高糖促进肾小球系膜细胞纤维连接蛋白合成的实验研究

目的 观察高糖状态下肾小球系膜细胞（GMC）增殖及纤维连接蛋白（FN）合成情况。方法 采用体外GMC培养,噻唑蓝（MTT）掺入法和细胞计数观察GMC增殖,用RT－PCR及双抗夹心ELISA方法检测FN的基因及蛋白质水平变化。结果 高糖对GMC增殖有抑制作用,对FN的合成呈浓度及作用时间依赖性增高。结论 高血糖在糖尿病肾病的发生发展过程中起重要作用。     

RGDS四肽对肝星状细胞增殖、胶原合成及FAK mRNA表达的影响

目的 研究精-甘-天冬-丝氨酸（RGDS）四肽对大鼠肝星状细胞（HSC）增殖和胶原合成的抑制作用以及对黏着斑激酶（FAK）的影响。方法 以不同剂量的RGDS干预纤维黏连蛋白（FN）刺激的HSC,通过甲苯胺蓝染色测定细胞黏附率,^3H-胸腺嘧啶（^3H-TdR）、^3H-脯氨酸（^3H-Pro）掺入法测定HSC增殖及胶原合成能力,RT-PCR检测FAKmRNA的变化。结果 与单纯FN组相比较,不同剂量（25mg/L、50mg／L和100mg／L）的RGDS作用于HSC48h及100mg／L的RGDS作用于HSC不同时间（12h、24h和48h）后,HSC的增殖明显受抑,胶原合成能力降低,同时FAK mRNA表达水平也下降。结论 RGDS能够抑制FN与HSC黏附,并抑制HSC增殖及胶原合成。FAK的下调可能是RGDS抑制HSC增殖及胶原合成的分子机制之一。     

肾康注射液对高糖培养系膜细胞肥大的影响

目的：观察肾康注射液对高糖培养系膜细胞肥大的影响.方法：将体外培养的大鼠肾小球系膜细胞分为空白对照组、甘露醇组、高糖组、高糖＋缬沙坦组及高糖＋肾康注射液高、中、低剂量组.应用流式细胞术观察细胞大小、周期分布,用[3H]胸腺嘧啶核苷（[3H]TdR）及[3H]亮氨酸（[3H]Leu）掺入法反映细胞DNA及蛋白质合成情况.结果：高糖组系膜细胞G1期比例增高,G2期、S期比例下降,蛋白质合成增加,DNA合成减少,细胞体积增大;肾康注射液组与高糖组比较,细胞周期分布趋于正常,蛋白质合成减少,DNA合成增加,细胞体积减小.结论：肾康注射液可抑制高糖培养系膜细胞的肥大反应.     

低氧对新生大鼠脾单个核细胞DNA合成及转化的影响

本研究用荧光法测定脾单个核细胞DNA合成及MTT比色法测定脾单个核细胞对ConA的增殖反应，观察模拟高原低氧对出生后14天大鼠上述两指标的影响，同时也观察交感神经和副交感神经的活动状态，以初步探讨低氧对上述两指标的作用是如何介导的。结果表明：5000m海拔高度低氧作用24h不抑制脾单个核细胞DNA合成及单个核细胞转化，而作用5天时则抑制脾单个核细胞DNA合成及单个核细胞转化，分别为对照组的56．6％（P＜0．01）和86．8％（P＜0．05）；7000m海拔高度低氧作用24h，DNA合成及单个核细胞转化均受抑制．分别为对照组的61．0％（P＜…     

BMP-7对高糖诱导近端肾小管上皮细胞外基质及NF-κB表达的影响

目的探讨骨形态发生蛋白7（BMP-7）对高糖诱导近端肾小管上皮细胞（HKc）表达细胞外基质及核转录因子-κB（NF-κB）的干预作用。方法采用人近端肾小管HKc细胞株,将细胞分为正常对照组（NG,5．5mmol／L葡萄糖）、高糖组（HG,25mmol／L葡萄糖）、HG＋100ng／ml BMP-7组、NG＋100ng／ml BMP-7组、高渗组（HM,25mmol／L甘露醇）。应用免疫细胞化学和ELISA技术检测细胞Ⅳ型胶原（Col Ⅳ）、纤维连接蛋白（FN）表达,用凝胶电泳迁移率竞争试验（EMSA）检测NF-κB的表达。结果高糖作用下NF-κB活性和Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白表达显著增高,加入100ng／ml BMP-7后可显著抑制NF-κB活性及Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白的表达。结论BMP-7可能通过抑制NF-κB活性而从转录水平抑制高糖诱导的近端小管细胞细胞外基质的过度表达。     

川芎嗪对Ang Ⅱ诱导的大鼠VSMCs增殖的干预作用

目的探讨不同浓度川芎嗪不同作用时间对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的血管平滑肌细胞（VSMCs）增殖的影响。方法建立AngⅡ诱导VSMCs增殖模型，用酶促反应定磷法观察不同浓度川芎嗪在不同作用时段对血管平滑肌细胞CaN活性的影响；应用免疫细胞化学法观察原癌基因c-fos和增殖细胞核抗原（PCNA）表达水平的变化。结果成功建立了AngⅡ诱导的VSMCs增殖模型，与对照组比较，AngⅡ组刺激后VSMCs增殖活度明显升高（P〈0.05）；川芎嗪各组CaN活性和c-fos及FCNA表达水平随川芎嗪的浓度和作用时间的延长而显著下降（P〈0.05）。结论AngⅡ能显著刺激大鼠血管平滑肌细胞增殖，川芎嗪能使血管平滑肌细胞中PCNA和原癌基因c-fos的表达减弱，其抑制细胞增殖的作用机制可能与其干预CaN依赖的信号转导途径有关，且在一定范围内呈剂量和时间依赖性。     

乙醛对大鼠HSC增殖以及胶原基因表达影响的实验研究

目的：研究乙醛对新分离的肝星状细胞（hepatic stelalate,cell,HSC）增殖、表达α1（Ⅰ）型胶原mRNA、IkB和NF-kB的影响，以探讨酒清性肝纤维化发病机理。方法：用链霉蛋白酶、胶原酶以及密度梯度分离培养大鼠肝星状细胞。采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法、原位杂交法、免疫细胞化学法、凝胶电泳迁移率法（EMSA）分别检测肝星状细胞的增殖、胶原合成、IkBα以及NF－kB的表达。结果：（1）成功分离出大鼠肝星状细胞。（2）乙模型刺激新分离培养的肝星状细胞后细胞明显增殖；乙醛刺激传一代肝星关细胞后，α1（Ⅰ）型胶原mRNA表达显著增加；IkBα表达明显下降；乙醛作用肝星状细胞后30min，NF－kB的表达即有增加，到120min时达最高值。结论：乙醛可以使静止的肝星状细胞活化，表现为增殖、α1（Ⅰ）型胶原mRNA合成、IkBα表达下降、NF-kB活性增加。     

肌卫星细胞体外培养及其对胰岛素样生长因子Ⅰ刺激的反应

目的原代分离、纯化、培养大鼠肌卫星细胞，观察体外培养肌卫星细胞的增殖与分化特性及对类胰岛素样生长因子Ⅰ（IGF-Ⅰ）刺激的反应。方法选用Wistar大鼠，切取双下肢及背部肌肉，两步酶消化法分离卫星细胞，不连续密度梯度离心法纯化后体外培养，观察其生长与分化特性，绘制生长曲线及融合率曲线，MTT法测定卫星细胞对不同浓度IGF-Ⅰ刺激的反应，并对其生长分数及融合率给予观察。结果此方法可以获得足量、纯度较高的肌卫星细胞。结论适宜浓度（100ng／ml）的IGF-Ⅰ对肌卫星细胞有较强的促增殖及促分化作用。     

醛固酮自分泌环在高糖致人系膜细胞损伤中的作用

目的研究高糖环境下人系膜细胞(HMC)中醛固酮自分泌环及活性氧(ROS)、癌胚纤连蛋白(FN)表达水平的变化,进一步探讨醛固酮自分泌环与ROS、癌胚FN mRNA表达的关系。方法常规培养HMC,取对数生长期细胞分为5组:正糖组(5mmol/L D-葡萄糖),渗透压对照组(5mmol/L D-葡萄糖+20mmol/L L-葡萄糖),正糖+依普利酮组(5mmol/L D-葡萄糖+10μmol/L依普利酮),高糖组(25mmol/L D-葡萄糖),高糖+依普利酮组(25mmol/L D-葡萄糖+10μmol/L依普利酮)。采用RT-PCR法检测醛固酮合酶(CYP11B2)、11β-羟基类固醇脱氢酶Ⅱ(11βHSD2)、癌胚FN mRNA表达水平,Western blotting检测CYP11B2蛋白表达水平,放射免疫法分析细胞培养液中醛固酮水平,通过激光共聚焦显微镜观察盐皮质激素受体(MR)蛋白表达及转位情况,荧光显微镜和荧光酶标仪检测细胞内ROS水平。结果与正糖组比较,高糖组HMC细胞CYP11B2 mRNA及蛋白表达上调,ROS和癌胚FN mRNA表达亦上调,培养液中醛固酮浓度升高(P<0.05)。高糖可促进MR蛋白发生核转位,定量分析显示高糖组胞质/胞核荧光强度比值较正糖组降低30%(P<0.05)。与高糖组比较,高糖+依普利酮组ROS及癌胚FN mRNA表达下调(P<0.05)。结论高糖负荷可通过激活HMC局部醛固酮自分泌环而导致HMC损伤。     

高糖抑制平滑肌细胞胶原合成参与糖尿病静脉病变发生

目的观察糖尿病大鼠大隐静脉（SV）的组织学改变,通过高糖处理静脉平滑肌细胞（SMCV）观察其活性及其Ⅰ型胶原（COL Ⅰ）、Ⅲ型胶原（COL Ⅲ）、基质金属蛋白酶2（MMP2）、基质金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP1)表达变化,探讨其表达异常的可能机制。 方法用链脲佐菌素（STZ）腹腔注射构建糖尿病大鼠模型,对其SV进行HE染色、Masson染色观察其组织形态改变;体外培养SMCV,分别给与高糖、正常糖浓度培养,CCK8法检测其活性,RT-qPCR法、Western Blot（WB）法分别检测其细胞内COLⅠ、COLⅢ、MMP2、TIMP1 mRNA及蛋白表达,ELISA法检测细胞外COL Ⅰ、COLⅢ的表达。 结果糖尿病大鼠SV管壁中膜变薄（P<0.05）、管腔面积增大（P>0.05）、胶原含量减少（P>0.05）。高糖刺激后SMCV细胞活性降低（P<0.05）,细胞内COLⅠ mRNA无明显变化,COLⅢ mRNA表达下降（P<0.05）,TIMP1 mRNA表达升高（P<0.05）,MMP2 mRNA表达下降（P<0.05）。此外,高糖刺激后细胞内COLⅠ蛋白表达显著降低,COLⅢ蛋白表达无明显差异,TIMP1表达下降,MMP2表达升高,细胞外COLⅠ蛋白表达显著降低（P<0.05）,COLⅢ表达降低但无统计学差异,COLⅠ/COLⅢ表达比例下降（P<0.05）。 结论本研究证实糖尿病下肢静脉中膜变薄,管腔增大,胶原减少。高糖可能是通过转录后机制调控MMP2/TIMP1水平,影响SMCV细胞COLⅠ/COLⅢ的表达,抑制其胶原合成,参与静脉病变的发生。     

二乙基二巯基氨基甲酸钠对大鼠皮肤成纤维细胞增殖及胶原蛋白合成的影响

目的：研究二乙基二巯基氨基甲酸钠（ＤＴＣ） 对大鼠皮肤成纤维细胞增殖及胶原蛋白合成的影响。方法：采用［３Ｈ］ － 胸腺嘧啶核苷和［３Ｈ］ － 脯氨酸掺入法,分别测定成纤维细胞增殖和胶原蛋白合成。结果：ＤＴＣ低剂量时促进成纤维细胞增殖,高剂量时抑制成纤维细胞的增殖和胶原蛋白合成。结论：ＤＴＣ能抑制胶原蛋白的合成,对成纤维细胞的增殖具有双向调节作用     

多抗甲素体外对小鼠LAK细胞活性的影响

目的:探讨多抗甲素(PA)能否增强LAK细胞增殖反应及LAK活性;方法:采用MTT方法测定小鼠脾淋细胞的增殖反应及LAK细胞杀伤S_(180)肉瘤及K_(562)人红白血病细胞的作用;结果:①亚适剂量IL—2(200U/ ml)和不同浓度PA共同诱导脾淋巴细胞,PA能明显增强淋巴细胞的增殖反应且呈剂量依赖性;②在较高浓度时,PA能明显增强LAK细胞杀伤S_(180)细胞作用,对于LAK细胞杀伤K_(562)细胞,无论浓度高低,PA均有明显增强作用;结论:在临床上可望将PA与LAK/IL—2联合应用,以提高其抗瘤效果,降低IL—2用量及毒副作用。     

miR-34a调控高糖环境中HK-2细胞增殖作用的初步研究

目的探讨miR-34a对高糖环境中HK-2细胞增殖作用的影响。方法以miR-34a模拟物和miR-34a抑制剂分别转染HK-2细胞,定量PCR检测miR-34a的表达变化,MTT检测细胞增殖活性;Western印迹检测周期相关蛋白CyclinD1和CyclinE的表达变化。生物信息学分析miR-34a的靶基因,对其中的增殖相关转录因子E2F3进行双荧光素酶验证。结果 miR-34a模拟物组miR-34a表达显著上调（P〈0.05）,miR-34a抑制剂组miR-34a显著下调（P〈0.05）。与对照组相比,miR-34a模拟物显著抑制高糖环境中HK-2细胞的增殖作用（P〈0.05）,CyclinD1和CyclinE表达下调（P〈0.05）,miR-34a抑制剂组显著上调高糖环境中HK-2细胞的增殖作用,CyclinD1和CyclinE表达上调（P〈0.05）。TargetScan在线分析软件显示,增殖相关转录因子E2F3可能是miR-34a潜在的靶基因,双荧光素酶分析结果显示E2F3是miR-34a的直接靶基因。结论 miR-34a可以调控高糖环境中HK-2的细胞增殖,其机制可能是通过直接抑制E2F3基因的表达而实现。     

高糖对外周血内皮祖细胞数量和功能的影响

目的　观察高糖对外周血内皮祖细胞(EPCs)数量和功能的影响。方法　密度梯度离心法获取外周血单个核细胞 ,培养 7天后 ,收集贴壁细胞并加入不同浓度葡萄糖使培养液终浓度分别为 1 5、2 5、35和 4 5mmol/L ,并干预一定时间 (6、1 2、2 4和 4 8h)。多波长激光共聚焦显微镜鉴定FITC UEA Ⅰ和DiI acLDL双染色细胞为正在分化的EPCs,流式细胞仪检测其表面标志进一步鉴定EPCs,倒置荧光显微镜下计数。然后 ,分别采用MTT比色法、改良的Boyden小室、黏附能力测定实验和体外血管生成试剂盒分别观察EPCs的增殖、迁移、黏附和体外血管生成能力。结果　高糖呈量效和时效地减少外周血EPCs数量 ,4 5mmol/L浓度高糖作用 2 4h对EPCs数量的影响最为显著 (较对照组减少了近 1 / 2 ,P <0 0 1 )。高糖也显著抑制外周血EPCs的黏附、迁移、增殖和体外血管生成能力。结论　高糖可减少EPCs数量、抑制其功能 ,并呈浓度和时间依赖性     

The effect of estrogen on ovine anterior cruciate ligament fibroblasts: cell proliferation and collagen synthesis

Estrogen has been implicated as a causal factor for anterior cruciate ligament injuries in women. Studies have demonstrated a decrease in anterior cruciate ligament fibroblast proliferation and collagen synthesis at supraphysiologic levels of estrogen in a rabbit model. HYPOTHESIS: The authors hypothesized that physiologic levels of estrogen would have no significant effect on anterior cruciate ligament fibroblast proliferation and collagen synthesis in an ovine model. METHODS: Anterior cruciate ligament fibroblasts were isolated from sheep knees using routine cell culture methods. The cells were exposed to 17beta-estradiol at physiologic concentrations of 2.2, 5, 15, 25, 250, and 2500 pg/ml. Cell proliferation was determined by cell counts on days 4 and 6. Collagen synthesis was determined by (3)H-proline incorporation on day 4. Immunohistochemistry was performed to detect estrogen receptors. RESULTS: Immunohistochemistry demonstrated the presence of estrogen receptors in ovine anterior cruciate ligament fibroblasts. There was no significant difference in anterior cruciate ligament fibroblast proliferation or collagen synthesis regardless of 17beta-estradiol concentration. CONCLUSIONS: Based on results of this study, and given the low turnover of collagen in ligaments, it is unlikely that a 2- to 3-day per month increase in circulating estrogen would result in rapid, clinically significant alterations in material properties of the anterior cruciate ligament in vivo. The etiology of noncontact anterior cruciate ligament injuries is complex and multifactorial in nature, meriting further investigation.     

大麻二酚对高糖诱导小鼠肾脏足细胞系MPC5细胞凋亡的保护作用

目的 探讨大麻二酚(cannabidiol,CBD)对高糖环境中小鼠足细胞系MPC5细胞凋亡的影响.方法 将MPC5细胞分为对照组(Vehicle)、高糖组(high glucose,HG)和CBD组.CCK-8试剂盒检测MPC5细胞的增殖活性,流式细胞术检测MPC5细胞的凋亡率,Western blot检测裂孔膜蛋白...     

Determinants of post-exercise glycogen synthesis during short-term recovery

The pattern of muscle glycogen synthesis following glycogen-depleting exercise occurs in two phases. Initially, there is a period of rapid synthesis of muscle glycogen that does not require the presence of insulin and lasts about 30-60 minutes. This rapid phase of muscle glycogen synthesis is characterised by an exercise-induced translocation of glucose transporter carrier protein-4 to the cell surface, leading to an increased permeability of the muscle membrane to glucose. Following this rapid phase of glycogen synthesis, muscle glycogen synthesis occurs at a much slower rate and this phase can last for several hours. Both muscle contraction and insulin have been shown to increase the activity of glycogen synthase, the rate-limiting enzyme in glycogen synthesis. Furthermore, it has been shown that muscle glycogen concentration is a potent regulator of glycogen synthase. Low muscle glycogen concentrations following exercise are associated with an increased rate of glucose transport and an increased capacity to convert glucose into glycogen.The highest muscle glycogen synthesis rates have been reported when large amounts of carbohydrate (1.0-1.85 g/kg/h) are consumed immediately post-exercise and at 15-60 minute intervals thereafter, for up to 5 hours post-exercise. When carbohydrate ingestion is delayed by several hours, this may lead to ~50% lower rates of muscle glycogen synthesis. The addition of certain amino acids and/or proteins to a carbohydrate supplement can increase muscle glycogen synthesis rates, most probably because of an enhanced insulin response. However, when carbohydrate intake is high (> or =1.2 g/kg/h) and provided at regular intervals, a further increase in insulin concentrations by additional supplementation of protein and/or amino acids does not further increase the rate of muscle glycogen synthesis. Thus, when carbohydrate intake is insufficient (<1.2 g/kg/h), the addition of certain amino acids and/or proteins may be beneficial for muscle glycogen synthesis. Furthermore, ingestion of insulinotropic protein and/or amino acid mixtures might stimulate post-exercise net muscle protein anabolism. Suggestions have been made that carbohydrate availability is the main limiting factor for glycogen synthesis. A large part of the ingested glucose that enters the bloodstream appears to be extracted by tissues other than the exercise muscle (i.e. liver, other muscle groups or fat tissue) and may therefore limit the amount of glucose available to maximise muscle glycogen synthesis rates. Furthermore, intestinal glucose absorption may also be a rate-limiting factor for muscle glycogen synthesis when large quantities (>1 g/min) of glucose are ingested following exercise.     

hBMP7基因转染对兔骨髓间充质干细胞增殖及胶原合成的影响

使用含hBMP7基因的重组逆转录病毒液感染兔骨髓间充质干细胞（BMSc）,MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞周期,^3H脯氨酸掺故法检测I型胶原合成和表达情况。结果显示,经hBMP7基因转染的BMSc与空载体转染及未转染的BMSc在细胞增殖、细胞周期表现方面无显著性差异,经转染的BMSc合成胶原显著高于空载体转染和未转染者。提示采用逆转录病毒介导转染BMSc后能促进细胞的胶原合成,对BMSc增殖和细胞周期无显著影响,有利于进一步 应用于构建组织工程化骨组织。