丙型肝炎病毒核心蛋白对低氧诱导因子-1α和血管内皮生长因子表达的影响

目的 探讨HCV核心蛋白对低氧诱导因子1 α(HIF-1 α)和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响. 方法 将HCV核心蛋白基因的真核表达载体flag2B-core和HIF-1 αsiRNA转染Huh7.5.1细胞;采用RT-PCR和Western blot法分别检测HIF-1 α、VEGF在mRNA和蛋白水平的表达变化,采用酶联免疫吸附试验检测细胞上清液中VEGF的含量.对各组间数据进行t检验.结果 Huh7.5.1细胞转染flag2B-core后,HIF-1 α和VEGF的mRNA和蛋白表达水平升高,细胞上清液中VEGF含量明显高于对照组[(654.5±43.7) pg/ml与(365.9±26.8)pg/ml,t=653.1％,P＜ 0.01)];Huh7.5.1细胞共转染flag2B-core和HIF-1 α siRNA后,HIF-1 α和VEGF的mRNA和蛋白表达水平降低,细胞上清液VEGF含量明显低于对照组[(389.2±29.6) pg/ml与(768.8±47.3) pg/ml,t=1330.22,P＜0.01).结论 HCV核心蛋白能够上调HIF-1 α和VEGF的表达;HCV可能通过核心蛋白来调节HIF-1 α和VEGF的表达.     

HCV NS2对细胞凋亡及DNA损伤应答信号的影响

目的构建HCV NS2的真核表达质粒,了解HCV NS2蛋白对细胞凋亡及DNA损伤应答信号的影响。方法以pCMV-tag2B为载体,采用双酶切法构建HCV NS2基因重组载体pCMV-tag2B-NS2,进行酶切分析和DNA测序鉴定;在Huh7细胞中转染相应质粒,分别采用Western blot和DAPI染色分析CPT处理或未处理时NS2对DNA损伤应答信号和凋亡的影响,采用流式细胞术检测NS2蛋白对细胞周期的影响。结果酶切和DNA测序证实pCMVtag2B-NS2重组质粒构建成功,HCV NS2蛋白可在Huh7细胞中正确表达并且活化DNA损伤应答信号,但不影响细胞周期进程;DAPI染色检查,NS2转染组和空载体转染组细胞凋亡率分别为(15.33±0.88)%和(4.66±0.88)%,差异有统计学意义(P0.05)。结论成功构建了真核表达载体pCMV-tag2B-NS2,其表达产物HCV NS2蛋白可诱导DNA损伤应答通路的活化并且促进Huh7细胞凋亡。     

生长抑制和DNA损伤诱导基因45β在足细胞损伤中的作用及机制

目的:研究生长抑制和DNA损伤诱导基因45β(GADD45B)在足细胞损伤中的作用及机制。方法:微分离37例肾活检证实的局灶节段性肾小球硬化(FSGS)患者肾小球,qRT-PCR检测肾小球GADD45B基因表达,同时进行免疫组化检测GADD45B蛋白表达。进一步利用模式动物斑马鱼研究GADD45B基因功能,Podocin启动子驱动和UAS/GAL4系统构建足细胞上特异性表达GADD45B转基因斑马鱼,硝基还原酶/甲硝唑(NTR/MTZ)系统特异性诱导足细胞损伤,观察斑马鱼水肿发生率,定量检测蛋白尿及足细胞凋亡。结果:FSGS患者肾小球GADD45B基因和蛋白表达水平显著高于正常对照组,并与FSGS患者白尿、血白蛋白及血肌酐水平密切相关;斑马鱼研究结果显示,足细胞上高表达GADD45B能够显著加重MTZ诱导的足细胞损伤,GADD45Ba/b转基因鱼的水肿发生率和蛋白尿水平均显著高于野生型斑马鱼。活性caspase染色结果显示,GADD45B转基因鱼发生凋亡的足细胞数显著高于非转基因鱼。吗啉环寡聚核苷酸注射斑马鱼抑制GADD45B基因表达,则MTZ诱导的斑马鱼水肿发生率和蛋白尿水平显著降低。结论:高表达GADD45B显著加重足细胞受损,而抑制GADD45表达则能有效改善足细胞损伤,提示其可作为治疗足细胞损伤药物靶点。     

丙型肝炎病毒感染促进53BP1蛋白通过泛素-蛋白酶体途径降解的研究

目的 探讨丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)对53BP1表达的影响及机制。方法 建立HCV体外感染Huh7细胞模型,采用Western blot检测HCV感染对53BP1总蛋白、胞浆和胞核蛋白表达的影响,qPCR检测53BP1的mRNA表达,采用免疫荧光(Immunofluorescence, IF)方法检测HCV感染对53BP1亚细胞定位的影响;采用免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)法定量检测HCV相关肝癌中53BP1蛋白的表达,并与癌旁组织及正常肝脏相比较;采用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation, CO-IP)方法检测HCV对53BP1蛋白泛素化水平的影响。结果 HCV感染导致Huh7细胞53BP1蛋白的相对表达水平为(0.41±0.03),明显低于对照组(1.00±0.08),差异有统计学意义(P<0.01);在HCV感染后,胞核53BP1蛋白相对表达水平为(0.35±0.03),明显低于对照组(1.00±0.09),差异有统计学意义(P<0.01);而胞浆53BP1相对表达水平为(1.2...     

丙型肝炎病毒感染促进53BP1蛋白通过泛素-蛋白酶体途径降解的研究北大核心CSCD

目的探讨丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)对53BP1表达的影响及机制。方法建立HCV体外感染Huh7细胞模型,采用Western blot检测HCV感染对53BP1总蛋白、胞浆和胞核蛋白表达的影响,qPCR检测53BP1的mRNA表达,采用免疫荧光(Immunofluorescence,IF)方法检测HCV感染对53BP1亚细胞定位的影响;采用免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)法定量检测HCV相关肝癌中53BP1蛋白的表达,并与癌旁组织及正常肝脏相比较;采用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,CO-IP)方法检测HCV对53BP1蛋白泛素化水平的影响。结果HCV感染导致Huh7细胞53BP1蛋白的相对表达水平为(0.41±0.03),明显低于对照组(1.00±0.08),差异有统计学意义(P<0.01);在HCV感染后,胞核53BP1蛋白相对表达水平为(0.35±0.03),明显低于对照组(1.00±0.09),差异有统计学意义(P<0.01);而胞浆53BP1相对表达水平为(1.20±0.18),对照组相对表达水平为(1.00±0.17),两者表达无显著改变(P>0.05);HCV感染可导致53BP1蛋白,尤其是胞核53BP1蛋白的表达下降。免疫荧光结果显示HCV感染导致53BP1从胞核到胞浆的亚细胞定位改变;免疫组化结果显示,与正常肝脏相比,53BP1在HCV相关HCC的癌组织(P<0.01)和癌旁组织(P<0.05)中显著降低。机制分析表明HCV感染促进53BP1的泛素-蛋白酶体途径降解。结论HCV感染可致Huh7细胞53BP1发生由细胞核到细胞质的定位改变,并促进其通过泛素-蛋白酶体途径降解。     

生长抑制DNA损伤基因45的功能及其作用

许多内源性和外源性的损伤因素均能导致DNA损伤,如活性氧、紫外线辐射、电离辐射、化学致癌药物及烷化剂等.哺乳动物细胞对于致DNA损伤因素的各种刺激会产生一系列应答反应,如细胞周期抑制、DNA修复、DNA去甲基化、细胞生存和细胞凋亡等.生长抑制DNA损伤基因45(Gadd45)在DNA损伤诱导的细胞应答反应中发挥重要作用.细胞内、外环境的多种因素在转录水平、翻译后水平等多个层次对Gadd45进行精确调节.Gadd45家族蛋白与年龄相关疾病、寿命及老化相关.     

生长阻滞和DNA损伤诱导基因153在慢性缺氧诱导心肌细胞凋亡中的表达

目的研究慢性缺氧诱导心肌细胞发生凋亡的情况,探讨生长阻滞和DNA损伤诱导基因(CHOP/GADD153)蛋白表达变化与心肌细胞凋亡的关系。方法将体外培养的心肌细胞置于95%N_2/5%CO_2混合气体培养箱内进行慢性缺氧处理,随机将心肌细胞分为对照组及缺氧6、12、24、48、72 h组。采用流式细胞术及DNA梯度技术检测心肌细胞凋亡情况.RT-PCR检测CHOP/GAD153 mRNA水平变化,western blot检测细胞凋亡过程中CHOP/GADD153蛋白表达变化。结果缺氧6 h组心肌细胞出现典型的凋亡特征;与对照组比较,缺氧12、24、48、72 h组心肌细胞凋亡数量明显增多(P<0.05):CHOP/GADD153 mRNA和蛋白表达水平也明显增加(P<0.05)。结论慢性缺氧可诱导心肌细胞发生凋亡,CHOP/GADD153可能参与了慢性缺氧诱导心肌细胞凋亡的信号传导通路。     

乙酰紫草素对HCV复制的影响及其作用机制研究

目的探讨乙酰紫草素对HCV复制的影响及其作用机制。方法 (1)体外培养Huh7细胞,用不同浓度乙酰紫草素溶液与Huh7细胞进行共同培养,采用MTS法检测细胞的相对活力,观察乙酰紫草素对Huh7细胞的毒性作用。(2)采用JFH-1毒株感染Huh7细胞后,用不同浓度(0、0. 1、0. 2、0. 4、0. 8μM)的乙酰紫草素溶液进行处理,检测HCV RNA以及HCV core蛋白的表达水平,观察乙酰紫草素对Huh7细胞中HCV JFH-1复制的影响。(3)取JFH-1感染的Huh7细胞分为HCV组和HCV+乙酰紫草素组,HCV+乙酰紫草素组用0. 8μM乙酰紫草素处理,HCV组不处理;取未感染JFH-1的Huh7细胞,分为乙酰紫草素组和对照组,乙酰紫草素组用0. 8μM乙酰紫草素处理,对照组不处理。通过检测LC3 mRNA以及LC3B蛋白的表达水平,观察乙酰紫草素对细胞自噬标志因子LC3表达的影响。结果 (1)乙酰紫草素浓度在1. 0μM或更低时对Huh7细胞生长影响很小或没有影响,在2. 50μM以上时表现出明显的细胞毒性作用。(2)不同浓度乙酰紫草素(0. 1、0. 2、0. 4、0. 8μM)处理组细胞内HCV RNA水平均显著低于未用乙酰紫草素处理组,差异有统计学意义(P 0. 05),HCV core蛋白的表达量均显著低于未用乙酰紫草素处理组。(3)在基因水平上,LC3 mRNA的表达水平表现为HCV组对照组 HCV+乙酰紫草素组乙酰紫草素组,差异有统计学意义(P 0. 05);在蛋白水平上,LC3B蛋白的表达水平表现为HCV组对照组 HCV+乙酰紫草素组乙酰紫草素组。结论乙酰紫草素可以抑制HCV复制,同时下调自噬标志因子LC3的表达,可通过调节细胞自噬途径影响HCV病毒的复制。     

抑制素对HCV复制的影响

目的研究抑制素(PHB)对HCV复制的影响。方法全长基因组HCV RNA体外转染人肝癌细胞系Huh7.5,构建HCV全基因组细胞模型,分别收集24、48、72、96 h培养上清液检测HCV拷贝数;间接免疫荧光实验检测HCV核心蛋白的表达;透射电镜观察HCV感染细胞Huh 7.5-HCV的超微结构改变,鉴定HCV全基因组细胞模型。采用实时定量PCR、Western Blotting方法研究PHB在Huh 7.5-HCV细胞中的表达情况。应用RNA干扰技术检测PHB对HCV RNA的复制情况。两组间比较采用t检验。结果鉴定结果显示,成功构建HCV全基因组细胞模型。HCV RNA转染Huh7.5细胞24和48 h后,PHB mRNA表达水平分别是13.41±1.35和16.45±1.76,与对照组(1.01±0.57和1.01±0.87)相比差异均有统计学意义(t值分别为29.540、31.361,P值均0.01);PHB蛋白表达水平亦显著高于对照组(P值均0.01)。PHB的RNA干扰质粒(shRNA-PHB)转染Huh7.5-HCV细胞24和48h后,HCV RNA的水平分别为64.32±5.49和84.45±7.06,显著高于对照组(shRNA-control组,10.52±1.57和16.34±2.97,t值分别为29.538、25.908,P值均0.01)。结论 Huh7.5-HCV细胞中PHB表达的升高可能与HCV RNA的感染有关,PHB蛋白对HCV RNA复制有一定的抑制作用。     

幽门螺杆菌对胃黏膜细胞DNA依赖蛋白激酶催化亚单位和Ku70/Ku80二聚体蛋白体内外表达的影响

目的 探讨H.pylori对胃黏膜细胞DNA依赖蛋白激酶催化亚单位(DNA-PKcs)和Ku70/Ku80二聚体在体内外表达的影响.方法 应用Western印迹法检测H.pylori作用后1、3、6、12和24 h的胃黏膜上皮细胞(GES-1)和胃腺癌细胞(AGS)中DNA-PKcs和Ku70/Ku80二聚体的蛋白表达情况.采用H.pylori灌胃蒙古沙鼠,于感染第6和12个月处死动物,取胃黏膜组织行免疫组织化学染色,检测DNA-PKcs和Ku70/Ku80二聚体的蛋白表达情况.采用t检验和卡方检验进行统计学分析.结果 H.pylori作用后1h,DNA-PKcs蛋白在GES-1中的相对表达量为1.16±0.09,高于未感染H.pylori组的1.04±0.31,差异有统计学意义(t=4.67,P＜0.05).H.pylori作用后1、3、6、12和24 h,Ku70/Ku80二聚体蛋白在GES-1中的相对表达量分别为1.58±0.32、1.84±0.40、1.97±0.35、3.72±1.42和3.74±1.56,均高于未感染H.pylori组的1.24±0.31,差异均有统计学意义(t=3.57、4.20、5.03、8.11、8.14,P均＜0.05);Ku70/Ku80二聚体蛋白在AGS中的相对表达量分别为4.69±0.87、3.67±0.67、2.41±0.24、1.35±0.35和1.32±0.10,均低于未感染H.pylori组的4.84±0.76,差异均有统计学意义(t=34.13、27.68、19.81、4.47、5.69,P均＜0.05).蒙古沙鼠模型中,DNA PKcs蛋白在未感染H.pylori组不表达(0/25),在感染H.pylori组中的总阳性率为98.1％(53/54),两组差异有统计学意义(x2=74.55,P＜0.01);Ku70/Ku80二聚体蛋白在未感染H.pylori组中的总阳性率为92.0％(23/25),在感染H.pylori组中的总阳性率为68.5％(37/54),两组差异有统计学意义(x2=5.16,P＜0.05).结论 H.pylori感染在体内外能通过改变胃黏膜DNA PKcs和Ku70/Ku80二聚体蛋白的表达水平,影响细胞DNA损伤修复,导致胃黏膜病变.     

乙型肝炎病毒X蛋白及其截短体与损伤DNA结合蛋白1在HBV复制中的作用

目的 探讨乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)及其两个截短体(HBx1 ～ 101、HBx43～ 154)与损伤DNA结合蛋白(DDB)1在HBV复制中的作用.方法 用质粒瞬时转染HepG2细胞,72 h后分别提取细胞总蛋白质和总RNA,通过Western blot分析验证DDB1蛋白表达,逆转录实时定量PCR在基因的mRNA水平观察HBx蛋白及其截短体对DDB1蛋白表达的影响.提取转染72 h后细胞胞质DNA,收集细胞的培养上清液,通过实时定量PCR及酶联免疫吸附试验检测各组细胞胞质HBV DNA复制及培养上清液中病毒标志物HBsAg、HBeAg表达水平,从而观察HBx蛋白及其两个截短体与DDB1对HBV复制的影响.对数据进行单因素方差分析及t检验.结果 在有HBV复制的HepG2细胞中,缺失HBx转染组细胞中DDB1蛋白在mRNA水平明显下降(相对表达水平为野生型转染组的52.74％±8.95％,t=9.143,P＜0.05),胞质DNA的复制及培养上清液中病毒标志物HBsAg、HBeAg表达水平也明显下降(相对表达水平分别为野生型转染组的55.49％±1.19％、48.05％±2.90％、46.22％±2.20％,P值均＜0.05).共转染HBx N-端截短体HBx43～54后细胞中DDB1蛋白mRNA水平恢复到野生型水平,且能使缺失HBx蛋白的HepG2细胞中胞质HBV DNA的复制及培养上清液中病毒标志物HBsAg、HBeAg的表达恢复到野生型水平.但共转染HBx C-端截短体HBx1 ～ 101的细胞中DDB1蛋白在mRNA水平较野生组明显下降(相对表达水平为野生型转染组的59.95％±9.09％,t=7.629,P＜0.05),且不能使转染缺失HBx蛋白的HepG2细胞中胞质HBVDNA的复制及培养上清液中病毒标志物HBsAg、HBeAg的表达恢复到野生型水平(相对表达水平分别为野生型转染组的62.53％±0.67％、63.13％±2.14％、55.40％±0.99％,P值均＜0.05).并且各转染组DDB1蛋白mRNA水平变化与胞质HBV DNA复制和培养上清液中病毒标志物HBsAg、HBeAg表达水平是一致的.结论 C-端53个氨基酸及DDB1蛋白对于HBV野生型水平的复制是需要的,而N-端42个氨基酸对于HBV复制水平无明显影响.C-端53个氨基酸对HBV复制的影响作用可能是通过影响DDB1蛋白水平实现的.     

La、hVAP-33、eIF2B γ和HCV IRES特异性小干扰RNA抑制HCV的复制和表达

目的 证实La自身抗原、33kD人类囊相关膜蛋白(hVAP-33)和真核细胞翻译起始因子第3亚单位(eIF2B γ)是HCV在细胞内的协同感染因子,通过抑制Huh7细胞内这些因子的表达可抑制HCV复制和表达. 方法 分别设计合成3条HCV内部核糖体进入位点(IRES)的小干扰RNA(siRNAs),转染Huh7-HCV细胞后筛选出其中沉默效率最高的1条.以HCV假病毒感染Huh7细胞后48 h,分别以上述HCV IRES siRNA和之前试验中已经筛选出的La、hVAP-33和eIF2B γ特异性siRNAs单独或者不同组合转染Huh7-HCV细胞,利用荧光定量PCR方法检测HCV核心基因并计算△△CT值(相对定量法),比较不同siRNAs及组合对目的基因沉默的效率;同时以Western blot观察HCV核心蛋白表达量的差异.结果 La自身抗原与IRES特异性siRNA共转染对HCV表达的抑制效率最高,使HCV核心蛋白基因相对表达量下降了约41％;4种基因特异性siRNAs 对HCV在Huh7细胞中的复制和表达均有不同程度的抑制作用,La、hVAP-33和eIF2Bγ特异性siRNAs分别与IRES siRNA联合均较其单独转染对目的基因的抑制效率高.结论 可以认为La自身抗原、hVAP-33和eIF2Bγ是HCV在宿主细胞内的协同感染因子,通过对Huh7细胞内协同感染因子及HCV IRES基因沉默后可以显著减少HCV的表达.     

XPD对SMMC-7721肝癌细胞中DNp73和GADD45β的调控及意义

目的:观察人剪切修复基因人类着色性干皮病D组基因(xeroderma pigmentosum group D,XPD)转染至人肝癌细胞株SMMC-7721细胞后XPD、DNp73和GADD45β基因的表达变化以及对肝癌细胞生长的影响.方法:实验分4组:重组质粒SMMC-7721-pEGFP-N2-XPD(XPD组)、空载质粒SMMC-7721-pEGFP-N2组(N2组),脂质体组和SMMC-7721细胞空白对照组.应用Lipofectamine2000脂质体瞬时转染,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹(Western blot)法检测转XPD基因后,人肝癌细胞株SMMC-7721细胞中DNp73以及GADD45β的mRNA和蛋白质的表达量变化,并用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖的活力,流式细胞仪检测细胞凋亡的变化.结果:荧光显微镜下,XPD组和N2组细胞中观察到绿色荧光蛋白表达,说明转染成功;RT-PCR检测显示:XPD组中DNp73 mRNA相对表达量较其他3组显著下调,XPD和GADD45βmRNA相对表达量较其他3组明显上调(均P<0.01);Western blot检测显示:XPD、DNp73以及GADD45β蛋白相对表达量在各组间的差异与其mRNA各组间差异一致;MTT检测示:SMMC-7721细胞空白对照组、脂质体组、N2组、XPD组的吸光度(A)值分别为0.633±0.012,0.623±0.009,0.628±0.016,0.384±0.011,XPD组低于其他3组,差异均有统计学意义(均P<0.01),表明转染XPD后SMMC-7721细胞的增殖能力减弱.流式细胞仪检测SMMC-7721肝癌细胞凋亡:转染XPD的SMMC-7721细胞凋亡显著,凋亡率达56.53%,而其他3组均未见明显凋亡.结论:XPD基因在肝癌的发生发展中起抑制作用,癌基因DNp73的表达随XPD表达增加而降低,抑癌基因GADD45β则随XPD表达增加而增加,提示两者可能在XPD抑制肝癌细胞的生长机制中起重要作用.     

靶向性沉默DNMT1基因对胰腺癌细胞DNA甲基化的影响

目的 观察DNA甲基转移酶1(DNMT1)基因沉默后对人胰腺癌PaTu8988细胞的DNMT活性及hMLH-1基因CpG岛DNA甲基化状态的影响.方法 由美国Ambion公司设计合成DNMT1siRNA和阴性对照siRNA,分别用15、30 nmol/L的浓度转染胰腺癌PaTu8988细胞,以未转染组细胞作为对照.应用实时PCR和蛋白质印迹法检测DNMT1 mRNA和蛋白的表达;用DNMT活性检测试剂盒检测其活性;用亚硫酸氢盐测序PCR(BSP)法检测hMLH-1基因CpG岛的甲基化状态;实时PCR法检测hMLH-1 mRNA的表达.结果 转染48 h后,DNMT1 siRNA15、30 nmol/L组细胞DNMT1 mRNA表达量分别为0.573±0.026和0.143±0.044,显著低于对照组的1.020±0.217及阴性siRNA 15、30 nmol/L组的0.900±0.475和0.938±0.327(P值均＜0.05);DNMT1 siRNA组的DNMT1蛋白表达亦低于对照组和阴性siRNA组.DNMT1 siRNA15、30 nmol/L组细胞DNMT活性分别为0.364±0.124和0.250±0.072,明显低于对照组的0.931±0.065及阴性siRNA 15、30 nmol/L组的0.665±0.055和0.472±0.040.DNMT活性与DNMT1 mRNA表达呈正相关(r=0.69,P＜0.01).DNMT1 RNA干扰后导致hMLH-1基因CpG位点的8个甲基化减少到1个甲基化.结论 DNMT1 siRNA能特异性抑制胰腺癌PaTu8988细胞DNMT1基因的表达,明显抑制DNMT的活性,并引起hMLH-1基因CpG岛去甲基化.     

双月安环己烷草酸铂对肝癌细胞DNA损伤修复基因表达影响及其机制

目的 初步明确肝癌细胞中特异性表达缺失的DNA损伤修复基因（GADD45β）近端启动子序列，并探索双月安环己烷草酸铂（Oxaliplatin）对人肝癌细胞HepG2中GADD45β基因表达影响及可能机制。方法 以30～50个碱基间隔体外人工合成GADD45β近端启动子序列（-547至-436），分别插入pGL3 basic荧光素表达质粒的荧光素基因上游，以电穿孔法转染HepG2，根据启动子活性强度结合TRANSFAC数据库分析可能存在的转录调节因子结合位点；以Northern印迹和实时荧光定量PCR比较Oxaliplatin作用前后HepG2细胞GADD4513表达，并在此基础上进一步比较Oxaliplatin对GADD45β启动子活性的诱导作用。结果 GADD45β近端启动子中含有E2F1（-470／-436）和核因子（NF）-κB（-547／-520）转录调节因子与启动子结合位点，并可能存在“抑制区”。Oxaliplatin能明显诱导HepG2中GADD45β表达，并呈剂量效应正相关关系，同时Oxaliplatin能相应诱导E2F-1启动子活性。结论 Oxaliplatin能明显诱导肝癌细胞中特异性缺失的GADD45β基因表达，增强转录调节因子E2F-1的表达水平是其可能的作用机制。     

丙型肝炎病毒F蛋白抑制肝癌细胞增殖功能的研究

目的 研究HCV F蛋白的生物学功能.方法 扩增目的基因片段,通过酶切连接方法将编码HCV F蛋白的基因片段克隆至载体pSEB-3Flag中,用构建好的重组质粒pSEB-3Flag-F转染Huh7、SMMC7721细胞,经Blasticidine抗性筛选,拟建立HCV F蛋白稳定表达的细胞株,用RT-PCR方法检测HCV-F基因的表达.通过MTS、细胞计数、结晶紫以及流式细胞检测实验观察F蛋白对转染细胞增殖和细胞周期的影响.计量资料分析采用t检验.结果 成功建立了HCV F基因稳定表达的细胞株Huh7-F和SMMC7721-F,MTS、细胞计数实验均证实Huh7-F和SMMC7721-F细胞较对照细胞增殖速度减慢,Huh7-F稳定细胞株结晶紫定量A值为1.072±0.070,对照组为1.387±0.005(t=-6.347,P＜0.05);SMMC7721-F稳定细胞株A值为1.594±0.007,对照组为1.921±0.090(t=-4.81,P＜0.05).流式细胞仪检测Huh7-F稳定细胞株48hS期细胞百分比分别为47.12％±0.04％,对照组S期细胞数为55.32％000±1.45％(t=-7.99,P＜0.05);SMMC7721-F稳定细胞株S期细胞百分比分别为30.75％±0.09％,对照组S期细胞数为33.23％±0.28％(t=-5.91,P＜0.05).结论 稳定转染HCV F基因可以明显抑制Huh7细胞、SMMC7721细胞的增殖.     

XRCC1在氧化应激诱导的DNA损伤及其修复过程中的作用及机制

<正>氧化应激诱导的DNA损伤可引起神经退行变、癌症和阿尔茨海默等疾病〔1〕。碱基切除修复(BER)是氧化应激引起的DNA损伤修复的主要形式,在BER和单链断裂修复通路中,X线修复交叉互补基因1(XRCC1)充当脚手架蛋白招募DNA修复蛋白参与DNA损伤位点的修复〔2〕。1 XRCC1的结构及其生物学特点XRCC1蛋白质分为三个功能域:(1)N末端功能域位于第     

大鼠局灶性脑缺血预处理后生长停滞与DNA损害可诱导基因34表达的变化

目的观察脑缺血预处理(brain ischemia preconditioning,BIP)对大鼠脑缺血再灌注后,生长停滞与DNA损害可诱导基因34(GADD34)mRNA及蛋白表达的影响。方法健康雄性SD大鼠120只,随机分为假手术组、脑缺血组、BIP组,每组40只,后2组行大脑中动脉栓塞法制模后,各组于再缺血后12 h、1、2和3 d 4个时间点观察,每个时间点10只。采用2次线栓法制备大鼠局灶性脑缺血预处理模型,用原位杂交法检测GADD34 mRNA表达,western blot法观察各组GADD34蛋白表达。结果与假手术组比较,脑缺血组12 h GADD34 mRNA及蛋白表达均达高峰,随再灌注时间延长,其表达逐渐下降,但1、2和3 d时仍高于假手术组(P<0.05,P<0.01);BIP组GADD34 mRNA及蛋白表达各时间点均较脑缺血组明显升高(P<0.05,P<0.01)。结论 BIP可诱导GADD34mRNA及蛋白的表达。     

乙型肝炎病毒X蛋白对HepG2细胞羧末端结合蛋白反应蛋白表达的影响

目的 研究乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)对博莱霉素诱导HepG2细胞DNA双链断裂(DSB)损伤修复关键因子羧末端结合蛋白反应蛋白(CtIp)的影响.方法 建立稳定表达HBx的HepG2肝癌细胞株(HepG2-HBx)及空质粒对照细胞株(HepG2-vec).用博莱霉素诱导细胞DSB损伤后,用流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡情况,用实时定量PCR及Western blot检测CtIP的mRNA与蛋白表达水平,并用激光共聚焦显微镜观察CtIp蛋白在细胞内的定位情况.多组数据采用单因素方差分析和SNK-q检验;两组数据间比较用t检验.结果 经检测转染HBx基因的HepG2细胞(HepG2-HBx)能稳定表达HBx.博莱霉素处理后,HepG2-HBx细胞与HepG2-vec细胞的凋亡比例分别为16.90%±0.89%和15.30%±0.86%,差异无统计学意义(q=2.074,P＞0.05),但死亡细胞比例分别为8.71%±0.74%和4.90%±0.46%,差异有统计学意义(q=7.126,P＜0.01) ;同时两种细胞株都出现了细胞周期G2/M期阻滞,差异有统计学意义(F=11.401,P＜0.05).HBx使CtIP蛋白表达水平和mRNA表达水平均下调,HepG2-HBx细胞与HepG2-vec细胞CtIp蛋白的相对表达量分别为0.66±0.04、0.73±0.05,差异有统计学意义(t=2.314,P＜0.05); CtIP mRNA相对表达量分别为1.00±0.06、1.23±0.08,差异有统计学意义(t=2.732,P＜0.05).同时观察到CtIP蛋白主要在细胞胞核内表达.结论 HBx能干扰肿瘤抑制蛋白CtIp的表达,可能影响细胞DSB损伤的修复.     

硝普钠诱导肝星状细胞HSC-T6凋亡及其机制

目的:探讨一氧化氮(nitric oxide,NO)供体硝普钠(sodium nitroprusside,SNP)在诱导肝星状细胞(hepatic stellate cell.HSC-T6)凋亡中的作用及其机制.方法:应用流式细胞仪和Hoechst 33258染色法检测HSC凋亡:激光扫描共聚焦显微镜检测荧光标记NF-kB p65的核转位:Real-time PCR方法检测基质金属蛋白酶抑制因子-1(tissue inhibitors of matrix metalloproteinase-1,TIMP-1)、Ⅰ型前胶原(Procollagen Ⅰ)、抗凋亡蛋白基因(growth arrest and DNA damage-inducible protein.GADD4513)mRNA表达.结果:SNP组HSC凋亡率较对照组显著增加(20.78%±5.91% vs 3.25%±1.26%,P=0.031),Hoeehst 33258染色法显示SNP组HSC细胞核呈致密浓染块状或颗粒状的荧光,提示细胞出现凋亡:SNP抑制TNF介导活化的HSC NF-kB p65核转位;随着其剂量不断增加,TIMP-1,Procollagen Ⅰ,GADD45β mRNA表达在随之减少(P<0.05).结论:SNP能诱导HSC凋亡,减少TIMP-1,Procollagen Ⅰ mRNA表达,其机制可能与通过抑制NF-kB活性,减少抗凋亡蛋白基因GADD45β mRNA表达有关.