联合化疗对膀胱癌细胞株BIU-87及其耐药亚株联合抑制作用的体外实验研究

实验采用微量细胞培养噻唑蓝显色法观察阿霉素（ADM）、足叶乙甙（VP－16）、丝裂霉素C（MMC）和羟基喜树碱（HCPT）等药物联合应用于膀胱癌细胞株BIU－87及其耐药亚株BIU－87／A、BIU－87／V，结果显示：HCPT与MMC、ADM联合应用对亲本及耐药细胞株都能取得较好抑制作用。联合用药能增强化疗药物对BIU－87细胞的毒性作用，并能克服耐药肿瘤细胞的多药耐药性。     

人膀胱癌BIU-87/ADM细胞中Bcl-2基因的原位表达

目的：探讨人膀胱癌多药耐药机制。方法：应用原位杂交和免疫细胞化学技术,分别对人膀胱癌耐药细胞株（ＢＩＵ－８７／ＡＤＭ）及敏感细胞株（ＢＩＵ－８７）中Ｂｃｌ－２基因及其产物的表达进行研究。结果：ＢＩＵ－８７／ＡＤＭ细胞Ｂｃｌ－２基因表达呈强阳性（＋＋）,ＢＩＵ－８７细胞呈弱阳性（＋）。结论：凋亡抑制基因Ｂｃｌ－２在人膀胱癌多药耐药细胞中的高表达,与人膀胱多药耐药的产生有关。     

原癌基因c-jun、c-fos与人膀胱癌耐药细胞株谷胱甘肽及其多药耐药基因表达的关系

目的　研究原癌基因c jun和c fos的表达对谷胱甘肽介导的膀胱癌多药耐药的影响。方法　应用定量逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)技术和蛋白免疫印迹法 (WesternBlotting) ,检测c jun、c fos基因在人膀胱癌细胞株BIU87及其阿霉素诱导的多药耐药亚株BIU87/A的表达 ,并分析其与两株细胞的GSH生物合成的限速酶———γ 谷氨酰半胱氨酸合成酶 (γ GCS)表达和细胞内谷胱甘肽 (GSH)水平的关系。同时还应用以上方法检测谷胱甘肽S 转移酶 π (GST π)和多药耐药相关蛋白 1(MRP1)在BIU87和BIU87/A的表达。结果　BIU87/A相对于BIU87具有多药耐药特性 ,其γ GCSmRNA的相对表达水平明显高于BIU87(1 341vs 0 95 3,P <0 0 5 ) ,与此相应 ,BIU87/A细胞内GSH水平也高于BIU87(P <0 0 1) ;c jun基因mRNA及其蛋白在BIU87/A的表达均高于BIU87,而c fos基因在BIU87和BIU87/A的表达未见明显差异 (P >0 0 5 ) ;GST π和MRP1在BIU87/A表现高表达。结论　原癌基因c jun过表达可上调BIU87/A细胞的GSH水平及其耐药相关基因的表达 ;c fos可能对BIU87/A的耐药形成并不起主要作用。     

肝癌细胞耐药诱导过程中过氧化物酶增殖物激活受体α的表达

目的研究阿霉素（adriamycin，ADM）诱导肝癌细胞（HepG2）耐药过程中过氧化物酶增殖物激活受体（PPARa）表达的变化及意义。方法通过梯度增加培养液中阿霉素的浓度，长期筛选培养，建立肝癌HepG2／ADM耐药细胞株。Western blot检测耐药细胞中多药耐药基因（MDRl）、PPARa蛋白的表达变化，RT-PCR检测耐药细胞中PPARa和CYP3A mRNA的表达变化。结果HepG2／ADM细胞是一个明确的多药耐药细胞模型，在耐药诱导过程中，MDR1表达上调，PPARa mRNA和蛋白的表达下降，CYP3AmRNA的表达也呈下降趋势。结论在耐药诱导过程中，PPARa表达的下降可能与HepG2细胞耐药的发生有关，其机制可能在于PPARa能影响MDR1和CYP3A的表达。     

ADM诱导人肝癌细胞株多重抗药性的形成

目的：建立人肝癌耐药细胞模型,研究其多药耐药机制。方法：对人肝癌细胞株BEL－7404采用阿霉素浓度递增法及高浓度间歇诱导法,建立人肝癌耐药细胞BEL－740／ADM,用MTT法检测其检测其耐药性,用免疫细胞化学法检测细胞p-糖蛋白（p-gp)及多药耐药相关蛋白（MRP）的表达,结果：用此方法建立的肝癌耐药细胞模型BEL－7404／ADM经MTT法检测其对阿霉素的IC50较亲本细胞BEL－7404增加100倍,并对多种抗癌药物产生交叉耐受性。细胞p-gp及MRP表达较亲本细胞有显著增加（P＜0．01）,p-pg阳性率为68．7％,MRP阳性率为53．5％,结论：BEL－7404／ADM是一个多药耐药模型,其多药耐药性与p-gp、MRP高度表达有关。     

人肝癌多药耐药细胞系BEL-7402/ADM的建立及耐药相关基因表达检测

目的：建立人肝癌多药耐药细胞系,研究其耐药特性及机制。 方法：应用人肝癌细胞株BEL-7402,采用阿霉素（ADM）大剂量间歇诱导法,建立多药耐药细胞系BEL-7402/ADM。相差显微镜观察细胞,用MTT法检测该耐药细胞株对多种化疗药物的多药耐药性,采用流式细胞术检测该耐药细胞表面多药耐药基因(MDR)的表达产物P糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白(MRP)及谷胱甘肽硫转移系统(GSH／GST)的表达情况,应用RT-PCR检测MDR、MRP基因表达水平。 结果：BEL-7402/ADM对多种抗癌药物产生耐药,对ADM的耐药性(半数抑制浓度,IC₅₀)提高了17.31倍。流式细胞仪分析发现（65.5±5.8）%的BEL-7402/ADM细胞表面P-gp 表达阳性,而对照细胞BEL-7402表达仅为（31.3±4.3）%;（32.4±3.5）%的BEL-7402/ADM细胞表面MRP表达阳性,而对照细胞BEL-7402表达仅为（23.4±3.1）%,二者差异有显著性(P<0.01);BEL-7402/ADM和BEL-7402细胞的GSH／GST表达无明显变化（P>0.05）。RT-PCR检测发现BEL-7402/ADM中MDR及MRP mRNA高表达。 结论：BEL-7402/ADM具有明确的多药耐药性,其多药耐药相关基因MDR及MRP mRNA表达升高。     

肿瘤坏死因子受体（TNFR）基因转移增强TNF对肿瘤细胞的杀伤作用

目的：探讨TNFR基因转移对肿瘤细胞表面TNFR表达量的影响，观察其对TNF杀伤膀胱肿瘤细胞作用的影响。方法：建立TNFR的逆转录病毒表达载体，通过转染包装细胞PA317产生完整病毒颗粒；膀胱癌BIU－87细胞经病毒感染后，检测细胞表面TNFR数量及TNF对其杀伤作用的变化。结果：TNFR基因转移前膀胱癌BIU－87细胞表面与TNF结合的位点数量平均为912个／细胞，经病毒感染后，细胞表面与TNF结合的位点数量平均为2872个／细胞（P＜0．05）；TNF对经病毒感染的BIU－87细胞的杀伤作用较未经病毒感染者有明显增强（P＜0．05）。结论：以逆转录病毒为载体的基因转移方法可以提高肿瘤细胞表面TNFR的表达量，从而增强TNF对肿瘤细胞的杀伤作用。     

原位杂交技术检测增殖细胞核抗原反义寡脱氧核苷酸对BIU—87细胞体外增殖的影响

运用原位杂交技术检测脂质体介导增殖细胞核抗原（PCNA）反义寡脱氧苷酸抑制人膀胱癌细胞BIU－87 PCNA mRNA的表达水平。结果表明脂质体介导PCNA反义寡脱氧核苷酸处理组中BIU－87细胞PCNA mRNA的表达水平明显低于对照组。结果提示脂质体介导PCNA反义寡脱氧核苷酸可抑制人膀胱癌细胞BIU－87体外增殖活性,其抑制作用可通过阻断PCNA蛋白表达来实现。     

基因芯片筛选经 NFE2 L2－RNAi 转染的乳腺癌耐药细胞差异表达基因 CDCA4

目的：应用基因芯片技术探讨Nrf2与乳腺癌化疗耐药可能相关的下游通路。方法选择人乳腺癌多柔比星耐药细胞株 MCF－7／ADM作为研究对象,经NFE2L2－RNAi成功转染,敲除NFE2L2目的基因,应用RT－PCR方法检测目的基因的表达情况,用人类表达谱芯片检测多柔比星耐药细胞株 MCF－7／ADM与敲除目的基因后的MCF－7／ADM基因表达谱的变化。结果通过比较,发现经NFE2L2－RNAi转染的人乳腺癌多柔比星耐药细胞株和人乳腺癌多柔比星耐药细胞株MCF－7／ADM的基因表达存在明显差异。人基因表达谱芯片中共筛选出差异有统计学意义的基因878个,包括表达上调的基因341个,表达下调的基因537个,其中CDCA4表达上调。通过edgeR分析软件,于TCGA公共数据库中,发现CDCA4在大量样本中乳腺癌组织的mRNA表达丰度显著高于癌旁组织。结论通过基因芯片筛出位于Nrf2下游的CDCA4,与乳腺癌细胞对多柔比星的耐药可能存在密切关系。     

膀胱癌耐药细胞株MDR_1基因表达水平的检测

为探讨膀胱癌耐药细胞亚系BIU-87PR的耐药机理，我们在体外用阿霉素诱导，建立了人膀胱癌耐药细胞株，应用MDR1cDNA探针检测了该细胞株MDR1基因的表达情况，RNA斑点杂交结果表明：膀胱癌亲代细胞株BIU-87为阴性，而BIU-87PR耐药细胞株呈阳性。因其杂交信号的强度明显低于小鼠肾组织MDR1mRNA的杂交强度，说明BIU-87细胞在阿霉素诱导下，MDR1基因有了低度表达。这将为指导腔内化疗的用药和提高疗效提供重要的理论依据。〔中华泌尿外科杂志，1994；15（2）：83〕膀胱癌耐药细胞株MDR_1基因表达水平的检测@赵军@鲁功成@关中宏…     

人膀胱癌BIU87细胞株中低氧诱导CD105表达

目的 研究人膀胱癌BIU87细胞株中低氧与常氧状态下CD105表达,为膀胱癌的抗血管治疗提供理论依据.方法 在人膀胱癌BIU87细胞株中用免疫组织化学检测常氧与低氧状态下CD105蛋白的表达.结果 人膀胱癌BIU87细胞株CD105蛋白在低氧组和常氧组阳性表达率分别为(90.4±8.2)％和(61.0±7.5)％.结论 人膀胱癌BIU87细胞株中低氧诱导CD105表达.     

人胶质瘤细胞的多药耐药性研究

目的：观察阿霉素、长春新碱和足叶乙苷及其联用异博定对人胶质瘤多药耐药细胞株U251／ADM的药物敏感性的影响。并研究药物作用与相关多药耐药基因（P—gP、MRP1和TOPO—Ⅱα）表达的关系。方法：MTT法检测药物敏感性，并计算各种药物的IC50用RT—PCR法分别检测U251／ADM细胞株的P—gp、MRP1和TOPO—Ⅱα基因在不同药物浓度作用下的表达情况。结果：异博定联用药物（药物组）后可显著降低阿霉素和长春新碱的IC50。药物组P—gp和MRP1基因的整体表达水平显著高于未加异博定的对照组，而药物组TOPO—Ⅱα基因的整体表达水平则显著低于对照组。结论：异博定对于提高部分化疗药物的敏感性具有一定作用；化疗药物的作用浓度与相关耐药基因表达密切相关。     

胃癌多药耐药基因的表达及其意义

目的：探讨5种多药耐药（MDR）基因在胃癌组织中的表达，建立MDR的基因诊断标准。方法：用逆转录－聚合酶链反应法（RT－PCR）及流式细胞术检测胃癌组织中5种MDR基因的mRNA和蛋白质的表达，用四氯唑蓝快速比色法（MTT）检测抗癌药物对胃癌原代细胞的IC50值。结果：胃癌组织mdr1,MRP，LRP和GSTp1mRNA表过增加，TopoⅡαmRNA表达最减少，5种MDR基因mRNA表达量之间无相关性；胃癌耐药涉及mdr1,MRP,LRP,GSTp1和TopoⅡα基因，mdr1mRNA≥0.4,MRP mRNA≥0.5,LRP mRNA≥0.9,GSTp1 mRNA≥0．8和TopoⅡmRNA≤0．3为耐药联合诊断标准，符合率为98．6％，结论：胃癌组织中存在5种MDR基因，分别介导不同的多药耐药现象，多重MDR是胃癌耐药的主要形成，用RT－PCR方法联合检测5种MDR基因mRNA表灰在胃癌化疗敏感性预测中具有必要性和可行性。     

腺病毒介导p53基因逆转乳腺癌耐药的实验研究

目的探讨腺病毒介导p53基因（Ad-p53）对人乳腺癌阿霉素（ADM）耐药细胞株MCF-7／ADM的耐药性及多药耐药基因1（MDR1）的影响。方法以Ad-p53转染MCF-7／ADM细胞株,流式细胞术检测p53蛋白变化;锥虫蓝活细胞拒染法观察细胞生长情况;MTT法观察MCF-7／ADM细胞对阿霉素耐药性的变化,实时荧光RT—PCR法检测MDR1 mRNA变化。结果流式细胞术观察到MCF-7／ADM细胞经MOI50的Ad-p53作用48h后,p53蛋白表达率由10．24％升高到36．20％;细胞抑制率为7．4％（P=0．003）;逆转MCF-7／ADM对ADM的耐药倍数11．6倍（P=0．001）;实时荧光RT-PCR检测结果显示MDR1 mRNA相对表达量由1．25±0．01下降至0．91±0．01（P=0．011）。结论腺病毒介导p53基因能抑制MCF-7／ADM细胞MDR1基因的表达,并能部分逆转MCF-7／ADM的耐药性,增加阿霉素化疗敏感性。     

膀胱癌多药耐药细胞株Pumc-91/ADM的建立及其生物学特性评价

目的 多药耐药(multidrug-resistance,MDR)是肿瘤治疗的主要障碍.为探讨体外肿瘤MDR的方法,本研究建立膀胱移行上皮癌多药耐药细胞株Pumc-91/ADM,并研究其生物学特性.方法 以人膀胱移行上皮癌细胞株Pumc-91为研究对象,应用阿霉素(ADM)浓度梯度递增法体外诱导建立人膀胱移行上皮细胞癌Pumc-91细胞的多药耐药细胞株Pumc-91/ADM.观察细胞的生长规律,用MTT法检测多药耐药性,流式细胞仪检测其生长周期及细胞内药物ADM荧光强度,反转录RT-PCR半定量检测耐药相关基因的mRNA表达量.结果 Pumc-91/ADM与亲本细胞Pumc-91相比其生长速度减慢,倍增期延长,细胞异型性明显,巨细胞增多.MTT法检测显示Pumc-91/ADM较Pumc-91细胞对ADM的耐受度提高了10倍,且对氨甲蝶呤、顺铂、表阿霉素、长春新碱均有不同程度的交叉耐药性.流式细胞术检测细胞内荧光强度Pumc-91/ADM较Pumc-91细胞明显降低,细胞周期中S期细胞减少,G1、G2期细胞增多.RT/PCR检测耐药相关基因结果显示耐药细胞株谷胱甘肽-S-转移酶基因表达明显高于亲本细胞.结论 耐药株Pumc-91/ADM具有典型的多药耐药特点,可以为膀胱癌的多药耐药研究提供一个较好的体外研究模型.     

人乳腺癌细胞株MCF-7、MCF-7／ADM细胞迁移能力的对比研究

目的探讨乳腺癌细胞化疗继发耐药后细胞迁移能力的变化,并筛选出相关基因。方法以MCF-7细胞株为亲本细胞,采用阿霉素（ADM）低浓度持续加量诱导法建立对ADM耐药的人乳腺癌细胞株MCF-7／ADM。应用ATP-TCA药物敏感检测法和×CELLligence／RT-CES实时细胞电子分析系统检测人乳腺癌细胞株MCF-7、MCF-7／ADM对多种化疗药物的耐药情况及细胞增殖能力。应用Transwell实验和xCELLligence／RT-CIM实时细胞电子分析系统检测人乳腺癌细胞株MCF-7、MCF-7／ADM的细胞迁移能力。应用比较基因组芯片筛选出人乳腺癌细胞株MCF-7、MCF-7／ADMDNA拷贝数4倍差异的基因。结果撤药培养150d后,MCF-7／ADM细胞较亲本细胞MCF-7的ADM耐药指数为72.9,对其他化疗药物无明显的交叉耐药性。MCF-7／ADM细胞迁移能力较MCF-7明显降低（P〈0．05）。MCF-7／ADM有12种基因DNA拷贝数是MCF-7的4倍,MCF-7有6种基因DNA拷贝数是MCF-7／ADM的4倍。结论乳腺癌细胞化疗继发耐药伴随细胞迁移能力明显降低,其相关基因的DNA拷贝数亦有明显差异。     

葡萄籽多酚对多药耐药的逆转作用及其机制

目的：探讨葡萄籽多酚(GSPs)逆转多药耐药的作用及其对多药耐药相关蛋白GSTπ、TopoⅡ α表达的影响。方法：以人乳腺癌MCF-7细胞及其耐药株MCF-7／ADR细胞作为实验对象，用MTT法观察GSPs对多药耐药的逆转作用，免疫细胞化学技术观察GSPs对GSTπ、TopoⅡα等多药耐药相关蛋白表达的影响。结果：GSPs在1．2、2．4mg／L浓度时对细胞无毒性作用，并且均能逆转MCF-7／ADR细胞的多药耐药性，逆转倍数分别为5．77和9．79倍；GSPs可使MCF-7／ADR细胞GSh表达下降，但对TopoⅡ α表达无影响。结论：体外试验证实GSPs具有多药耐药逆转作用，其机制可能与降低肿瘤细胞内GSTπ的表达有关，提示GSPs是一种潜在的肿瘤化疗增敏剂。     

人膀胱癌细胞多药耐药机理的研究

目前,有关细胞凋亡与膀胱癌多药耐药的研究乏见报道。我们试图从细胞凋亡的角度探讨人膀胱癌细胞药多耐药的发生机制。一、材料和方法１材料：（１）细胞株及细胞培养：人膀胱癌ＢＩＵ８７细胞株引自北京医科大学泌尿外科研究所。耐药细胞株ＢＩＵ８７／ＡＤＭ由我...     

汉防己甲素逆转白血病细胞株K562/A02耐药的机制

目的:研究汉防己甲素（TTD）对白血病细胞株K562/A02多药耐药(MDR)逆转的机理。方法：以白血病细胞系K562及其耐药细胞系K562/A02为TTD作用的靶细胞。细胞水平检测实验分5组（K562组、K562/A02组、K562+ADM组、K562/A02+ADM组和K562/A02+TTD+ADM组）,采用MTT法检测TTD对K562和K562/A02细胞的非细胞毒性剂量,流式细胞术检测细胞内阿霉素(ADM)的浓度,基因、酶学、蛋白水平检测实验分3组（K562组、K562/A02组和K562/A02+TTD组）,采用RT-PCR法检测mdr1 mRNA的表达,免疫细胞化学方法检测谷胱甘肽S转移酶π（GST-π）和拓扑异构酶Ⅱ（Topo Ⅱ）的表达水平,Western-blotting法检测P-糖蛋白（P-gp）和bcl-2表达。结果：1.562 5 mg•L^-1的TTD处理K562/A02细胞后,细胞内ADM的浓度较单用ADM组明显提高（P<0.01）;与空白对照组比较,K562/A02细胞内mdr1 mRNA/P-gp的表达量减少（P<0.01）;GST-π和TopoⅡ表达无明显变化;凋亡抑制基因bcl-2的表达量减少（P<0.01）。结论:TTD主要通过增加细胞内ADM浓度,下调mdr1/P-gp和bcl-2表达逆转耐药。     

甲诺孕酮和屈洛昔芬对K562／AO2细胞株多种耐药机制的调节(摘要)

研究甲诺孕酮 (NOM )和屈洛昔芬 (DRO)对K5 6 2 /AO2细胞株耐药基因mdrⅠ、谷胱甘肽S 转移酶 (GSTπ)、拓扑异构酶Ⅱα(TopoⅡα)和多药耐药相关蛋白 (MRP)的调节。 方法　应用细胞培养技术 ,采用MTT比色法、免疫组织化学、逆转录 聚合酶连反应和流式细胞术分析。结果　NOM和DRO均可明显提高K5 6 2 /AO2细胞株对阿霉素 (ADM)的敏感性 ,增加细胞内ADM和累量。可显著下调mdrⅠ、GSTπ的mRNA和蛋白表达 ,明显上调TopoⅡα基因表达。K5 6 2敏感株的GSTπ基因表达同样被抑制。都具有明显的时间依赖性。MRP基因表达的变化差异无统计学意义。结论　NOM和DRO可明显逆转K5 6 2 /AO2细胞株对ADM的耐药性。NOM与异搏定逆转强度相似 ;两药对mdrⅠ、GSTπ和TopoⅡα基因表达均有明显调节作用。调节呈时间依赖性。