浙贝母ITS-PCR体系优化与不同产地样品序列差异研究

目的:优化浙贝母的ITS-PCR扩增体系,并对不同来源浙贝母品种的ITS序列进行差异分析。方法:浙贝母样品采用减压干燥法处理,以广谱植物基因组总DNA提取试剂盒提取浙贝母总DNA,对反应过程中的退火温度、Taq酶浓度、Mg~(2+)、dNTP浓度等因素进行考察。采用Conting Express和DNAman等分子生物学软件进行序列处理。结果:最优的浙贝母ITS-PCR扩增体系为:50μL反应体系中含Taq酶1 U,2.5 mmol/L Mg~(2+)、dNTP分别为4μL,退火温度为56℃。浙贝母的ITS序列全长668 bp,G+C含量为65.4%,不同产地浙贝母的ITS序列无差异。结论:所建立的体系可用以浙贝母ITS序列分析,为浙贝母的ITS序列研究奠定基础。ITS序列不适合作为浙贝母种间和产地间的鉴别工具。     

玉竹ISSR反应体系的优化

目的建立稳定性高、重复性好的适合玉竹ISSR-PCR扩增的反应体系。方法以玉竹根茎为材料,采用改良的CTAB法提取玉竹基因组DNA,并利用单因素多水平试验,分别对模板DNA、引物、Mg2 、Taq酶、dNTP的浓度和退火温度进行考察。结果玉竹的最佳反应体系为:在20μL的反应体系中,含1×buffer、15 ng模板DNA、0.4μmol/L引物、2 mmol/L Mg2 、1.0 U Taq酶、200μmol/L dNTP。此反应体系以52℃的退火温度扩增出来的玉竹电泳图谱清晰,重复性好。结论本实验反应体系适宜于玉竹ISSR-PCR的扩增,为玉竹下一步分子生物学的研究打下基础。     

红树植物秋茄ISSR条件的优化

目的:探讨红树植物秋茄简单序列重复区间扩增多态性分子标记(ISSR-PCR)分析的最优条件,以获得清晰、重复性好的简单序列重复区间扩增多态性(ISSR)扩增结果。方法:对ISSR-PCR多个条件中的单个条件包括DNA的提取、模板浓度、Taq酶的选择与用量、Mg2+和三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTP)浓度等进行了比较、优化。结果:从单条件中得出每个条件的最优条件,从而获得清晰、重复性高的电泳图谱。结论:秋茄ISSR-PCR分析最适宜的扩增条件为:25μL PCR反应体积中,0.75～1.0 U Taq DNA聚合酶,0.8μmol/L引物,0.2 mmol/L dNTP,2.0～2.5 mmol/L MgCl2,40 ng/μL模板DNA。     

金钗石斛遗传多样性研究的ISSR-PCR反应体系建立与优化

目的：对影响金钗石斛ISSR-PCR扩增效果的一些因素进行优化,为进一步研究其遗传多样性奠定基础。方法：通过筛选引物并设定影响金钗石斛ISSR反应诸因子的不同浓度,检测ISSR不同反应体系的扩增效果;通过分析非特异性条带的产生原因并进行条件优化,建立金钗石斛ISSR稳定可靠的反应体系。结果：金钗石斛较适宜的ISSR-PCR反应条件为：10 lμPCR反应体系,含5～15 ng模板DNA、2.0 mmol/L Mg^2＋、0.20 mmol/L dNTP、0.6～0.75 U Taq DNA聚合酶、1.0μmol/L引物。较适宜的退火温度为46～62℃。结论：Taq酶质量、DNA模板品质、退火温度等对ISSR反应结果具有较大影响。所建立的金钗石斛ISSR反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、检测多态性能力较强、重复性好等特点,可用于金钗石斛的遗传多样性研究。     

PCR-RFLP方法检测锰超氧化物歧化酶基因V（16）A多态性的实验条件研究（摘要）

目的为确定PCR-RFLP技术检测锰超氧化物歧化酶基因（MnSOD）V（16）A多态性的最适实验条件,对影响PCR的主要因素进行了研究.结果最适变性温度为95℃;最适退火温度为55℃；最适引物浓度为0．25μmol／L；最适Mg^2＋浓度为1．5mmol／L；最适dNTP浓度为0．20mmol／L；最适反应体系为25μL，以0．6U为最适Taq酶量．酶切体系为15μL体系中加8μL产物用2U的酶消化．为后续研究奠定了实验基础．     

夏枯草ISSR分子标记技术的建立与体系优化

目的 建立并优化夏枯草ISSR-PCR反应体系和扩增程序,为探讨夏枯草种质间遗传多样性奠定基础。方法 采用单因子试验和正交设计方法,研究Mg2+、dNTP、引物、 Taq DNA聚合酶、模板DNA、退火温度及循环次数对PCR扩增的影响。结果 夏枯草ISSR-PCR的最佳反应体系为：在20 μL的反应体系中含模板DNA 30 ng,Mg2+2.2 mmol/L、dNTP 175 μmol/L、引物0.75 μmol/L、Taq DNA聚合酶1.0 U。在此基础上,从92条引物中筛选出18条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并通过梯度PCR试验,确定引物最佳退火温度。结论 采用单因子试验和正交设计方法可以快速建立ISSR-PCR反应体系,经过24份夏枯草种质检验,证明该体系稳定可靠,可用于夏枯草遗传分析。     

PCR-RFLP方法检测CCR5基因启动子区59029G/A多态性的实验研究

目的：确定PCR-RFLP技术检测CCR5基因启动子区59029G／A多态性的最适实验条件．方法：对主要影响因素设系列浓度梯度分别进行PCR后观察电泳结果。结果：最适变性温度为94℃；最适退火温度为60℃；最适引物浓度为0．4μmol／L；最适Mg^2＋浓度为1．5mmol／L；最适dNTP浓度为0．20mmol／L；以1．0U为最适Taq酶量．结论：酶切体系为20μL体系中加5μL产物用4U的酶消化，为后续研究奠定了实验基础．     

PCR-RFLP技术检测SUMO4基因163A/G多态性的实验条件研究

目的确定PCR-RFLP技术检测小泛素样修饰蛋白4（SUMO4）163A/G多态性的最适实验条件.方法对影响SUMO4基因PCR反应的主要因素设定系列浓度梯度分别进行研究.结果最适变性温度为94℃;最适退火温度为55℃;最适引物浓度为0.25μmol/L;最适Mg2＋浓度为1.5mmol/L;最适dNTP浓度为0.25mmol/L;以2.5U为最适Taq酶量;酶切体系为31μL体系中加10μL产物用10U的酶消化.结论最佳实验条件的摸索是进行糖尿病实验研究的关键.     

正交设计优化HBV基因分型PCR反应体系的研究

目的:探索HBV基因分型PCR反应体系的优化方法。方法:利用正交设计,从Taq DNA聚合酶、模板DNA、dNTP、引物、Mg~(2+)5种因素,对HBV基因分型PCR反应体系进行优化分析。结果:各因素的不同组合对PCR结果有显著影响,本实验仅用16次试验就得到了可很好进行PCR扩增的几种不同的条件组合。结论:正交设计是一种切实可行、快速、经济的PCR反应体系优化方法。     

PCR-RLFP方法检测IL-6基因启动子区-634C/G多态性的实验条件研究

目的探讨PCR-RFLP技术判断IL-6基因启动子区-634C/G多态性的最适实验条件.方法对影响PCR的部分因素和影响RFLP方法的一些因素进行研究.结果PCR扩增IL-6基因启动子区的最适条件为:引物浓度为0.2μmol/L;Taq酶量为1.5 U;dNTP浓度为120μmol/L;Mg2 浓度为2.0 mmol/L.最经济有效的酶切体系为20μL体系中加4μL产物用2.5 U的酶消化9 h以上.结论最佳实验条件的探索是进行大批量实验研究的关键.     

白芨ISSR-PCR反应体系的建立及优化

目的：建立并优化白芨ISSR-PCR反应体系,为白芨种质资源分子评价奠定技术基础.方法：应用单因素和正交试验研究ISSR-PCR反应体系中模板DNA、Mg2、引物、dNTP、BSA及Taq DNA聚合酶等6个主要成分对扩增结果的影响,优化出ISSR-PCR最佳反应体系.结果：优化后25 μL反应体系中含100 ng DNA模板、2.0 mmol/L Mg2＋、2.5 μmol/L引物、0.2 mmol/L dNTP浓度、3.75 g/L BSA及1.25 UTaq DNA聚合酶.结论：建立了适用于白芨的ISSR-PCR最佳反应体系.     

国外实验动物信息资源网站

目的建立实验兔随机扩增多态DNA（RAPD）的最优反应体系,并对RAPD引物进行筛选优化。方法以白毛黑眼（WHBE）兔,日本大耳白（JW）兔,新西兰（NZW）兔为实验材料,对影响RAPD反应的各因素进行优化,摸索出最佳的Mg^2＋,dNTP,Taq酶,引物和DNA模板的浓度,并从60个随机引物中筛选出适合实验兔RAPD反应的引物。结果最优RAPD—PCR反应体系为：在20山的反应体系中,Mg^2＋1．5mmol／L,dNTP0．25mmol／L,Taq酶1．25U,引物5μmol／L,模板DNA40ng。60个RAPD引物中剔除了重复性差,条带模糊的引物后,有25个引物稳定,扩增出来的条带清晰、多态性高。结论本研究筛选出的25个引物和建立的PCR体系可应用于实验兔的RAPD反应。     

四引物扩增受阻突变体系聚合酶链反应在SNP基因分型中的研究

目的 探讨四引物扩增受阻突变体系聚合酶链反应(tetra-primer amplification refractory mutation system-potymerase chain reaction,tetra-primer ARMS-PCR)在SNP基因分型中的应用. 方法 利用人EXO1基因第10外显子CA9T单核苷酸多态性为研究对象,以tetra-primer ARMS-PCR的原理设计四种引物进行扩增,从而对Mg2 浓度、dN浓度、Taq酶用量及内外引物浓度比例4个因素进行优化. 结果 当反应体系的退火温度为51℃,Mg2 浓度、dNTP浓度分别为2.0 nanol/L、0.1 mmol/L,Taq酶用量为0.5 U,内/外引物浓度为1/0.2μmol/L时,tetra-primer ARMS-PCR应用于该SNP位点的基因分型结果最佳. 结论 四引物扩增受阻突变体系聚合酶链反应是SNP基因分型的一种可行方法,但在应用时需对反应条件进行必要的优化.     

黄花蒿ISSR-PCR反应体系的优化

目的:建立黄花蒿(Artemisia annuaL.)的ISSR最佳反应体系及PCR扩增参数,为今后利用ISSR标记技术开展黄花蒿种间遗传多样性分析提供一个标准化程序。方法:以黄花蒿DNA为材料,分析了ISSR反应体系中的DNA、Mg2 、dNTPs浓度,TaqDNA聚合酶用量以及退火温度对ISSR-PCR扩增的影响。结果:建立了重复性好,分辨率高的ISSR反应体系,即在25μL反应体系中,模板DNA浓度为15~45 ng,2.5μL的10倍Buffer(Mg2 free)缓冲液,MgCl22.0 mmol/L,dNTPs为0.15 mmol/L,Taq酶1.0 U,引物1.0μmol/L;扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,引物在筛选后的最佳退火温度退火45 s,72℃延伸2 min,共计40个循环,循环结束后在72℃延伸5 min。结论:建立了适用于黄花蒿的ISSR反应体系,为今后利用ISSR标记技术开展黄花蒿种间遗传变异分析和构建遗传图谱奠定了基础。     

单细胞二重巢式PCR扩增影响因素初探

目的: 对影响单细胞二重巢式PCR扩增的因素进行初步探讨.方法:针对β-珠蛋白基因CD41-42、IVS-Ⅱ654突变位点区域采用二重巢式PCR,分别以不同的引物浓度组合、不同的Taq DNA聚合酶、不同的中和缓冲液、PCR反应前采用或不采用98 ℃预变性扩增单个淋巴细胞和/或单卵裂球,了解这些因素对PCR扩增效率的影响.结果: 不同的引物浓度组中,终浓度为0.25 μmol/L R1 F1引物对与 0.3 μmol/L R2 F2引物对配对扩增效率最高;不同的Taq DNA聚合酶中TaKaRa EX Taq的扩增效率最高;中和缓冲液-1(200 mmol/L Tricine)的扩增效率显著高于中和缓冲液-2(900 mmol/L Tris·HCl, pH 8.3/300 mmol/L KCl/200 mmol/L HCl)的扩增效率(P<0.05);单细胞PCR反应前采用98 ℃预变性与不采用98 ℃预变性的扩增效率间差异无统计学意义.结论:不同引物浓度组合、不同的Taq DNA聚合酶、不同的中和缓冲液对单细胞的二重巢式PCR的扩增效率存在明显差异,而PCR反应前采用98 ℃预变性不能提高PCR扩增效率.     

PCR扩增肺癌组织puma基因第四外显子的实验研究

目的探讨PCR扩增肺癌组织中puma基因第四外显子（GC含量76．44％）的最适实验条件．方法通过改变PCR反应体系各组分的浓度和反应条件,探讨PCR反应体系最适浓度和反应条件．结果PCR反应体系为dNTP200μmol／L,普通MgCl2 1．0mmol／L,引物500nmol／L,TaqDNA聚合酶0．1U／μL,模板量不低于4000ng,普通10×扩增体系缓冲液5μL,总体积50μL.反应条件为94℃预变性5min,94℃ 45s、61℃ 45s、72℃ 45s循环33次,最后72℃延伸5min．结论确立了puma基因第四外显子的PCR扩增条件,为后续的突变研究奠定了基础．     

两面针ISSR-PCR反应体系的建立及优化

【目的】建立适合两面针简单重复序列—聚合酶链反应(ISSR-PCR)体系和扩增程序。【方法】采用改良的高盐低pH法提取两面针基因组DNA,通过单因素试验和正交试验相结合对ISSR反应体系中的主要成分(Mg2+、Taq DNA聚合酶、引物和模板)进行筛选和优化,并考察退火温度对扩增结果的影响。【结果】最佳的PCR反应体系为:总体积为25μL,含1.50 mmol/L Mg2+、150μmol/L dNTPs、0.04 U/μL Taq DNA聚合酶、0.60μmol/L引物、2.40 ng/μL DNA模板。扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,51.4℃退火45 s,72℃延伸2 min;35个循环;72℃再延伸10 min。【结论】优化了两面针ISSR-PCR反应体系和扩增程序,为两面针ISSR遗传多样性分析打下基础。     

胡黄连SRAP反应体系的建立与引物筛选

目的:建立胡黄连SRAP的反应体系,并筛选出适合胡黄连的引物组合,为胡黄连的遗传多样性研究奠定基础.方法:采用5因素(dNTP、Mg2+、Taq酶、引物、DNA)4水平正交试验一步法建立SRAP -PCR的反应体系,采用梯度温度法筛选PCR反应程序的最佳退火温度,对已发表的SRAP引物组合进行了筛选.结果:胡黄连SRAP - PCR的最佳反应体系,即20μL反应体系:10×buffer 2μL,dNTP 150μmol·L-1,Mg23 mmol·L-1,Taq酶2U,引物为0.5μmol·L-1,DNA为20ng,DMSO 1μL;最适的退火温度是30.0℃～33.2℃:最适的引物组合为Me1Em1,Me1Em2,Me1Em3,Me3Em3,Me1Em4,Me2Em4,Me3Em4,Me4Em4,Me1Em5,Me3Em5,Me4Em5,Me3Em6,Me4Em6.结论:该体系是适合胡黄连SRAP - PCR反应的最适宜体系,为今后胡黄连遗传多样性研究奠定了基础.