高通量筛选系统

本文简要介绍高通量筛选系统的基本概念及其在新药研究中的作用和发展现状 ,强调了基因组研究成果和发展新型筛选模型的密切关系 ,并对国内新药研究中的问题提出了个人见解     

高通量筛选技术在中药研究的应用

高通量筛选（high throughput screening,HTS）技术是将多种技术方法有机结合而形成的新的技术体系,它以分子水平和细胞水平的实验方法为基础,以微板形式作为实验工具载体,以自动化操作系统执行实验过程,以灵敏快速的检测仪器采集实验数据,以计算机对实验获得的数据进行分析处理,在同一时间内对数以千、万计的样品进行检测,并以相应的数据库支持整个技术体系的正常运转.该技术正逐渐地发展成为新药发现的重要手段.中医药（TCM）是中华民族在长期的生产、生活中逐渐积累沉淀下来的宝贵的财富,近几十年来,由于我国药学工作者的努力,在中药的研究方面有了比较大的进步,但是由于中药治疗中讲求辨证施治,具有量效关系复杂、多靶点等特征,使得中药很难摆脱粗、大、黑的禁锢,至今还有许多中药没有经过系统的研究,也还没有比较系统的中药研究方法.HTS技术由于其快速、高效、分析样本量大等特点,在寻找新的活性的化合物方面有非常大的优势,必将会在今后的中药研究中发挥重要作用.     

高通量细胞毒性筛选的研究进展

在药物发现过程中有必要进行毒性试验.随着被发现的先导化合物数量增多,面临着把毒性试验放在药物发现哪一阶段的问题.为节省时间和经费,毒性试验应尽早进行.但现有经典的毒性检测方法不适用于高通量筛选的需要,本文介绍现有毒性检测方法的缺陷以及高通量毒性筛选的技术进展.     

高通量筛选在中药研究中的应用

高通量筛选技术(High Throughput Screening,HTS)是中药研究的主要手段之一,近年来高通量筛选技术发展迅速,应用越来越广泛.本文主要介绍高通量筛选技术在中药研究领域中的应用及表现出的优势.     

利用有效成分组理论和高通量技术探索大复方白脉散药效物质基础

传统民族药物大复方药味多、成分复杂,药效物质基础难以阐释。为了解决民族药物大复方的研究难题,本课题组利用高通量制备技术建立全组分样品库,利用二苯基三硝基苯肼自由基清除、原代神经元缺糖缺氧/复供损伤保护等高通量药物筛选模型确定了白脉散抗脑卒中有效成分组（BMECG）,进而利用MCAO/R模型对BMECG的活性行了研究,旨在为创新药物开发提供关键资料。最后探讨了快速制备技术和高通量药物筛选技术对于大复方有效成分组研究的意义。本文的研究思路有助于推动民族大复方现代化,有助于促进具有自主知识产权创新药物的出现。     

药物高通量筛选分析技术

高通量筛选分析技术在药物研究中已有大量应用,除化合物的药理活性,还涉及药代动力学性质、不良反应等的检测分析.本文分类列述了一些近年在药物研究中应用的高通量筛选分析方法,对大多数方法的原理进行了简述.认为自动化技术、"同质"技术和报告基因技术等对实现高通量筛选分析具有重要意义.另外,对高通量筛选算法研究也进行了介绍.     

高通量筛选在抗病毒药物筛选中的应用

细胞和分子生物学的迅速发展为药物作用靶点研究提供了新的领域,大量分子细胞水平的药物筛选模型不断出现,并应用到药物筛选和研究中。多学科交叉使细胞分子水平筛选方法能实现自动化技术而形成高通量筛选(highthroughput screening,HTS)。HTS是以分子和细胞水平的实验方法为基     

小续命汤有效成分组对慢性脑缺血大鼠脑线粒体的保护作用

目的：观察小续命汤有效成分组对慢性缺血大鼠脑线粒体的作用,研究小续命汤有效成分组抗慢性脑缺血的作用机制。方法：采用双侧颈总动脉永久性结扎法建立慢性脑缺血大鼠模型。将造模成功大鼠分为慢性脑缺血模型组、银杏叶提取物组和低、中、高剂量小续命汤有效成分组,另取假手术大鼠设为对照组,每组6只。采用梯度离心法提取大鼠脑线粒体,Clark氧电极法测定新鲜线粒体的呼吸功能,吸光光度法测定线粒体肿胀度,罗丹明123染色检测线粒体膜电位,蛋白质印迹法检测线粒体凋亡情况。结果：与假手术组大鼠相比,慢性脑缺血大鼠脑线粒体呼吸功能显著降低,表现为磷氧比值和氧化磷酸化效率显著降低;慢性脑缺血大鼠脑线粒体膜电位显著下降,肿胀度显著增高,细胞色素c释放增加,Bcl-2/Bax比率下降。小续命汤有效成分组治疗可改善慢性脑缺血引起的大鼠脑线粒体损伤。结论：小续命汤有效成分组可显著改善慢性脑缺血导致的脑线粒体结构和功能的损伤,这可能是小续命汤抗慢性脑缺血作用的机制之一。     

黄嘌呤氧化酶抑制剂高通量筛选模型的建立及应用

目的 建立适用于高通量筛选的黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XO)抑制剂筛选模型,并以此模型进行XO抑制剂筛选.方法 建立XO活性的紫外检测法及其抑制剂体外高通量筛选模型,并用此筛选模型对71 760化合物与粗提物进行筛选.结果 通过对筛选条件优化,建立了可靠的筛选模型,并对71 760样品进行了初筛,发现27个活性化合物,命中率O.038%,其中17个有较好量-效关系.结论 建立了稳定灵敏的适用于高通量筛选的XO抑制剂体外筛选模型,并发现了一些具有较好活性的化合物.     

国家新药高通量筛选体系建成

~~国家新药高通量筛选体系建成$中医药在线网     

依达拉奉联合小续命汤治疗脑梗死临床观察

目的 观察依达拉奉联合小续命汤治疗脑梗死的疗效。方法 将110例脑梗死患者按照随机数字表法分成观察组和对照组,每组55例。对照组采用依达拉奉注射液静脉滴注与常规治疗（抗血小板聚集、营养支持、改善脑循环等）,观察组在对照组治疗基础上加用小续命汤水煎剂,每次口服200 mL,分早晚2次温服,两组均治疗15 d,观察患者治疗前后的日常生活能力（ability of daily living,ADL）评分、美国国立卫生院卒中量表（National Institute of Health Stroke Scale,NIHSS）评分、临床疗效及不良反应。结果 与治疗前比较,两组患者治疗后ADL、NIHSS评分均明显改善（P＜0.05）;治疗后两组患者ADL、NIHSS评分比较,差异有统计学意义（P＜0.05）;观察组疗效优于对照组（P＜0.05）。结论 依达拉奉联合小续命汤治疗脑梗死疗效显著,能有效改善患者脑缺血的症状。     

靶向G蛋白偶联受体的高通量药物筛选方法

G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptors,GPCR)是一类具有7次跨膜结构的膜蛋白。GPCR介导多种重要的生理功能,与很多疾病密切相关,是最重要的现代药物靶点家族。目前市场上有近50%的药物是以GPCR为靶点的。因此,GPCR分析方法和GPCR配体筛选方法的研究是当今世界新药研究的重点和热点。本文归纳介绍了近年来被广泛使用的GPCR药物发现方法,以及靶向GPCR高通量筛选技术的最新研究进展。     

条纹拟海牛中提取的四种新活性成分的抗真菌作用

目的：研究从条纹拟海牛中提取的4种羊毛甾烷型三萜皂苷类新化合物的体外抗真菌活性。方法 采用微量液基础释法研究从条纹拟海牛中提取的4种新活性成分对7种临床常见真菌的体外抗菌活性。结果：结果表明它们对7种实验真菌显示了不同的抗菌活性,尤其对白色念珠菌较有较强的抗菌活性,MIC80值为16μg/ml,对热带念珠菌也显示了较强的抗菌活性,MIC80值均为32μg/ml;同时4种化合物对红色毛癣菌,申克孢子丝菌,烟曲霉菌也显示了抗菌活性,其中对红色毛癣菌活性较强。结论：与现有抗真菌药化学结构不同的4种新化合物均具有较强的抗真菌活性。     

气血并治方有效组分配伍对平滑肌细胞增殖和血小板源生长因子及其受体基因表达的影响

目的:观察氧化低密度脂蛋白诱导血管内皮细胞损伤条件培养基及气血并治方有效组分芍药苷和总黄酮配伍(重量比为1∶2)对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖相关基因表达的影响。方法:将VSMCs正常培养液、氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)诱导血管内皮细胞损伤条件培养基、辛伐他汀加ox-LDL诱导血管内皮细胞损伤条件培养基、芍药苷和总黄酮配伍(高、中、低剂量)加ox-LDL诱导血管内皮细胞损伤条件培养基等分别作用于VSMCs,采用MTT染色法检测VSMCs生长活性,逆转录聚合酶链反应法测定血小板源生长因子BB(platelet-derived growth factor BB,PDGF-BB)和血小板源生长因子受体α(platelet derived growth factor receptor-α,PDGFR-α)基因的表达。结果:ox-LDL诱导血管内皮细胞损伤条件培养基作用于VSMCs后,与正常培养VSMCs比较,细胞生长活性明显增加(P<0.01),PDGF-BB和PDGFR-αmRNA表达增强。芍药苷和总黄酮配伍加ox-LDL诱导血管内皮细胞损伤条件培养基作用于VSMCs后,与ox-LDL诱导血管内皮细胞损伤条件培养基比较,细胞生长活性明显降低(P<0.01),PDGF-BB和PDGFR-αmRNA表达减弱。结论:气血并治方防治动脉粥样硬化的作用可能与方中有效组分芍药苷和总黄酮配伍抑制ox-LDL诱导血管内皮细胞损伤条件培养基引起的VSMCs增殖相关基因的表达有关。     

清脑宣窍方有效组分对缺血性脑中风大鼠血脑屏障上P-糖蛋白表达的影响

目的比较正常及缺血损伤时大鼠血脑屏障上转运蛋白中P-糖蛋白(P-gp)时征表达及清脑宣窍方有效组分对其表达的影响。方法线栓法制备缺血性脑中风大鼠模型,按照不同再灌注时间,模型组再分为0、0.51、、26、、122、4 h,采用免疫组织化学法观察正常组与模型组大鼠脑皮质及海马缺血区P-gp的表达。除假手术组外,缺血动物于术后1 d,随机分为模型组、清脑宣窍方有效组分高、中、低剂量组、维拉帕米组,并于造模后1～5 d灌胃给予相应药物。末次给药后,处死动物,取材,检测大鼠脑皮质及海马区P-gp的表达。结果免疫组织化学染色结果显示,正常组与模型组大鼠脑皮质及海马缺血区均可见P-gp阳性染色。免疫组化半定量分析表明,与正常组比较,不同再灌注时间模型组P-gp表达量均有显著性差异(P<0.05),皮质及海马缺血区P-gp表达量均降低;与模型组比较,清脑宣窍方有效组分各剂量组及维拉帕米组对缺血性脑中风大鼠脑皮质及海马区P-gp表达量明显降低(P<0.05)。结论在缺血性脑中风病理状态下,大鼠脑血脑屏障上转运蛋白P-gp存在一定的时征表达,而且从一定程度上反映了特定病理状态下由于蛋白表达的改变而引起的血脑屏障通透性的变化。清脑宣窍方有效组分对缺血性脑中风大鼠脑皮质及海马缺血区P-gp表达具有显著的抑制作用。     

口腔拭子在药物性耳聋基因检测中的应用

目的：探讨口腔黏膜上皮细胞基因组DNA在药物性耳聋基因A1555G及C1494T突变检测中的应用,寻求基因检测中更简单快捷并无损的样本来源。方法：采集97例来自温州特殊教育学校非综合征型耳聋学生的口腔拭子和外周血,分别提取基因组DNA,进行浓度与纯度的测定、基因扩增及产物测序,比较2种样本来源及2种方法提取的基因组DNA的浓度、纯度、扩增成功率,并将测序结果与人类线粒体DNA剑桥参考序列进行比对。结果：口腔拭子DNA的手工法提取浓度（42.5±41.7）ng/mL与试剂盒法DNA浓度（44.8±43.4）ng/mL差异无统计学意义（P〉0.05）;手工法DNA纯度（1.45±0.73）低于试剂盒法（1.87±0.87）,两组间差异有统计学意义（P〈0.05）;二者扩增成功率与外周血差异均无统计学意义（P〉0.05）;口腔拭子DNA的药物性耳聋基因扩增产物长短一致,测序结果完全相符,均显示A1555G突变阳性2例,阴性95例;C1494T突变97例均阴性。结论：无损性样本口腔拭子扩增成功率高,诊断结果可靠,可替代外周血作为药物性耳聋基因检测的DNA来源,具有一定的临床应用价值。     

A cell-based high-throughput screening assay for Farnesoid X receptor agonists

Objective To develop a high-throughput screening assay for Farnesoid X receptor （FXR） agonists based on mammalian one-hybrid system （a chimera receptor gene system） for the purpose of identifying new lead compounds for dyslipidaemia drug from the chemical library. Methods cDNA encoding the human FXR ligand binding domain （LBD） was amplified by RT-PCR from a human liver total mRNA and fused to the DNA binding domain （DBD） of yeast GAL4 of pBIND to construct a GAL4-FXR （LBD） chimera expression plasmid. Five copies of the GAL4 DNA binding site were synthesized and inserted into upstream of the SV40 promoter of pGL3-promoter vector to construct a reporter plasmid pG5-SV40 Luc. The assay was developed by transient co-transfection with pG5-SV40 Luc reporter plasmid and pBIND-FXR-LBD （189-472） chimera expression plasmid. Results After optimization, CDCA, a FXR natural agonist, could induce expression of the luciferase gene in a dose-dependent manner, and had a signal/noise ratio of 10 and Z＇ factor value of 0.65, Conclusion A stable and sensitive cell-based high-throughput screening model can be used in high-throughput screening for FXR agonists from the synthetic and natural compound library.     

BACE1抑制剂分子水平高通量筛选体系的建立

目的 建立体外分子水平β?鄄分泌酶（BACE1）抑制剂高通量筛选体系。方法 采用均相时间分辨荧光法（HTRF）,通过优化反应时间、酶浓度、检测仪器等实验条件,建立BACE1抑制剂高通量筛选体系,根据待测样品对BACE1活性抑制程度筛选其抑制剂。结果 采用HTRF法建立了BACE1抑制剂高通量筛选体系,其中反应时间确定为6 h、BACE1浓度为670 U/L,采用VICTOR3酶标仪测得信噪比为649.6,信背比为44.6,Z′因子为0.91,变异系数小于10%,并筛选到一系列IC₅₀小于10^-6 mol/L的化合物。结论 采用HTRF法建立的BACE1抑制剂筛选体系灵敏度高、特异性和稳定性好,可用于BACE1抑制剂的高通量筛选。