瓜氨酸化波形蛋白对类风湿关节炎患者外周血来源树突状细胞的干预作用

目的 探讨波形蛋白瓜氨酸化前后在体外对类风湿关节炎(RA)患者外周血来源树突状细胞( DCs)的细胞形态、表型和功能的影响.方法 分离外周血单个核细胞(PBMCs),粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素(IL)-4体外培养制备未成熟DCs(imDCs),分别用脂多糖、瓜氨酸化波形蛋白(cVim)和波形蛋白刺激培养的imDCs,磷酸盐缓冲液(PBS)作为阴性对照,流式细胞仪检测DCs表面标志CD14、CD80、CD83、CD86、主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ、MHCⅡ表达变化.将实验组获得的DCs和同种异体T细胞进行混合淋巴细胞反应,通过单溶液细胞增殖分析(MTS)法检测T细胞的增殖情况.采用t检验.结果 以阴性对照组imDCs的各个免疫表型阳性率作为1,脂多糖能显著诱导RAimDCs表面MHCⅡ、CD80、CD83、CD86表达(1.07±0.14,1.25±0.13,1.90±1.08,2.44±0.65,P均＜0.05);cVim诱导MHCⅡ(1.18±0.09)、CD83( 1.97±0.99)表达水平上调(P＜0.05,P＜0.01);波形蛋白对MHCⅡ及CD83、CD86表达无影响(0.950.11,0.90±0.29,1.04±0.06),仅抑制CD80表达(0.82±0.18,P＜0.01).与脂多糖组相比,cVim组的MHCⅡ表达水平显著增高(P＜0.05),而CD80、CD86(0.83±0.36、1.32±0.15)的表达水平则低于脂多糖组(P＜0.01,P＜0.05);cVim组MHCⅡ和CD83的表达水平显著高于波形蛋白组(P均＜0.05).混合淋巴细胞反应显示经脂多糖和cVim诱生的DCs对同种异体T细胞具有明显刺激增殖作用,且随着DCs细胞浓度的增加而作用增强;波形蛋白诱生的DCs则无刺激增殖作用.结论cVim可诱导imDCs成熟,并且能够提高细胞表面共刺激分子的表达.     

HBsAg负载的慢性乙肝患者DCs诱导特异性Th1细胞分化的作用

目的:研究HBsAg负载的慢性乙肝患者外周血树突状细胞(dendritic cells,DCs)对自身Th1细胞分化的诱导作用.方法:Fico11密度梯度离心和贴壁法分离慢性乙肝患者外周血单核细胞,以含ThIL-4 rhGMCSF的完全培养基诱导DCs.流式细胞术检测各组DC表面CD80,CD86,CD40和HLA-DR分子的表达,CCK-8法检测各组DCs刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力,ELISA法检测各组DCs培养液上清中IL-12的水平.免疫磁珠分选慢性乙肝患者外周血CD4 T细胞,分别与患者自身的DCs共培养,细胞内细胞因子染色,流式细胞仪检测共培养后CD4 T细胞内特征性细胞因子IFN-γ和IL-4,ELISA法检测共培养上清中IFN-γ/IL-4的水平.结果:与对照组相比,HBsAg、IFN-γ和HBsAg IFN-γ组DCs表面表达CD80,CD86,CD40和HLA-DR分子水平较高;刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力较强;DCs分泌的上清液中、IL-12水平也较高.与对照组相比,HBsAg、IFN-γ和HBsAg IFN-γ组DCs与自身Th细胞共培养后,Th1细胞占CD4 T细胞的百分比升高(10.76%±3.98%,11.43%±4.32%,15.28%±4.73% vs 7.84%±3.10%,P＜0.01),Th2细胞占CD4 T细胞的百分比降低(1.43%±0.96%.1.68%±0.16%,0.92%±0.21% vs 2.61%±1.27%,P＜0.01),共培养上清中IFN-γ的水平增高(578±47 mg/L,496±92 mg/L,784±97 mg/L vs 342±34 meg/L,P＜0.05),IL-4的水平降低(187±52 mg/L,169±38 mg/L,89±37 mg/L vs 226±48 mg/L,P＜0.05),以HBsAg IFN-γ组最为明显.结论:经HBsAg负载的DCs可以改善患者体内因DCs功能低下而引起的Th1细胞分化不足的状态.     

慢性阻塞性肺疾病大鼠肺树突细胞数量及成熟度变化与慢性炎症的关系

目的 观察香烟烟雾暴露对大鼠肺组织树突细胞数量、成熟度及肺组织慢性炎症变化的影响.方法 将30只雄性F344大鼠按随机数字表法分为香烟烟雾暴露组(暴露组)、断烟组和健康对照组(对照组),每组10只.采用香烟烟雾暴露法建立大鼠COPD模型,HE染色法检测大鼠气道炎症病理评分及肺泡平均内衬间隔,免疫组织化学ABC法观察大鼠肺组织中CD11c+、CD86+和CD8+ T细胞的分布及数量变化,流式细胞术检测CD11c+/CD86+和CD11c+/主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ+与CD11c+树突细胞比值.结果 暴露组和断烟组大鼠肺组织中出现COPD特征性病理改变,气道炎症病理评分[(390±33)分和(324±28)分]及肺泡平均内衬间隔[(68±11)μm和(58±9)μm]明显高于对照组[(56±13)分和(36±6)μm],差异均有统计学意义(F值分别为459.85和34.03,均P＜0.05).暴露组和断烟组大鼠CD11c+树突细胞阳性率[(1.47±0.12)%和(1.30±0.17)%]及CD86+树突细胞阳性率[(1.26±0.18)%和(1.02±0.08)%]均明显高于对照组[(0.96±0.08)%和(0.65±0.03)%],差异均有统计学意义(F值分别为6.55和30.26,均P＜0.05);暴露组和断烟组大鼠CD8+T细胞阳性率[(2.72±0.15)%和(2.35±0.23)%]均明显高于对照组[(1.39±0.11)%],差异有统计学意义(F=16.07,P＜0.05);暴露组和断烟组大鼠CD11c+/CD86+树突细胞及CD11c+/MHCⅡ+树突细胞占CD11c+树突细胞比例[(5.5±0.4)%和(4.8±0.4)%]及[(4.2±0.3)%和(3.3±0.3)%]明显低于对照组[(8.0±0.5)%和(6.1±0.5)%],差异均有统计学意义(F值分别为14.34和12.82,均P＜0.05).暴露组与断烟组上述各项指标比较,差异均无统计学意义(t值为1.10～2.11,均P＞0.05).结论 香烟烟雾暴露诱导COPD大鼠肺组织中树突细胞数量明显增加,成熟度明显下降,断烟后此趋势无明显变化,且以CD8+ T细胞浸润为主的慢性炎症反应持续存在,提示树突细胞数量变化及成熟异常可能参与了COPD慢性炎症迁延进展.

Abstract：

Objective To evaluate the changes in the number and maturation of lung tissue dendritic cells (DCs) and to assess the chronic inflammation in a cigarette smoke-induced COPD model in rats.Methods Thirty male F344 rats were randomly divided into 3 groups (n = 10):a control group, a smoke-exposure group and a smoking cessation group.Rat lung pathomorphological changes were observed by hematoxylin-eosin (HE) stain.Lung tissue CD11c+ DCs, CD85+ DCs and CD8+ T cell numbers were observed by immunohistochemisty method.Flow cytometry was used for detection of CD11c+/CD86+ DCs and CD11c+/MHCⅡ + DCs proportions.Results The airway inflammatory pathological score and the mean linear intercept (MLI) obtained from he smoke-exposure group and the smoking cessation group (390 ± 33,324 + 28 ) and[(68 ± 11 ) μm, (58 ± 9) μm]were higher than those in the control group ( 56 ± 13 ) and ( 36 ± 6 ) μm( F =459.85 and 34.03, all P ＜0.05 ).In the smoke-exposure group and the smoking cessation group, the positive rate of CD11c+ DCs[(1.47 ±0.12)%, (1.30 ±0.17)%], and the positive rate of CD86+ DCs [( 1.26 ± 0.18 ) %, ( 1.02 ± 0.08 ) %]were higher than those in the control group[( 0.96 ± 0.08 ) %,(0.65 ± 0.03 ) %]( F = 6.55 and 30.26, all P ＜ 0.05 ), but there was no significant difference between the smoke-exposure group and the smoking cessation group ( t = 1.10 and 1.47, all P ＞ 0.05 ).In the smoke-exposure group and the smoking cessation group, CD8+ T positive rate[(2.72 ±0.15)%, (2.35 ±0.23)%]was higher than that in the control group[(1.39 ±0.11)%](F = 16.07, P ＜0.05).CD11c+/CD86+ DCs and CD11c+/MHC Ⅱ+DCs percentages[(5.5 ±0.4)%, (4.8 ±0.4)%],[(4.2 ±0.4)%, (3.3±0.3 )%]decreased in the smoke-exposure group and the smoking cessation group as compared to the control group[(8.0±0.5 ) %, (6.1 ± 0.5 ) %]( F = 14.34 and 12.82, all P ＜ 0.05 ).There was no significant difference between all the above index from the smoke-exposure group and the smoking cessation group ( t = 1.10 and 2.11, all P ＞ 0.05 ).Conclusions Cigarette smoke exposure induced increased DCs transmigrated and influenced the maturation of DCs in COPD rats.Even after smoking cessation, non-specific chronic inflammation was still present, suggesting that DCs number and maturation abnormality may be involved in the chronic inflammation of COPD.     

多房棘球蚴病患者血源树突状细胞形态观察和表型检测

目的了解多房棘球蚴病患者血源树突状细胞(DCs)形态和表型特点。方法分别收集多房棘球蚴病病例(AE组) 10例、汉族健康志愿者(HH组) 10人、藏族健康志愿者(TH组) 10人的外周血,分离单核细胞贴壁培养,应用重组人集落刺激因子和重组人白细胞介素-4诱导获得DCs。分别收集各组培养第1、 3、 5和7天的DCs,采用倒置显微镜和扫描电镜观察细胞形态。3组DCs诱导培养至第7天时,流式细胞术检测细胞表面标志分子的阳性表达率,采用SPSS 22.0统计学软件进行分析。结果体外诱导培养第1天, AE组、 HH组和TH组DCs大部分呈单个圆形、边界清晰、细胞质透亮、体积较小,浮于细胞液中。诱导培养第3天, 3组DCs聚集呈半悬浮状,细胞变大呈不规则形态。诱导培养第5天, 3组DCs形成集落,多数DCs边缘不光滑呈毛刺状。诱导培养至第7天, 3组DCs呈半悬浮生长,边缘具有丝状刺突; AE组中诱导分化的DCs与HH组和TH组相比所形成的集落数量相对较少,细胞胞体所形成的不规则突起不明显且细胞表面树突状突起较少,呈非典型的DCs形态; AE组诱导分化的DCs表面协同共刺激分子CD1a、 CD80和CD86阳性表达率分别为12.73%±1.73%、 12.41%±2.83%和16.34%±3.59%,与HH组和TH组相比差异有统计学意义(P 0.05),而HH组(18.40%±1.20%、 20.77%±3.40%、 31.78%±5.02%)和TH组(17.50%±1.44%、 23.75%±5.33%、 33.20%±2.47%)相比差异无统计学意义(P 0.05)。结论AE组诱导分化的DCs形态不典型、其重要细胞表面标志分子阳性表达率降低,表现为成熟障碍。     

日本血吸虫可溶性成虫抗原和虫卵抗原对CD4~+ T淋巴细胞凋亡和细胞周期的影响

目的观察并比较日本血吸虫可溶性成虫抗原(SWA)、可溶性虫卵抗原(SEA)对小鼠CD4+T淋巴细胞凋亡和细胞周期的影响。方法以免疫磁珠分选正常小鼠脾细胞中的CD4+T淋巴细胞后,与羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯标记的抗原递呈细胞共培养,并分别以PBS、SWA、SEA刺激。36h后以流式细胞术(FCM)结合caspase-3荧光抗体标记技术检测CD4+T淋巴细胞的凋亡水平;96h后以碘化丙锭染色结合FCM分析CD4+T淋巴细胞周期分布情况。结果凋亡分析结果显示,经SEA和SWA刺激后,外周CD4+T细胞的凋亡百分比分别为(1.24±0.29)%和(1.52±0.38)%,两者差异无统计学意义(P0.05)。细胞周期分析表明,SWA组处于G1期、S期和G2/M期的细胞百分比分别为(78.91±2.98)%、(7.39±0.85%)和(10.69±1.05)%;与之相比,SEA组G1期细胞百分比[(59.42±1.32)%]显著降低,S期[(21.07±0.88)%]和G2/M期[(18.88±1.21)%]显著增加,差异均有统计学意义(P均0.01)。结论SWA、SEA均可诱导CD4+T淋巴细胞凋亡,SEA促进CD4+T淋巴细胞进入分裂周期的作用更明显。     

特发性血小板减少性紫癜患者免疫相关指标的检测及其临床意义

目的 检测特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者免疫相关指标的变化,探讨其在ITP发病机制中的作用及其临床意义.方法 应用酶联免疫斑点技术(ELISPOT)、改良血小板抗原单克隆抗体固相化检测技术(MAIPA)、流式细胞术及夹心法ELISA分别检测64例1TP患者及31例正常对照者分泌GPⅡb/Ⅲa抗体B细胞、血小板特异性抗体(抗GPⅡb/Ⅲa抗体、抗GP I b/Ⅸ抗体)、T淋巴细胞亚群、网织血小板(RP)及血小板生成素(TPO)的变化.结果 ITP患者分泌GPⅡb/Ⅲa抗体B细胞频数[急性ITP组患者为7.6±4.6/105个外周血单个核细胞(PBMC),慢性ITP组患者为5.3±3.0/105个PBMC]、血小板特异性抗体(抗GPⅡb/Ⅲa抗体、抗GPI b/Ⅸ抗体)的吸光度值(急性ITP组患者为0.51±0.11、0.48±0.06,慢性ITP组患者为0.49±0.10、0.46±0.09)、CD8+T淋巴细胞百分比[(27.09±9.86)%]、RP百分比[巨核细胞增多组为(24.85±19.18)%,巨核细胞正常组为(23.89±18.90)%]明显高于正常对照组[1.3±0.5/105个PBMC,0.33±0.06,0.41±0.03,(22.08±4 54)%,(8.19±2.46)%,P值均＜0.05],其中急性ITP患者分泌GPⅡb/Ⅲa抗体B细胞高于慢性ITP患者(P＜0.05).ITP组CD3+T淋巴细胞百分比、CD4+T淋巴细胞百分比及CD4+/CD8+比值[(60.88±14.59)%、(28.41±10.55)%、1.18±0.59]均低于正常对照组[(69.89±6.43)%、(35.38±5.05)%、1.64±0.29,P值均＜0.05].ITP患者巨核细胞增多组TPO水平(72.09±41.64)明显低于ITP患者巨核细胞正常组(118.60±70.72,P＜0.05),与正常对照组(75.37±26.32)之间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 分泌GPⅡb/Ⅲa抗体B细胞、血小板特异性抗体、T淋巴细胞亚群、RP%及TPO在ITP诊断及指导定向干预治疗中有一定的意义.     

调节性T细胞在原发性干燥综合征中的异常表达

目的 观察调节性T细胞在原发性干燥综合征(pSS)患者外周血和唇腺中的表达.方法 选取23例pSS患者和15名健康对照组,通过流式细胞术检测2组之间外周血调节性T细胞的表达情况,采用免疫磁珠分选外周血CD4+T细胞,提取叉头样转录因子(Foxp3)的mRNA,进行实时荧光定量的聚合酶链反应(PCR)检测.选取23例pSS患者和5例除外pSS的原发性胆汁性肝硬化(PBC)患者,通过免疫组织化学方法分析2组之间唇腺组织中CD4+和Foxp3+T细胞的表达差异.采用t检验进行统计 学处理.结果 pSS组[(5±6)％]外周血Foxp3+T细胞的表达比健康对照组[(10±5)％]明显降低(t=2.190; P=0.036); Foxp3-mRNA的含量pSS组(0.08±0.05)与健康对照组(0.09±0.03)之间差异无统计学意义(t=0.695;P＞0.05);与PBC对照组唇腺中CD4+T细胞[(11±6)％]和Foxp3+T细胞[(3.2±1.1)％]比较,pSS患者唇腺中CD4+T细胞[(30±10)％]和Foxp3+T细胞[(10.7±5.8)％]表达增加(t=4.072,2.840;P均＜0.05).结论 调节性T细胞在pSS外周血表达降低,而在唇腺中的表达并未减少,二者之间表达不一致,Foxp3参与了pSS的发病.     

乙型肝炎患者外周血CD4+ CD25+调节性T细胞表型与功能分析

目的 观察急、慢性乙型肝炎(AHB、CHB)患者外周血CD4+CD25 high调节性T细胞(Treg)的频率、表型和功能特点.方法 采集16例AHB急性发病期(发病后第1周)患者、72例CHB患者和32例健康人的外周血,检测Treg频率,并分析其表面CD45RO、CD45RA、HLA-DR、CD95和细胞内细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)的表达水平.应用实时荧光定量RT-PCR检测CD4+ CD25+、CD4+ CD25-、CD4+和CD4-等细胞亚群和外周血单个核细胞(PBMC)的FoxP3 mRNA表达量.通过MACS免疫磁珠分选Treg,并应用[3H]掺入法检测Treg抑制抗-CD3抗体和HBV抗原刺激的PBMC增殖能力,并观察Treg对HBV抗原或抗-CD3抗体刺激自体PBMC分泌IFNγ的影响.结果 CD4+CD25 high Treg高表达CD45RO、HLA-DR、CD95和细胞内CTLA-4,低表达CD45RA,并且较特异的高表达FoxP3 mRNA.乙型肝炎病人外周血Treg频率与健康对照(3.50±0.72)%比较无统计学差异,但CHB组(3.90±1.44)%显著高于AHB组(3.10±0.87)%,P＜0.05.Treg本身对于HBV抗原或抗-CD3抗体刺激没有明显的增殖反应和IFNγ分泌,但可抑制自体PBMC增殖和IFNγ分泌,其中对HBV抗原刺激引起的细胞反应抑制作用较强.结论 HBV感染者外周血Treg较特异地表达FoxP3分子,能抑制HBV抗原特异性细胞免疫反应,这对于深入阐明CHB发病机制具有重要意义.     

CD28-T细胞亚群在类风湿关节炎患者外周血和关节液中的表达

目的 探讨CD28-T细胞亚群在类风湿关节炎(RA)患者外周血和关节液中的变化和意义。方法 随机选择RA患者45例,取新鲜抗凝外周血单个核细胞(PBMC),其中15例同时提取关节液单个核细胞( SFMC),以流式细胞技术检测CD28-T细胞数量及其表面可诱导共刺激分子(ICOS)的表达。2 组间比较用独立样本t检验。结果 ①与PBMC相比,RA患者SFMC中CD4+CD28+ ICOS+、CD4+CD28-ICOS+、CD8+ CD28+、CD8+ CD28+ ICOS+T细胞明显升高[(36±19)％与(15±8)％,t=-4.234,P＜0.01;(2.1±2.2)％与(0.6±1.4)％,t=-3.143,P＜0.01;(62±15)％与(47±18)％,t=-2.885,P＜0.01;(9±9)％与(3±3)％,t=-2.131,P＜0.05];CD8+CD28-T细胞明显降低[(38±15)％与(54±18)％,t=2.975,P＜0.01];CD8+ CD28- ICOS+、C1D4+CD28+和CD4+CD28-T细胞无明显变化（P＞0.05）。②同一RA患者SFMC与PBMC相比,CD4+CD28+ICOS+、CD8+ CD28+T细胞明显升高[(38±18)％与(16±10)％,t=-4.065,P＜0.01;(61±16)％与(41±21)％,t=-2.883,P＜0.01];CD8+ CD28-T细胞明显降低[(39±16)％与(59±21)％,t=2.949,P＜0.01]。③缓解期与活动期RA患者相比,PBMC中CD4+CD28-、CD8+ CD28-、CD28-ICOS+T细胞无明显变化（P＞0.05）。结论 RA患者关节液中CD28-T细胞亚群失衡和ICOS分子表达异常,可能是导致RA关节损伤的重要机制。     

慢性乙型肝炎患者抗病毒治疗过程中程序性死亡分子1及其配体表达的变化

目的 探讨慢性乙型肝炎患者在抗病毒治疗过程中程序性死亡分子1(PD-1)及其主要配体PD-L1表达的变化情况及其与HBeAg/抗-Hbe血清学转换的关系.方法 对10例人类白细胞抗原(HLA)-A2阳性的HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者予以替比夫定抗病毒治疗24 周,分别于治疗的0、12周和24周随访,检测HBV DNA水平、外周血单个核细胞(PBMC)表面PD-1和PD-L1表达水平、HBV特异性T淋巴细胞数量与其表达PD 1水平,及PBMC体外培养上清液中干扰素(IFN)γ水平.其中HBV DNA定量采用荧光定量PCR法检测;PBMC自新鲜血分离,部分PBMC加入重组HBcAg体外培养7d,加入HBV抗原表位肽五聚体复合体;PD-1和PD-L1阳性细胞、CD8'T淋巴细胞以及CD8和PD-1双阳性细胞用流式细胞仪检测;IFN γ水平用酶联免疫吸附试验检测.比较不同时间点PBMC表面PD-1和PD L1表达水平、HBV特异性CD8'T淋巴细胞数量及其PD-1表达水平、PBMC培养上清液中IFN γ水平.对抗病毒治疗前后对应指标数值的变化采用配对t检验分析.结果 治疗前HBV DNA水平为5.16～8.77 log10拷贝/ml,治疗24周时,7例HBV DNA水平低于检测下限,3例仍可检测到,但明显低于基线水平.2例HBeAg/抗-Hbe血清学转换,2例HBeAg阴转,6例仍维持HBeAg阳性.0、12周和24周PBMC表面PD 1表达水平分别为52.1%±17.0%、39.1%±18.2%和23.4%±16.3%(24周和0周比较,P＜0.01);PD-L1分别为45.6%±15.4%、34.6%±16.2%和20.9%±9.5%(24周和0周,P＜0.01;24周和12周比较P＜0.05);HBV特异性T淋巴细胞上PD-1表达水平分别为76.2%±10.4%、66.5%±15.4%和49.5%±25.3%(24周和0周比较,P＜0.01;12周和0周比较,P＜0.05;24周和12周比较,P＜0.05);HBV特异性T淋巴细胞分别为1.3%±0.5%、1.5%±1.0%和2.2%±1.5%; IFN γ水平(pg/ml)分别为91.7±82.1、99.4+93.5和109.0+86.6.24周HBeAg/抗-Hbe血清学转换者上述指标变化明显大于无HBeAg/抗-Hbe血清学转换者.结论 直接抑制HBV复制能降低PD-1、PD-L1表达水平,并增加HBV特异性CD8'T淋巴细胞的数量和功能.早期PD-1快速下降和HBV特异性T淋巴细胞数量及功能的恢复与早期HBeAg/抗-Hbe血清学转换的关系有待于进一步研究.     

经卡介苗活化的负载PANC1裂解产物的树突状细胞疫苗体外抗胰腺癌作用

目的 探讨负载胰腺癌细胞株PANC1裂解产物(tumor lysate,TL)的树突状细胞(dendritic cells,DC)经卡介苗(CGB)活化后诱导的自体淋巴细胞体外抗胰腺癌效应.方法 应用rhGM-CSF和rhIL-4从健康人外周血单个核细胞诱导培养DC,用TL负载DC,并用CGB促其成熟.倒置相差显微镜观察DC形态,流式细胞仪检测细胞CD1a、CD83、CD86及HLA-DR表型,ELISA法检测培养上清液中TNF-α和IL-12p70含量.CCK-8检测DC诱导自体混合淋巴细胞的增殖率以及活化淋巴细胞对PANCl、PaTu8988及SCG7901细胞的杀伤率.结果 CGB活化负载TL的DC后,CD83和CD86阳性率分别从(3.7±0.3)%和(38.6±5.0)%显著增加至(16.5±0.6)%和(76.5±2.5)%(P＜0.05);DC分泌的IL-12p70和TNF-α量分别从(20.18±2.06)pg/ml和(61.38±1.19)pg/ml显著增加至(62.48±3.80)pg/ml和(592.53±17.96)pg/ml(P＜0.01);DC与自体混合淋巴细胞以1∶100、1∶50、1∶10、1∶5的比例共培养,淋巴细胞增殖率分别从(3.90±1.41)%、(4.07±0.40)%、(3.39±1.05)%、(2.82±0.39)%显著增加至(55.38±3.58)%、(75.00±2.54)%、(77.07±3.40)%、(99.07±2.40)%(P＜0.01);DC活化淋巴细胞对PANC1细胞的杀伤率在效靶比为1∶5、1∶10、1∶20、1∶50时分别可达(71.73±0.46)%、(49.44±0.98)%、(31.76±2.77)%、(19.03±3.04)%,但对PaTu8988和SCG7901细胞的杀伤率显著降低.结论经CGB活化的胰腺癌DC疫苗成熟度增加,体外表现出高效特异的抗胰腺癌细胞的效应.     

艾滋病患者胃黏膜与外周血中人类免疫缺陷病毒感染和CD4~+T淋巴细胞数量的区室性差异的探讨

目的 探讨AIDS患者胃黏膜与外周血中HIV感染和CD4~+T淋巴细胞数量的区室性差异.方法 选取AIDS患者35例,对照组为HIV抗体阴性者10例,均进行胃镜检查并收集外周血.PCR法制备地高辛标记HIV-1长末端重复序列(LTR)、gag基因的双链cDNA探针,核酸原位杂交方法观察胃黏膜组织冰冻切片和外周血单个核细胞(PBMC)涂片H1V感染情况,免疫组织化学方法检测CD41T淋巴细胞,数据结果行t检验.结果 AIDS未治疗组胃黏膜中HIV阳性率为(1.67±1.48)%,PBMC中为(19.37±9.23)%.AIDS未治疗组与高效抗反转录病毒治疗(HAART)组各组间的胃黏膜HIV阳性率差异尤统计学意义(t=-0.996,t=-0.794,t=-0.461;P＞0.05).PBMC涂片中,治疗1～4年组HIV阳性率为(4.25±3.47)%,明显低于未治疗组的(19.37±9.23)%(t=3.000,P＜0.05).AIDS未治疗组胃黏膜单个核细胞(MMC)中CD4+T淋巴细胞阳性率为(12.53±8.14)%,PBMC中CD4+T淋巴细胞阳性率为(19.00±9.55)%,HAART1～4年组胃黏膜MMC中CD4~+T淋巴细胞计数为(37.44±18.00)%,仍低于对照组的(50.35±3.41)%(t=-4.620,P＜0.01),但PBMC中CD4+T淋巴细胞计数与对照组比较,差异无统计学意义(t=-2.094,P＞0.05).结论 胃黏膜与外周血中HIV感染和CD4~+T淋巴细胞数量存在区室性差异.     

支气管哮喘患者血清对内皮穿越模型中单核细胞分化为树突状细胞的作用

目的 探讨支气管哮喘(简称哮喘)患者血清和正常血清对内皮穿越模型中单核细胞向树突状细胞(DC)分化和功能的作用及其机制.方法 在江苏省哮喘联盟数据库中选择2008年5月至2009年5月轻～中度哮喘患者12例,募集匹配的健康志愿者12名,常规分离血清和外周血单个核细胞,免疫磁珠法获得单核细胞.选择健康产妇5名,胰酶消化法获得人脐静脉内皮细胞(第2代),培养融合至内皮细胞单层.在内皮细胞上方加入单核细胞及哮喘血清(哮喘组)或正常血清(对照组),构建内皮穿越模型.硝酸银染色法观察单核细胞来源的树突状细胞(MDDC)迁移行为.于48 h收集MDDC,扫描电镜观察形态学特征,电泳迁移率实验检测核因子κB(NF-κB)活性,流式细胞术、ELISA和混合淋巴细胞反应分别检测其表型和功能.结果 (1)在内皮穿越模型中,单核细胞2 h后发生正向穿越,48 h后发生逆向穿越并分化为DC.(2)与穿越前单核细胞[CD14(81±6)%、人白细胞抗原DR(HLA-DR)(24±5)%、CD80(2.8±2.0)%、CD86(14±4)%、CD83(0.9±0.8)%]比较,对照组MDDC的CDi4[(20±5)%]显著下降(F=49.01,P＜0.05)、HLA-DR、CD80、CD86和CD83[(43±4)%、(17.9±3.5)%、(43±11)%和(6.7±1.8)%]均显著增高(均P＜0.05),但CD83仍较低,为未成熟DC.(3)与对照组比较,哮喘组MDDC的HLA-DR和CD86[(55±6)%和(59±12)%]相仿(F值分别为15.29和35.97,均P＞0.05)、CD80和CD83[(49.7±10.2)%和(30.2±6.8)%]显著增高(F值分别为34.01和20.68,均P＜0.05),为成熟DC.并且,哮喘组MDDC呈典型的树枝样突起,其NF-κB活性、白细胞介素-12 P70水平和T细胞增殖作用[(100±11)%、(568±43)ng/L和(2033±198)cpm]较对照组[(12±3)%、(220±35)ng/L和(952±64)cpm]显著增高(均P＜0.05).结论 哮喘血清可诱导内皮穿越模型中单核细胞向DC异常分化成熟,并与NF-κB过度激活有关.该模型为剖析哮喘免疫学发病机制和筛选新型抗哮喘药物建立了新的体外实验平台.

Abstract：

Objective To explore the effect of asthmatic and healthy serum on differentiation and function of monocyte-derived dendritic cells (MDDC) in a transendothelial trafficking model. Methods The sera and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were separated from 12 asthmatic patients and 12 healthy volunteers, and monocytes were selected from PBMC using magnetic beads. The trypsin-digested human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) at passage 2 from 5 healthy lying-in women were used to construct the transendothelial trafficking model under asthmatic or healthy serum, wherein MDDC were identified by silver nitrate staining and scanning electron microscopy. Nuclear factor κB (NF-κB) activity was determined by electrophoretic mobility shift assay. Flow cytometry, ELISA and mixed leukocyte reaction were relevantly utilized to detect the phenotype, cytokine and T cell proliferation. Results ( 1 ) Monocytes traversed through HUVEC monolayer after 2 h, and reverse-transmigrated to develop into DC 48 h later. ( 2 ) The healthy serum stimulated monocytes into immature MDDC with lower CD14 [ ( 20 ±5)%] (F=49.01, P＜0.05), and higher HLA-DR, CD80, CD86 and CD83 [(43 ±4)%, (17.9 ±3.5)%, (43 ± 11)% and (6.7 ± 1.8)%, respectively] (F= 10.35 -40.17, all P＜0.05) than monocytes did before transmigration at 0 h [ CD14(81 ±6)%, HLA-DR (24 ±5)%, CD80(2. 8 ±2. 0)%,CD86( 14 ±4)% and CD83(0. 9 ±0. 8)%, respectively]. (3) The asthmatic serum stimulated monocytes into mature MDDC, characteristic of dendrites, with similar HLA-DR and CD86 [ ( 55 ± 6 ) % and ( 59 ±12)%] (F=15.29 and 35.97, all P ＞0.05), higher CD80 and CD83 [(49.7 ± 10.2)% and (30.2 ±6. 8) % ] ( F = 4. 01 and 20. 68, all P ＜ 0. 05), accompanied by increased levels of NF-κB activity, IL-12 p70 and T cell proliferation [ ( 100 ± 11 )%, (568 ±43) ng/L and (2033 ± 198) cpm, respectively] (F=49. 23 - 350. 84, all P ＜ 0. 05 ) relative to the healthy serum-stimulated immature MDDC [ ( 12 ± 3 ) %,(220 ± 35) ng/L and (952 ± 64) cpm, respectively ]. Conclusion The asthmatic serum induces mature MDDC in association with NF-κB overactivation in the transendothelial trafficking model, which provides a promising experimental platform for both investigation of immunological mechanisms in asthma and screening of novel anti-asthma drugs in vitro.     

系统性红斑狼疮患者外周血CD4+CD25highFoxp3+调节性T细胞数量和Foxp3mRNA的表达水平与疾病活动性的相关性

目的 研究系统性红斑狼疮(SEE)患者CD4+CD25highFoxp3+调节性T细胞的数量及其功能基因Foxp3 mRNA的表达水平与SLE疾病活动性和肾脏损伤的相关性.方法 采用四色流式细胞术以Foxp3-异硫氰酸荧光素(FITC )/CD25-藻红蛋白/CD4-多甲藻叶绿素蛋白(PerCP)/CD3-藻蓝蛋白7抗体组合检测40名健康对照者及42例SLE患者外周血CD4+CD25highFoxp3+调节性T细胞的数量,实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测特异性转录因子Foxp3 mRNA的表达水平,并分析其与SLE患者疾病活动指数(SLEDAI)、补体C3及血清抗双链DNA(dsDNA)抗体的关系.统计学方法采用t检验和Spearman相关分析.结果 活动期SLE患者外周血CD4+CD25highFoxp3+调节性T细胞数量显著低于健康对照组[(4±3)％与(7±4)％,P＜0.05],稳定期与健康对照组差异无统计学意义(P＞0.05);活动期SLE患者外周血CD4+CD25highFoxp3+调节性T细胞数量及CD4+CD25highFoxp3+调节性T细胞/CD4+比值显著低于稳定期患者[(4±3)％,(9±6)％与(5±4)％,(10±6)％,P均＜0.05];活动期SLE患者外周血Foxp3 mRNA的表达水平明显低于稳定期和对照组(P＜0.01,P＜0.05);SLE患者并发肾病组外周血CD4+CD25highFoxp3+调节性T细胞数量及CD4+CD25highFoxp3+调节性T细胞/CD4+比值显著低于SLE非肾病组(P＜0.05).相关分析显示,SLE患者外周血CD4+CD25highFoxp3+调节性T细胞数量与SLEDAI呈负相关(r=-0.5782,P＜0.05);CD4+CD25highFoxp3+调节性T细胞/CD4+比值与SLEDAI呈负相关(r=-0.4913,P＜0.05),与补体C3呈正相关(r=0.3687,P＜0.05);SLE患者外周血CD4+CD25highFoxp3+调节性T细胞数量与Foxp3 mRNA的表达水平呈正相关(r=0.6142,P＜0.0l).结论 SLE患者外周血CD4+CD25highFoxp3+调节性T细胞和Foxp3 mRNA的变化可能是导致SLE疾病发生和发展的关键因素之一,与疾病的活动性有密切关系.     

CD4+白细胞介素-17+辅助性T细胞对香烟暴露小鼠肺部炎症及肺气肿的作用

目的 观察香烟烟雾暴露小鼠肺实质中CD4+白细胞介素(IL)-17+辅助性T细胞(Th17)数量及活性的表达,探讨其在香烟暴露小鼠肺部CD4+ γ-干扰素+(Th1)炎症及肺气肿中的作用及相关机制.方法 将40只雄性Balb/c小鼠按随机数字表法分为4组:对照12周(C12)组、对照24周(C24)组、烟雾暴露12周(S12)组、烟雾暴露24周(S24)组,每组10只.香烟烟雾暴露法建立小鼠肺气肿模型.HE染色观察小鼠肺气肿的改变,计算平均内衬间隔和肺泡破坏指数(DI);流式细胞术检测小鼠肺实质中CD4+IL-17+T(Th17)细胞、CD4+γ-干扰素+T(Th1)细胞、CD4+IL-17+γ-干扰素+T(Th17/Th1)细胞、CD8+γ-干扰素+T(Tc1)细胞、CD8+IL-21R+细胞及CD4+IL-17+IL-21+细胞比例;荧光定量PCR法检测小鼠肺实质中维甲酸相关孤独受体(RORγt)和IL-17的mRNA表达,并分析这些指标的相互关系.结果 S12组和S24组的平均内衬间隔[(39±4)μm和(47±7)μm]和DI(39.1±1.6和45.2±3.1)明显高于C12组[(32±4)μm和28.2±1.6]和C24组[(33±3)μm和28.9±2.1],且以S24组的增高更为明显,差异均有统计学意义(t值为4.378～15.188,均P＜0.05);S12组和S24组Th17细胞比例[(3.3±1.1)%和(7.2±2.2)%]均明显高于C12组和C24组[(1.8±0.8)%和(2.0±0.6)%];S12组和S24组RORγtmRNA表达量[(25±4)和(35±3)]及IL-17的mRNA表达量[(26±3)和(36±3)]亦明显高于C12组[(10±5)和(13±5)]和C24组[(11±7)和(8±6)],以S24组增高更为明显,差异均有统计学意义(P＜0.05);S12组和S24组Th1细胞比例[(10.0±3.7)%和(26.2 ±6.0)%]、Th17/Th1细胞比例[(0.61±0.30)%和(1.82±0.52)%]及Tc1细胞比例[(17.0±4.5)%和(26.8±8.5)%]均明显高于C12组[(3.8±1.7)%、(0.27±0.17)%和(4.8±1.9)%]和C24组[(4.2±1.3)%、(0.28±0.11)%和(5.2±1.0)%],以S24组增高更为明显,差异均有统计学意义(P＜0.05);S12组和S24组小鼠Th17细胞与Th1、Tc1细胞比例、平均内衬间隔、DI值均呈显著正相关(r值为0.519～0.797,均P＜0.01);Th17/Th1细胞比例与平均内衬间隔、DI值呈显著正相关(r值分别为0.742和0.802,均P＜0.01);S12组和S24组CD4+IL-17+IL-21+细胞比例[(0.19±0.04)和(0.55±0.24)]明显高于C12组和C24组[(0.07±0.03)和(0.08±0.03)],S24组增高更为明显,差异均有统计学意义(P＜0.05).S12组和S24组的CD8+IL-21R+细胞比例[(2.94±1.26)和(4.12±2.26)]高于C12组和C24组[(1.22±0.31)和(1.34±0.18)](P＞0.05);S12组及S24组小鼠CD4+IL-17+IL-21+细胞比例与Th1、Tc1细胞比例、平均内衬间隔和DI值均呈显著正相关(r值为0.694～0.754,均P＜0.05);S12及S24组小鼠CD8+IL-21R+细胞比例与平均内衬间隔和DI呈显著正相关(r值分别为0.516和0.725均P＜0.05).结论 香烟暴露导致肺气肿小鼠肺内Th17细胞数量及活性上调,并随烟雾暴露时间延长而增强;Th17细胞通过IL-21及IL-21R在肺部Th1/Tc1炎症中起重要促进作用;这对探讨COPD肺部炎症和肺气肿发生机制以及新的治疗靶点具有重要意义.

Abstract：

Objective To evaluate the expression and the role of Th 17 in cigarette smoke-induced lung inflammation and emphysema in mice.Methods Forty male BALB/c mice were randomly divided into 4 groups, including a control group C12, a control group C24, a smoke-exposure 12 week group (S12) and a smoke-exposure 24 week group S24 (n = 10 each).Morphological changes were evaluated by mean linear intercepts and destructive index (DI).The proportion of CD4+ IL-17 + Th17, CD4+ IFN-γ+ Th1, CD4+ IL-17 +IFN-γ+ T( Th17/ Th1 ), CD8+ IFN-γ+ Tc1, CD8+ IL-21R + and CD4+ IL-17 + IL-21 + T cells in lungs of mice was determined by flow cytometry.The mRNA expressions of RORγt and IL-17 were evaluated by real-time PCR.Results Mean linear intercepts and DI were significantly higher in S12 and S24 groups [(39 ± 4)μm, (47 ±7) μm], (39.1 ± 1.6, 45.2 ±3.1 ) as compared to C12[(32 ±4) μm,28.2 ± 1.6] and C24groups [(33 ± 3 ) μm ,28.9 ± 2.1], all P ＜ O.05.The percentage of Th17 of S12 and S24 groups [(3.3 ±1.1 )%, (7.2 ±2.2)%] was significantly increased as compared with that of C12 and C24 groups [( 1.8± 0.8) %, (2.0 ± 0.6) %], all P ＜ 0.05.The mRNA levels of RORγt [( 25 ± 4), ( 35 ± 3 )] and IL-17 [(26 ± 3), (36 ± 3 )] in S12 and S24 groups were higher than in C12 [(10 ± 5 ), (13 ± 5 )] and C24 groups [( 11 ± 7 ), (8 ± 6)], all P ＜ 0.05.The percentage of Th 1, Th17/Th1 and Tc1 cells of S12 and S24 groups [(10.0 ±3.7)%, (26.2 ±6.0)%], [(0.61 ±0.30)%, (1.82 ±0.52)%], [(17.0±4.5 ) %, ( 26.8 ± 8.5 ) %] was significantly increased as compared with that of C12 [( 3.8 ± 1.7 ) %,(0.27±0.17)%, (4.8 ±1.9)%] and C24 groups [(4.2±1.3)%, (0.28±0.11)%, (5.2±1.0)%], all P＜0.05.Moreover, the frequency of Th17 cells had a positive correlation with Th1, Tc1 cells and emphysematous lesions ( r =0.519 - 0.797, all P ＜ 0.01 ).In addition, a positive correlation between Th17/Th1 cells and emphysematous lesions was also found (r =0.742, 0.802, all P ＜0.01 ).The percentage of CD4+ IL-17+ IL-21 +T cells was significantly increased in S12 and S24 groups [(0.19 ±0.04) %, (0.55 ± 0.24) %] compared to controls [(0.07 ± 0.03 ) %, (0.08 ± 0.03 ) %], all P ＜ 0.05.Meanwhile, as compared with that of the controls [( 1.22 ± 0.31 ), ( 1.34 ± 0.18 )], the percentage of CD8+ IL-21 R + T cells was also increased in SI 2 and S24 groups [( 2.94 ± 1.26 ), (4.12 ± 2.26 )], but there were no differences among smoke-exposure groups ( P ＞0.05 ).The frequency of CD4+ IL-17 + IL-21 + T cells had a positive correlation with Th 1, Tc1 cells and emphysematous lesions (r = 0.694 -0.754, all P ＜0.05).And the frequency of CD8+ IL-21R+ T cells also had a positive correlation with emphysematous lesions ( r = 0.516, 0.725, all P ＜ 0.05).Conclusions Cigarette smoke increased the expression and the activity of Th17 in mice.Th17 may play a potential (active) role in the development of lung inflammation through IL-21/IL-21R pathway.     

含母牛分枝杆菌菌苗凝胶肺内应用的免疫效应研究

目的 观察含母牛分枝杆菌菌苗(微卡)凝胶在肺部介入应用后产生的局部及全身免疫应答效应.方法 60只日本长耳兔随机分成5组,每组12只.第1组为对照组,气管插管至末梢支气管注入生理盐水3 ml;第2组为单纯凝胶组,肺部注入卡波姆凝胶3 ml;第3、4、5组为微卡凝胶组,分别注入含3.75、7.50、9.37 mg/L母牛...     

加载野生型p53基因鼠树突细胞的抗肿瘤作用

目的 观察加载了野生型p53基因的树突细胞(DC)对不同位点p53基因突变肿瘤得庖咧瘟谱饔?方法通过锥虫蓝染色、同种异体混合白细胞反应及流式细胞仪检测DC细胞表面分子,评估腺病毒(Ad)-p53感染DC是否影响DC的免疫功能.以Ad或转导了野生型p53基因的Ad分别感染骨髓De(Ad-DC和Ad-p53-DC)后,静脉注射免疫C57BL/6小鼠各5只,分离脾细胞,采用标准6 h51 Cr释放试验测定其诱导不同肿瘤细胞系(MethA、D459和P815)细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的杀伤活性;效应细胞(Ad-p53-DC免疫后的小鼠脾细胞)和靶细胞(Ad-p53-P815和D459)孵育时分别加入抗CD4抗体或抗CD8抗体,观察CTL的活性变化.使用MethA和D459肿瘤细胞系得到不同的荷瘤鼠,于肿瘤形成前后分别使用Ad-p53-DC免疫,Ad-DC对照,当实体瘤三维直径之和＞20 cm时处死小鼠,用生存曲线评估Ad-p53-DC免疫的预防或治疗作用.结果 (1)Ad-p53-DC免疫诱导的抗Ad-p53-P815、D459和MethA的CTL反应(效应细胞:靶细胞=50:1)分别为(27.8±3.4)%、(23.5±2.7)%及(58.3±9.2)%,与Ad-DC免疫诱导的反应[(9.3±1.8)%、(4.6±1.0)%及(23.5 ±3.7)%]相比,差异有统计学意义(td值分别为5.79、3.68、5.02,均P＜0.05).Ad-p53-DC免疫小鼠T淋巴细胞与靶细胞Ad-p53-P815或D459的CTL活性,抗CD4组[(59.8 ±4.6)%、(18.9±2.4)%]与无抗体组[(64.4±6.3)%、(22.2±3.0)%]相比,差异无统计学意义(td值分别为0.84、0.91,均P＞0.05),而抗CD8组[(26.7±2.8)%、(6.1±1.2)%]差异有统计学意义(td值分别为9.03、7.67,均P＜0.05).抗CD8组与抗CD4组比较,差异有统计学意义(td值分别为8.79、9.18,均P＜0.05).(2)Ad-p53-DC和Ad-DC静脉注射2次免疫小鼠后,分别以D459细胞或MethA肉瘤细胞荷瘤20只小鼠.在Ad-p53-DC免疫组分别有14只和16只小鼠肿瘤的生长得到完全抑制,与Ad-DC免疫组比较差异有统计学意义(x2值分别为6.72、5.86,P＜0.05).皮下接种小鼠D459后,Ad-p53-DC免疫治疗组的小鼠肿瘤生长速度比Ad-DC组延缓2周左右,二组比较差异有统计学意义(x2 值为9.48,P＜0.05).结论 Ad-p53-DC可诱导抗MethA、P815和D459靶细胞的由CD8+T淋巴细胞介导的CTL反应,并抑制鼠体内肿瘤细胞的形成和生长.     

脂多糖对人外周血树突状细胞成熟的影响

目的 通过研究内毒素的不同作用方式,模拟慢性乙型肝炎肠源性内毒素血症,探讨脂多糖(LPS)对人外周血树突状细胞(DC)成熟的影响.方法 用重组人粒细胞集落刺激因子、重组人白细胞介素-4、酪氨酸激酶受体3配体和肿瘤坏死因子α体外诱导、培养人外周血单个核细胞.分为持续刺激组:于1、4、7、9 d加入LPS 1 μg/ml;短期刺激组:于7、8 d加入LPS 1 μg/ml;对照组:不加LPS.观察细胞形态,用流式细胞仪检测细胞表型,混合淋巴细胞反应检测DC刺激T淋巴细胞的能力,用酶联免疫吸附法检测DC分泌细胞因子的水平.组间比较采用SPSS10.0统计学软件进行单因素方差分析,进一步两两比较用SNK法.结果 DC表达人白细胞-DR抗原、CD86、CD80、CD83分子水平,持续刺激组分别为65.81%±10.96%、48.81%±18.13%、13.56%±5.48%、11.52%±5.09%,对照组分别为78.43%±20.34%、51.29%±15.75%、15.22%±5.53%、15.64%±5.26%,短期刺激组分别为89.83%±16.99%、69.90%±24.05%、25.97%±10.81%、25.96%±10.59%,持续刺激组DC表面分子表达水平低于短期刺激组和对照组,各组比较,F值分别为3.376、3.823、4.535、5.320,P值均＜0.05,差异均有统计学意义.3组DC诱导同种异体混合T淋巴细胞的增殖指数分别为1.593±0.303、1.949±0.240、1.548±0.365,各组比较,F=3.572,P=0.049,差异有统计学意义.3组DC表达干扰素γ水平短期刺激组为(40.52±11.38)pg/ml,高于对照组和持续刺激组[分别为(21.57±7.68)pg/ml、(15.6±5.83)pg/ml],各组比较,F=3.403,P=0.019,差异有统计学意义.3组DC表达白细胞介素12水平短期刺激组为(84.45±31.28)pg/ml,高于对照组和持续刺激组[分别为(54.42±20.34)pg/ml、(51.77±11.02)pg/ml],各组比较,F=2.212,P=0.088,差异有统计学意义.结论 LPS持续刺激可抑制DC的发育成熟,可能是肠源性内毒素血症患者细胞免疫功能低下的原因所在.