性,并比较二者成骨诱导后的碱性磷酸酶活性,从成骨活性方面来评价脂肪基质细胞能否取代骨髓基质细胞。 方法：手术中收集同一人体的脂肪组织与骨髓组织。脂肪组织经机械切割后以Ⅰ型胶原酶消化获得脂肪基质细胞,骨髓组织以淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离骨髓基质细胞;体外培养、传代后以诱导培养液行成骨诱导培养。诱导后第2,3周各检测1次细胞中的碱性磷酸酶活性,并行Von Kossa钙结节染色鉴定成骨细胞。 结果与结论：共获得15例患者的脂肪与骨髓组织,其中10例完成实验。与骨髓基质细胞相比,脂肪基质细胞更易培养成活,扩增速度快;二者细胞形态相似,诱导培养后细胞外基质中均有黑色的钙结节形成;碱性磷酸酶活性二者差异无显著性意义(P > 0.05)。结果提示脂肪组织来源丰富,脂肪基质细胞成活容易,具有与骨髓基质细胞相似的生物学性能,且易培养、增殖快,二者的成骨活性相似,脂肪基质细胞比骨髓基质细胞更具有优势。     

莱菔硫烷拮抗PC12细胞氧化应激损伤的机制

目的 探讨莱菔硫烷对体外1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导的PC12细胞氧化损伤模型是否具有保护作用及其机制.方法 以MPP+损伤PC12细胞制备氧化损伤模型.不同浓度的莱菔硫烷加入培养基观察各组细胞生长情况.后续实验分成4组:正常对照组(A)、莱菔硫烷组(B)、MPP+损伤组(C)、莱菔硫烷预处理+MPP+损伤组(D).通过MTT比色法检测细胞活力,观察不同浓度莱菔硫烷预处理PC12细胞活力变化及不同分组PC12细胞活力变化;流式细胞术检测不同分组PC12细胞中细胞凋亡率的变化;免疫印迹法测定不同分组PC12细胞内转录因子相关因子2(Nrf2)、血红素加氧酶1(HO-1)及醌还原氧化酶1(NQ01)蛋白的表达变化.结果 A组细胞存活率(98.70％)与MPP+(500μmol/L)组(58.16％)相比差异有统计学意义(F =21.83,P＜0.05),D组细胞存活率明显提高.C组细胞凋亡率升高,D组细胞与C组相比差异有统计学意义,莱菔硫烷预处理后细胞凋亡率明显减低.C组Nrf2、HO-1、NQ01蛋白表达下降,D组Nrf2、HO-1、NQ01蛋白表达升高.结论 莱菔硫烷对MPP+诱导的PC12细胞损伤具有保护作用,莱菔硫烷对MPP+诱导的PC12细胞损伤的保护作用可能通过激活Nrf2-抗氧化反应元件通路途径实现.     

CDNF基因修饰的大鼠骨髓间充质干细胞对6-OHDA诱导PC12细胞凋亡的抑制作用

目的探讨CDNF对6-羟多巴胺(6-OHDA)诱导的细胞凋亡效应的抑制作用。方法应用Li-po2000将重组真核表达质粒pDsRed-C1-CDNF转染至BMSCs,经G418筛选后获得稳定表达CDNF的MSCs细胞株(重命名为CDNF-MSCs细胞株)。应用MTT法和AnnexinⅤ-FITC细胞凋亡分析法分别检测CDNF-MSCs细胞上清液对6-OHDA诱导的PC12细胞凋亡作用的影响。结果通过G418筛选成功获得稳定表达CDNF的MSCs转染细胞,CDNF-MSCs细胞上清液预处理的PC12细胞对6-OHDA诱导的凋亡效应具有抑制作用,能有效的降低细胞的凋亡率。结论 CDNF作为一种分泌性蛋白,可显著抑制6-OHDA诱导PC12细胞凋亡。     

人参皂甙RD预处理对谷氨酸所致PC12细胞损伤的保护作用

目的探讨人参皂甙RD预处理对谷氨酸所致PC12细胞损伤的影响。方法将PC12细胞分为对照组、谷氨酸损伤组和人参皂甙RD预处理组。对照组细胞正常培养;谷氨酸损伤组细胞置于含10 mmon/L谷氨酸的DMEM培养基中培养24 h;人参皂甙RD预处理组细胞经50μmol/L人参皂甙RD预处理30 min后,再加谷氨酸继续培养24 h。采用噻唑蓝比色法检测细胞活力;按试剂盒检测培养液乳酸脱氢酶（LDH）释放量;流式细胞仪检测胞内活性氧（ROS）水平;按试剂盒检测细胞内超氧化物歧化酶（SOD）含量。结果人参皂甙RD预处理最佳浓度为50μmol/L。与谷氨酸损伤组相比,人参皂甙RD预处理PC12细胞活力明显增高（P〈0.05）,培养液LDH释放量明显降低（P〈0.05）,胞内ROS含量明显降低（P〈0.05）,胞内SOD含量明显增高（P〈0.05）。结论人参皂甙RD预处理可减轻谷氨酸引起的PC12细胞损伤。     

谷氨酸对分化PC12细胞的氧化损伤及人参皂苷Rg1的保护作用

目的观察不同浓度的谷氨酸对PC12细胞的氧化损伤,探讨人参皂苷Rg1对谷氨酸兴奋性毒性的拮抗作用。方法用MTT法检测细胞活性及MDA、GSH、GSH-Px测定,检测谷氨酸对PC12细胞的损害,用人参皂苷Rg1做保护研究。结果谷氨酸可导致PC12细胞活力明显下降,MDA、GSH、GSH-Px测定结果与正常对照组和人参皂苷Rg1保护组有明显差异(P<0．01)。结论人参皂苷Rg1对谷氨酸所致的氧化损伤有保护作用。     

骨髓间质干细胞的分离培养及向神经细胞分化的研究

目的 研究骨髓间质干细胞的分离培养方法及其向神经元细胞分化的条件及可行性。方法 取大鼠骨髓，采用贴壁培养筛选法，分离培养骨髓问质干细胞，经β-巯基乙醇诱导，骨髓问质干细胞可向神经元样细胞分化，免疫细胞化学方法对分化细胞进行鉴定。结果 分离的骨髓间质干细胞可体外增殖，经β-巯基乙醇诱导，骨髓间质干细胞可向神经元细胞分化，细胞突起增多，具有神经元的形态学特征；分化后的细胞表达神经元标志物-神经元特异性烯醇化酶(NSE)和神经微丝(NF)。结论 骨髓组织中存在着骨髓间质干细胞，易分离和培养，体外可增殖，可横向分化为神经元，从而为中枢神经系统疾病的移植治疗提供了细胞来源。